-1- MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) trồng ngắn ngày, có giá trị cao dinh dưỡng, kinh tế nguyên liệu cho cơng nghiệp, có tác dụng cải tạo đất bảo vệ môi trường Hiện nay, suất sản lượng đậu tương nước ta thấp, chất lượng hạt chưa cao mức độ ổn định giống, ảnh hưởng nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh tác động bất lợi khác từ ngoại cảnh Đậu tương số trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, Soybean mosaic virus – SMV gây bệnh khảm lá, Bean yellow mosaic virus – BYMV gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ, số virus gây bệnh khác Trong đó, SMV BYMV loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn đến đậu tương SMV BYMV lây nhiễm từ bệnh sang khoẻ rệp làm mơi giới virus truyền qua hạt Khi đậu tương bị bệnh, có phần xanh nhạt, đậm biến vàng xen kẽ, non bị biến dạng, đọt non xoăn lại, đốt thân co ngắn, chậm phát triển, số lượng biến dạng, sần sùi, có vị đắng thường lép Bệnh khảm SMV BYMV gây thiệt hại đáng kể suất, chất lượng sản lượng hạt đậu tương Năng suất đậu tương giảm tới 40% bị nhiễm virus trước hoa 91% hạt đậu thu có vết lốm đốm, chất lượng [87] Việc nhiễm lúc nhiều loại virus khác gây thiệt hại lớn suất chất lượng hạt [95] Hiện nay, sản xuất đậu tương chủ yếu dừng biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị bệnh khảm SMV BYMV Các biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh trồng, thu dọn tàn dư bệnh đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh Tuy nhiên, biện pháp thường có hiệu thấp tốn nhiều cơng sức Biện pháp có hiệu để phịng hai lồi SMV BYMV sử dụng giống đậu tương kháng bệnh, nguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên SMV BYMV hạn chế Chính -2- - 27 - hướng tiếp cận tạo đậu tương chuyển gen kháng virus quan tâm nghiên cứu, chuyển gen có nguồn gốc từ lồi virus gây bệnh theo nguyên lý kỹ thuật RNA interference (RNAi) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN RNAi xem kỹ thuật đại có hiệu ứng dụng để kháng lại loài virus gây bệnh thực vật Dựa nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã, số tác giả ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi chiến lược tạo chuyển gen kháng virus [3], [31], [98] LÒ THỊ MAI THU Xuất phát từ lý trên, lựa chọn tiến hành đề tài luận án là: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo đậu tương chuyển gen kháng bệnh” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung: Tạo dòng chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm đậu tương kỹ thuật RNAi 2.2 Mục tiêu cụ thể: (i) Xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm đậu tương Việt Nam; (ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV hai loài SMV BYMV; (iii) Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng SMV BYMV cao đối chứng không chuyển gen; (iv) Tạo đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CP TỪ SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập thông tin hệ gen gen CP SMV, thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen CP, tách dòng xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV Phân tích đa dạng trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn gen CP phân lập từ SMV Việt Nam số trình tự công bố Ngân hàng gen quốc tế 3.2 Phân tích tương đồng gen CP hệ gen SMV BYMV phân lập từ nhiều nguồn khác Xác định đoạn bảo thủ gen CP tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin gen CP TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Thái Nguyên - 2014 - 26 - -3- Công trình hồn thành Bộ mơn Di truyền học & Sinh học đại, Khoa Sinh– KTNN, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Ngun Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phịng DNA Ứng dụng, Viện Cơng nghệ Sinh học Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Chu Hoàng Hà 3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV hai loài SMV BYMV kỹ thuật Gateway Biến nạp vector chuyển gen mang đoạn gen CPi thiết kế vào A tumefaciens 3.4 Biến nạp cấu trúc RNAi vào thuốc Phân tích có mặt đoạn gen CPi hai lồi SMV BYMV thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR Đánh giá tính kháng SMV BYMV chuyển gen so với đối chứng không chuyển gen 3.5 Chuyển cấu trúc RNAi vào đậu tương thơng qua A tumefaciens Phân tích, xác định có mặt đoạn gen chuyển CPi đậu tương chuyển gen Những đóng góp luận án 4.1 Phân lập đoạn gen CP từ SMV dịng SL1 SL2 có kích thước 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid Hai trình tự đoạn gen CP SMV đăng ký Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103 Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 2: 4.2 Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng đơn lồi SMV khả kháng đồng thời hai loài SMV BYMV Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Họp Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2014 4.3 Tạo 19 dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng hai lồi SMV BYMV 4.4 Chuyển thành cơng cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 DT2008, thu dòng chuyển gen từ giống ĐT12 19 dòng chuyển gen từ giống DT2008 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Về khoa học Có thể tìm hiểu luận án Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên, Thư viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên Thư viện Quốc gia Việt Nam Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV kháng đồng thời hai loài SMV, BYMV để tạo thuốc chuyển gen có tính kháng SMV BYMV cao đối chứng không chuyển gen khẳng định sở khoa học tính hiệu biện pháp sử dụng gen có nguồn gốc từ -4- - 25 - lồi virus gây bệnh để chuyển vào trồng nhằm tạo trồng chuyển gen kháng virus theo ngun lý kỹ thuật RNAi CÁC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 5.2 Về thực tiễn Kết lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương tổn thương tái sinh thành công đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV BYMV cho thấy khả ứng dụng kỹ thuật chuyển gen kỹ thuật RNAi chọn tạo giống đậu tương Việt Nam Kết thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen CPi SMV BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo chuyển gen thuốc đậu tương khẳng định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi mở triển vọng ứng dụng thực tiễn chọn giống trồng Việt Nam Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, and Chu Hoang Mau (2014) Development of RNAi-Based Vector Aims at Creating Antiviral Soybean Plants in Vietnam International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), Vol 4, No 3, pp 208-211 Lò Thị Mai Thu, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2013) Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CP SMV BYMV Tạp chí sinh học 35 (3), tr 129-135 Lò Thị Mai Thu, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Chuyển gen qua nách mầm đậu tương nhờ vi khuẩn A Cấu trúc luận án: Luận án có 128 trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành chương, phần: Mở đầu trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu 35 trang, Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 trang, Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận 46 trang, Kết luận đề nghị trang; Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án trang; Tài liệu tham khảo 19 trang Luận án có 18 bảng, 40 hình tham khảo 182 tài liệu Lò Thị Mai Thu, Lê Hồng Trang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Nghiên cứu tạo đậu tương chuyển gen kháng soybean Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Lị Thị Mai Thu, Hồng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Luận án tham khảo tài liệu 26 tiếng Việt 155 tài liệu tiếng Anh để tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Bệnh khảm virus đậu tương, (2) Nghiên cứu chuyển gen đậu tương, (3) Kỹ thuật RNAi tạo chuyển gen kháng virus Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp toàn giới gây thiệt hại lớn đến suất chất lượng hạt SMV BYMV hai loài virus gây bệnh khảm khảm vàng đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ Potyviridae Cây đậu tương bị nhiễm đồng thời SMV BYMV triệu chứng khó phân biệt Nhiễm lúc nhiều loại virus khác dẫn tới suất đậu tương bị giảm từ 66% - 80% tumefaciens Tạp chí khoa học&Cơng nghệ- Đại học Thái Nguyên, 115 (01), tr 3-12 mosaic virus bean yellow mosaic virus Tạp chí khoa học&Cơng nghệ- Đại học Thái Nguyên, 115 (02), tr 111-115 Mậu (2014) Đặc điểm đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ Soybean Mosaic Virus Tạp chí sinh học 36 (1), tr Các trình tự gen đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Lo MT., Hoang H., Le VS., Chu HH., and Chu HM (2014) Soybean mosaic virus SMV gene for coat protein, isolate SL1 GenBank, Accession: HG965102 Lo MT., Hoang H., Le VS., Chu HH., and Chu HM (2014) Soybean mosaic virus SMV gene for coat protein, isolate SL2 GenBank, Accession: HG965103 - 24 - -5- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ SMV BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần protein nucleic acid Hệ gen SMV BYMV RNA sợi đơn dương (RNA (+)) Jayaram đtg (1992) lập đồ xác định trình tự nucleotide chủng SMV G2 G7 (Hình 1.2) KẾT LUẬN 1.1 Tách dòng xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV dịng SL1, SL2 Đoạn gen CP phân lập có 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid, số amino acid vùng poty-coat 208 Trình tự đoạn gen CP SMV dòng SL1 dòng SL2 đăng ký Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103 SMV dịng SL1, SL2 phân bố nhóm với hai dịng Trung Quốc 1.2 Phát triển thành cơng vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đồng thời hai loài SMV BYMV Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc RNAi 1.3 Tạo 26 dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi (SMV-BYMV)] có kết dương tính với phản ứng PCR, có 19/26 Gen CP gen đặc trưng Potyvirus, mã hóa protein vỏ (CP) chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi vùng đầu C Chức CP thể nhân lên, capsid hóa, di chuyển virus từ tế bào đến tế bào truyền virus rệp Sự phân loại thành viên nhóm Potyvirus dựa trình tự gen CP trình tự amino acid CP Gen CP SMV có kích thước 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm dài 804 nucleotide mã hóa 267 amino acid, vùng Poty-coat từ amino acid thứ 33 đến 264; BYMV, gen CP có kích thước 933 nucleotide, vùng mã hóa gồm 822 nucleotide, mã hóa 273 amino acid, vùng Poty-coat từ amino acid thứ 37 đến 272 dòng thuốc chuyển gen có khả kháng hồn tồn đồng thời SMV BYMV (chiếm 73,08%) 1.4 Đã chuyển thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 DT2008 Thu dòng đậu tương chuyển gen hệ T0 từ giống ĐT12 19 dòng chuyển gen từ giống DT2008 dương tính với phản ứng PCR, hiệu suất chuyển gen đạt 1,35% 2,24% ĐỀ NGHỊ 2.1 Cần tiếp tục chọn lọc, phân tích biểu tính kháng đơn lồi SMV Hình 1.2 Bản đồ hệ gen SMV dự đoán điểm cắt protease Bản đồ dựa sở trình tự gen SMV chủng G2 G7 theo Jayaram đtg, 1992 Các hộp khác đề cập đến gen khác vùng 'và 3' vùng chưa dịch mã (UTR) Các số gen đề cập đến vị trí amino acid cắt từ polyprotein số ngoặc đơn đề cập đến vị trí nucleotide cắt từ trình tự gen SMV G2 G7 CP tính kháng đồng thời hai loài SMV BYMV hệ đậu tương chuyển protein vỏ virus, CI protein hình trụ; HC-Pro thành phần trợ giúp protease; NIb gen T1 hệ phục vụ công tác chọn giống đậu tương kháng virus RNA polymerase phụ thuộc RNA; P1, P3, NIa protease; VPg protein liên kết 2.2 Nghiên cứu thiết kế cấu trúc RNAi chứa đồng thời hai vài gen SMV, BYMV để tăng hiệu kháng virus đậu tương chuyển gen Chuyển gen biện pháp cơng nghệ ứng dụng để tạo dịng đậu tương kháng virus Cho đến nay, phương pháp chuyển gen trực tiếp súng bắn gen chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens ứng dụng phổ biến thành công đậu tương Kể từ giống đậu tương chuyển gen phương pháp gián tiếp thông qua A tumefaciens lây -6- - 23 - nhiễm vào nách mầm tổn thương nuôi cấy in vitro vào năm 1988, đến phương pháp chuyển gen sử dụng, nghiên cứu 500bp ứng dụng phổ biến đậu tương đạt thành tựu đáng khích lệ Virus gây bệnh đậu tương đa dạng chủng loại, chủ yếu 500bp virus RNA Các virus thường có phổ gây bệnh rộng, có lồi gây hại tới 900 loại thực vật khác với biểu bệnh phức tạp, khó nhận biết Ứng dụng kỹ thuật RNAi cách sử dụng nguồn gen Hình 3.31 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu trúc CPi (SMV-BYMV) dòng đậu tương chuyển gen giống DT2008 (-): Đối chứng âm; 1-32: 32 dòng đậu tương DT2008 chuyển gen virus gây bệnh chuyển vào trồng, nhà khoa học thành công M: Marker 50 bp (Thermo Scientific) việc tạo trồng chuyển gen kháng virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã Cũng phương pháp chuyển gen qua nách mầm hạt chín đậu tương nhờ A tumeffaciens, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu tương DT84 với hiệu suất 0,24%; Nguyễn Thu Hiền (2011) biến nạp cấu trúc chứa đoạn gen HA1 virus H5N1 vào 650 mẫu mầm giống đậu tương ĐT12 với hiệu suất chuyển gen 1,23% Trong nghiên cứu chúng tôi, hiệu suất chuyển gen với cấu trúc RNAi (pK7GW –CPi (SMV-BYMV) giống ĐT12 1,35%, giống DT2008 2,24% Như thấy hiệu suất chuyển gen đậu tương không phụ thuộc vào khả tiếp nhận gen kiểu gen đậu tương, mà phụ thuộc vào đặc điểm cấu trúc gen chuyển vào đậu tương Bệnh virus đậu tương có triệu chứng khó phân biệt, đậu tương nhiễm đồng thời nhiều loại virus, SMV gây bệnh khảm, BYMV gây bệnh khảm vàng, virus gây bệnh xoăn lá…Hai loài virus SMV BYMV gây bệnh khảm đậu tương chọn làm đối tượng để nghiên cứu tạo chuyển gen theo nguyên lý kỹ thuật RNAi Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi (SMVBYMV) thiết kế chuyển vào thuốc đậu tương Đánh giá tính kháng SMV BYMV 26 dòng thuốc chuyển gen thu tỷ lệ kháng cao (73,08%) Những kết chứng minh tính hiệu chiến lược ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo chuyển gen kháng virus sở cho việc xác định tính khả thi nghiên cứu tạo đậu tương chuyển gen kháng đồng thời hai loại virus SMV BYMV Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, thiết bị, hóa chất địa điểm nghiên cứu Mẫu nghi nhiễm bệnh SMV BYMV thu từ số địa phương sử dụng thí nghiệm phân lập gen CP từ SMV Sử dụng giống thuốc Nicotiana tabacum C9-1 hai giống đậu tương ĐT12, DT2008 để thử nghiệm chuyển gen kháng SMV BYMV Phịng Cơng nghệ tế bào, Viện Cơng nghệ sinh học Nguồn virus SMV BYMV sử dụng lây nhiễm nhân tạo viện Bảo vệ thực vật cung cấp Vector tách dòng pBT pENTRTM/D-TOPO, vector chuyển gen pK7GWIWG2(II); Các chủng vi khuẩn E coli DH5α; E coli One Shot® Top 10 A tumefaciens CV58 pGV 2660 dùng phân lập gen, thiết kế vector chuyển gen chuyển gen Hóa chất mua hãng tiếng giới; thí nghiệm tiến hành trang thiết bị Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học Phịng thí nghiệm Cơng nghệ gen, Phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên - 22 - -7- Bảng 3.10 Kết chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 DT2008 nhờ A tumefaciens qua nách mầm Giống Lơ thí nghiệm Số chồi kéo dài 10 150 48 17 16 12 Số Số Số Số Hiệu chồi trồng sống dương suất rễ giá tính với chuyển thể giá thể PCR gen (%) 120 37 13 10 Tổng 370 112 40 31 24 16 Tổng 250 180 220 200 850 130 75 103 95 403 50 28 45 41 164 30 19 29 27 105 26 16 25 23 90 10 32 Luận án sử dụng nhóm phương pháp nghiên cứu như: (1) phân lập gen, (2) thiết kế vector chuyển gen, (3) chuyển gen, (4) phân tích chuyển gen (4) phân tích, xử lý số liệu Các thí nghiệm tiến hành theo sơ đồ tổng qt mơ tả hình 2.3 10 DT2008 Số mẫu tạo chồi 27 ĐT12 Số mẫu biến nạp 100 2.2 Phương pháp nghiên cứu 1,35 MẪU LÁ ĐẬU TƯƠNG NHIỄM SMV PHÂN LẬP GEN ĐOẠN GEN CP TỪ SMV 19 Phân tích gen CP BASLT NCBI 2,24 THIẾT KẾ ĐOẠN BẢO THỦ CPi-SMV VÀ CPi (SMV-BYMV) Kỹ thuật GATEWAY THIẾT KẾ VECTOR RNAi CHỨA ĐOẠN BẢO THỦ CPi (SMV-BYMV) 3.4.2 Phân tích dòng đậu tương chuyển gen hệ T0 Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPiR từ DNA hệ gen để kiểm tra có mặt gen chuyển dịng đậu tương chuyển gen, kết PCR nhân đoạn gen CPi (SMV-BYMV) có kích thước 573 bp từ DNA tổng số 16 dòng chuyển gen từ giống ĐT12 nhận dịng dương tính với PCR (T12-3, T12-10, T12-11, T12-12 T12-16) (Hình 3.30), với hiệu suất chuyển gen 1,35% Thông qua A tumefaciens CHUYỂN CẤU TRÚC CPi (SMV-BYMV) VÀO CÂY THUỐC LÁ C9-1 CHUYỂN CẤU TRÚC CPi (SMV-BYMV) VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12, DT2008 Phân tích đoạn CPi (SMV-BYMV PCR Xác định có mặt đoạn CPi (SMV-BYMV) Đánh giá tính kháng SMV BYMV Cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi (SMV-BYMV)] 500 bp  Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tổng qt 2.2.1 Nhóm phương pháp phân lập gen Hình 3.30 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu trúc CPi (SMV-BYMV) dòng đậu tương chuyển gen giống ĐT12 1-16: 16 dòng đậu tương ĐT12 chuyển gen; M: Marker 50 bp (Thermo Scientific) Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen CPi (SMV-BYMV) với cặp mồi đặc hiệu từ DNA tổng số 32 dòng đậu tương chuyển gen giống DT2008 nhận 19 dòng dương tính với PCR (T08-1, T08-4, T08-5, T08-6, T08-7, T08-8, T08-9, T08-13, T08-14, T0815, T08-16, T08-17, T08-22, T08-24, T08-25, T08-26, T08-27, T08-29, T08-30) (Hình 3.34), với hiệu suất chuyển gen 2,24% Thu thập mẫu bệnh tách chiết RNA tổng số từ mẫu đậu tương nghi nhiễm SMV: i) Thu thập bảo quản mẫu đậu tương nghi nhiễm SMV, BYMV; ii) Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu nghi nhiễm SMV Phương pháp tổng hợp cDNA, nhân đoạn cDNA gen CP từ SMV PCR Kỹ thuật tách dòng gen xác định trình tự nucleotide: i) Tinh sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT, iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α; iv) Chọn dòng -8- khuẩn lạc colony-PCR, v) Tách chiết plasmid, vi) Xác định phân tích trình tự nucleotide 2.2.2 Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CP SMV BYMV thiết kế theo mơ hình ihpRNA kỹ thuật Gateway (Invitrogen) Các bước kỹ thuật theo Karimi đtg (2002), bao gồm: (1) Thiết kế tổng hợp nhân tạo đoạn gen CPi (SMV-BYMV) SMV BYMV) khuếch đại đoạn CPi(SMV-BYMV), (2) Lai ghép đoạn CPi (SMV-BYMV) với vector pETRTM/D-TOPO® (3) Thực phản ứng LR để trao đổi đoạn CPi (SMV-BYMV) từ vector pENTRTM/DTOPO® sang vector pK7GWIWG(II) (Hình 2.4) - 21 - Thí nghiệm chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) giống đậu tương ĐT12 lần biến nạp 370 mẫu thu 112 mẫu tạo chồi có 40 chồi kéo dài môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, 31 chồi rễ, đem trồng 24 giá thể nhận 16 T0 sống phát triển giá thể Đối với giống đậu tương DT2008 với 850 mẫu lần biến nạp thu 403 mẫu tạo chồi, chọn 164 chồi kéo dài môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, 105 chồi rễ, mang 90 trồng giá thể nhận 32 T0 sinh trưởng phát triển giá thể (Bảng 3.10) Nách mầm A Hình 2.4 Sơ đồ mô tả bước thiết kế vector mang cấu trúc RNAi kỹ thuật Gateway B E C D G H Hình 3.28 Tạo đậu tương chuyển gen từ giống DT2008 kỹ thuật lây nhiễm A tumefaciens tái tổ hợp qua nách mầm hạt chín 2.2.3 Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens Biến nạp pK7GW/SMV-BYMV-CPi vào tế bào A tumefaciens CV58C1 pGV2260 xung điện Chuyển cấu trúc RNAi mang vùng gen CPi (SMV-BYMV) vào thuốc Nicotiana tabacum C9-1 thông qua vi khuẩn A Tumefaciens Chuyển vector chứa cấu trúc RNAi mang đoạn gen CPi (SMV-BYMV) vào giống đậu tương ĐT12 DT2008 thông qua vi khuẩn A tumefaciens A – Nách mầm hạt chín; B - Gây tổn thương nách mầm dịch khuẩn lây nhiễm 30 – 40 phút; C - Đồng nuôi cấy CCM điều kiện tối ngày; D - Cảm ứng tạo đa chồi SIM lần tuần (bổ sung BAP mg/l + kanam ycin 50 mg/l); E - Cắt bỏ mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM tuần (bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l); G - Ra rễ môi trường RM (bổ sung IBA 0,1 mg/l) 20 ngày; H - Ra (giá thể trấu hun : cát vàng) - 20 - -9- khảm xoăn, còi cọc sinh trưởng Trong đó, dịng Phương pháp xác định hiệu suất chuyển gen: Mỗi mẫu biến nạp mảnh mầm tái sinh chồi từ nách mầm qua hai lần chọn lọc kháng sinh Các chồi sống sót sau chọn lọc chuyển sang mơi trường rễ đưa trồng giá thể Số sống giá thể mẫu biến nạp dương tính với PCR lập thành dịng chuyển gen Hiệu suất chuyển gen tính theo cơng thức: kháng hồn tồn sinh trưởng phát triển bình thường, xanh tốt Các giống thuốc K326 Longjiang 911 chuyển cấu trúc mang gen CP TMV theo chế RNAi thơng qua Agrobacterium tumefaciens có khả kháng TMV tương ứng 83% 90% (Yan đtg, 2007) Zhang đtg (2012) đề cập đến thiết kế cấu trúc RNA kẹp tóc chứa đoạn lặp lại đảo chiều cDNA CP virus Y khoai tây (PVY) chuyển vào thuốc lá, khả kháng PVY dòng thuốc chuyển gen 83,54%… Ở Việt Nam, thành công ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo chuyển gen kháng virus cơng trình nghiên cứu tạo dịng thuốc chuyển gen có khả kháng CMV 70,9%, kháng PVY 84,1%, kháng TMV 74,5% khả kháng đồng thời hai loại virus Số dịng chuyển gen dương tính với PCR Hiệu suất chuyển gen = 100(%) Tổng số mẫu biến nạp 2.3.4 Nhóm phương pháp phân tích chuyển gen Kiểm tra có mặt gen chuyển kỹ thuật PCR Phân tích, đánh giá khả kháng SMV BYMV phương pháp lây nhiễm nhân tạo TMV CMV lên tới 70,8% Trong nghiên cứu đoạn gen CPi hai loại SMV BYMV sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) chuyển vào thuốc thu kết Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP CỦA SMV khả quan, với 73,08% dòng chuyển gen kháng hồn tồn SMV BYMV, thuộc nhóm chuyển gen có tính kháng cao virus Chúng tơi đồng tình với quan điểm Kumar Sarin (2013) cho rằng, việc sử dụng can thiệp kỹ thuật RNAi cung cấp cách tiếp cận thân thiện với môi trường để tạo trồng kháng virus côn trùng, mà khó có kỹ thuật thay 3.4 KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG CẤU TRÚC RNAi 3.4.1 Kết chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào đậu tương Tiến hành chuyển cấu trúc vector CPi (SMV-BYMV) vào mô đậu tương hai giống ĐT12 DT2008 thông qua vi khuẩn A tumefaciens kỹ thuật lây nhiễm qua nách mầm hạt chín theo quy trình chuyển gen đậu tương tối ưu (Hình 3.28) 3.1.1 Tách dịng xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP từ SMV Kết so sánh 96 trình tự gen CP SMV BLAST NCBI cho thấy trình tự gen CP GenBank có độ tương đồng từ 94% đến 100% kích thước vùng tương đồng xác định có số lượng 700 nucleotide Từ kết so sánh xác định vùng tương đồng trình tự gen CP dựa vào trình tự gen CP có mã số X63771 GenBank thiết kế cặp mồi PCR SMVcp-F/SMVcp-R để nhân đoạn tương đồng gen CP dự tính có kích thước 720 nucleotide RNA tổng số tách chiết từ đậu tương, tiến hành phản ứng phiên mã ngược để tạo cDNA tiến hành phản ứng PCR Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CP thực kiểm tra phương pháp điện di gel argarose nhận băng DNA đặc hiệu với kích thước khoảng 0,7kb, với kích thước dự đoán thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.1) - 10 - - 19 - Sản phẩm PCR tách khỏi gel tinh gắn trực tiếp vào vector tách dịng pBT sau biến nạp vào tế bào E coli DH5 Tiến Hình 3.27 Hình thái số dịng thuốc chuyển gen đối chứng không chuyển gen hành chọn dòng phản ứng colony-PCR, kết điện di cho thấy sản phẩm colony-PCR xuất băng DNA có kích thước khoảng 0,7kb (Hình 3.2) Kết giải trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen CP phân lập từ SMV dòng SL1 SL2 gây bệnh khảm đậu tương thu Sơn La có 720 nucleotide Khi so sánh với trình tự đoạn gen CP Ngân hàng gen quốc tế có mã số X63771 (trình tự sử dụng để thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen CP) BLAST NCBI cho thấy đoạn gen CP (cDNA) mà phân lập từ SMV dịng SL1 có độ tương đồng 100%, cịn trình tự đoạn gen CP phân lập từ dịng SL2 có độ tương đồng 99,3%, hai trình tự đoạn gen CP dịng SL1 SL2 có độ tương đồng 99,3% Như kết luận trình tự cDNA mà chúng tơi phân lập đoạn gen CP mã hóa protein CP SMV dòng SL1 SL2 M M  1kb  0,7kb Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn gen CP (cDNA) SMV (1, 2: SL1, SL2; M: Thang DNA chuẩn kb)  0,7kb Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc (M: thang DNA chuẩn kb; 1, 2, 3- Gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc) dòng SL1; 4, 5, 6: Gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc dòng SL2) 3.1.2 Phân tích đa dạng trình tự gen CP dòng SMV Tiến hành so sánh trình tự nucleotide đoạn gen CP SMV dịng SL1 SL2 (Việt Nam) với 18 trình tự gen CP cơng bố GenBank (8 dịng Nhật Bản, dòng Hàn Quốc, dòng Mỹ, dòng Trung Quốc, dòng A A Dòng chuyển gen T0-5 kháng virus; B: Dòng chuyển gen T0-12 nhiễm nhẹ virus; C: Dòng chuyển gen T0-9 nhiễm nặng virus; D: Cây đối chứng không chuyển gen B C D nhiễm nặng virus Kết đánh giá tính kháng bệnh virus khảm 26 dòng thuốc chuyển gen 10 đối chứng trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết lây nhiễm nhân tạo khả kháng SMV, BYMV dòng thuốc chuyển gen T0 đối chứng không chuyển gen Lần Các dòng chuyển gen lây Số Số Số Tỷ lệ nhiễm kháng kháng lây hoàn biểu (%) nhiễm toàn bệnh 26 22 (++) 84,62 22 22 100 22 19 (+) Tổng 26 19 Đối chứng không chuyển gen Số Số Số Tỷ lệ kháng biểu kháng hoàn nhiễm (%) lây toàn bệnh nặng nhiễm 10 (+++) 30,33 86,36 0 73,08 (+++) 10 10 Ghi chú: (+); (++); (+++) mức độ biểu bệnh nhẹ, trung bình nặng Kết thống kê bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ kháng hoàn toàn dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) cao (19 kháng/26 lây nhiễm), tương ứng với 73,08%) Những đối chứng dòng chuyển gen nhiễm bệnh biểu có bị - 18 - - 11 - sản phẩm DNA điện di cho kết DNA đảm bảo chất lượng cho phản ứng PCR Tiến hành kiểm tra có mặt cấu trúc CPi (SMV-BYMV) phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn CPi (SMV-BYMV) cho thấy đoạn DNA thu có kích thước 573 bp tất 26 dòng thuốc (Hình 3.28) Kích thước hồn tồn phù hợp với kích thước cấu trúc CPi (SMV-BYMV) Vì vậy, khẳng định cấu trúc pK7GW-CPi (SMVBYMV) chuyển thành công vào thuốc giống C9-1 Canada, dịng Ucraina), sơ đồ hình thiết lập (Hình 3.6) cho thấy 20 dòng virus phân bố nhóm (I, II, III, IV) với khoảng cách di truyền 4,8%; dịng SL1, SL2 (Việt Nam) hai dịng có mã số X63771, U25673 (Trung Quốc) phân bố nhóm (Nhóm II) với hệ số tương đồng khoảng 99% Hình 3.6 Sơ đồ hình I mối quan hệ di truyền dòng SMV thiết lập dựa II trình tự đoạn gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn III Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina (SL1- dòng SL1; SL2- dịng IV SL1; 18 dịng SMV có mã số GenBank) Hình 3.28 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định có mặt cấu trúc CPi (SMV-BYMV) dòng thuốc chuyển gen 1-26: 26 dòng thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dương plasmid pK7GW-CPi (SMVBYMV; (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ thuốc không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) 3.3.2.2 Kết đánh giá khả kháng SMV BYMV dòng thuốc chuyển gen điều kiện lây nhiễm nhân tạo Kiểm tra tính kháng đồng thời hai lồi SMV BYMV 26 dịng thuốc chuyển gen dương tính với PCR 10 dịng đối chứng khơng chuyển gen lây nhiễm nhân tạo với SMV BYMV dịch chứa virus qua ba lần, lần cách 15 ngày Sau lần lây nhiễm, dòng thuốc quan sát biểu virus cảm quan Hình 3.27 thể hình thái thuốc kháng bệnh, nhiễm bệnh dòng chuyển gen đối chứng khơng chuyển gen Tiếp tục phân tích mối quan hệ dựa trình tự amino acid suy diễn cho thấy 20 dòng SMV chia làm hai nhánh, nhánh thứ có dịng – nhóm V (AAV48873) nhánh thứ hai có 19 dịng cịn lại (Nhóm I, II, III, IV) với khoảng cách di truyền 7,1% Hai dòng SL1, SL2 (Việt Nam) hai dòng Trung Quốc có quan hệ gần nhau, phân bố nhóm I Khoảng cách di truyền tính sở so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen CP 20 dịng SMV 4,8% (Hình 3.6), cịn dựa trình tự amino acid khoảng cách di truyền 20 dòng SMV lại lớn nhiều, 7,1% Kết phân tích phù hợp với nhận xét cho Potyvirus lây nhiễm họ đậu lồi thực vật khác có biểu đa dạng đặc tính sinh học đa dạng trình tự nucleotide nucleic acid Để phân biệt lồi, chủng virus tiến hành so sánh trình tự nucleotide, đặc biệt vùng đầu 3’ khơng mã hóa hệ gen virus trình tự gen CP Cách tiếp cận phân tích trình tự amino acid CP trình tự nucleotide gen CP từ Potyvirus coi công cụ - 12 - - 17 - mạnh, khơng để nghiên cứu phân loại lồi virus thuộc chi, mà chủng Potyvirrus McKern đtg (1993) phân tích phát sinh lồi dựa trình tự nucleotide Potyvirus cho thấy, thành viên có trình tự với hệ số tương đồng 38% - 71% nhận dạng loài virus khác nhau; cịn thành viên có trình tự với hệ số tương đồng 90% nhận dạng chủng virus Các chủng virus riêng biệt phân biệt thay đổi hệ gen chúng trình bày bảng 3.8 Kết bảng 3.8 cho thấy, với 60 mảnh thuốc C9-1 biến nạp sử dụng thí nghiệm có 38 mảnh sống sót, tạo 82 chồi 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi thu 131 in vitro sống sót mơi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/l kanamycin 50 mg/l ĐC1 thuốc không chuyển gen cấy lên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh thu 105 sống Các thuốc sau rễ mơi trường có kháng sinh chọn lọc chuyển trực tiếp bầu đất Kết thu với 40 bầu đất, có 26 sống sót với biểu xanh tốt, mập mạp 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đơn loài SMV 3.2.1.1 Thiết kế đoạn gen CPi từ vùng bảo thủ gen CP từ SMV Theo chế RNAi, ức chế RNA ngoại lai xảy có tương đồng cao siRNA RNA đích Chính vùng bảo thủ gen CP SMV lựa chọn SMV để thiết kế tổng hợp đoạn gen CPi SMV (CPi-SMV), phục vụ thiết kế vector mang cấu trúc RNAi Đoạn gen CPi SMV (ký hiệu CPi-SMV) thiết kế có số lượng nucleotide 294 nucleotide cặp mồi mồi SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri thiết kế để nhân đoạn CPi-SMV A B C D E F Hình 3.24 Kết tái sinh chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào thuốc C9-1 A: Mảnh sau rửa khuẩn cấy môi trường chọn lọc; B: Các cụm chồi tạo thành sau hai tuần nuôi cấy môi trường chọn lọc; C: Các chồi màu xanh tách môi trường chọn lọc; D: Chồi chuyển gen sau tuần môi trường tạo rễ; E: Hình thái rễ thuốc chuyển gen môi trường chọn lọc; F: Cây thuốc chuyển gen trồng 3.2.1.2 Khuếch đại đoạn gen CPi-SMV tạo vector pENTR /D-TOPO tái tổ hợp bầu đất Khuếch đại đoạn CPi-SMV phản ứng PCR với enzyme Pfu cặp mồi đặc hiệu SMV-CP-Fi/SMV-CP-Ri sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose thu đoạn CPi-SMV có kích thước 0,294kb kích thước đoạn CPi thiết kế (Hình 3.9) Cấu trúc RNAi TM Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn CPi-SMV tinh gắn vào vector pENTR tạo plasmid tái tổ hợp chứa đoạn CPi-SMV (pEN-CPi-SMV) Vector tái tổ hợp pEN-CPi - SMV biến nạp nhân dòng tế bào vi khuẩn E.coli One Shot® Kết tách plasmid (Hình 3.12A) kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ plasmid cặp mồi đặc hiệu SMV-CPiFi/SMV-CPi-Ri (Hình 3.12B) cho thấy đoạn CPi-SMV có kích thước 294 bp gắn vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO tạo vector tái tổ hợp pEN-CPi-SMV Bảng 3.8 Kết biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào mảnh thuốc C9-1 pK7GW-CPi (SMV-BYMV) Số mảnh biến nạp Số mảnh sống sót Số cụm chồi tạo thành Số sống sót Số bầu đất Số trồng nhà lưới x 30=60 38 82 131 40 26 ĐC0* 30 - - - - ĐC1* 30 30 79 105 10 10 Ghi chú: * ĐC0 thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; * ĐC1 thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh khơng bổ sung kháng sinh 3.3.2 Kết phân tích thuốc chuyển gen 3.3.2.1 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR DNA tổng số tách từ mẫu non 26 dòng thuốc chuyển gen hệ T0 trồng nhà lưới sau - tuần kiểm tra - 16 - - 13 - tách chiết kiểm tra enzyme giới hạn Xba I Hind III kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt trình bày hình 3.22 Vector chuyển gen mang cấu trúc pGW/SMV-BYMV-CPi biến nạp vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens tiếp tục chọn dòng phản ứng colony-PCR với cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri Hình 3.22 Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt M CPi M 294 bp 0,3kb 0,2 kb  0,29kb Vector pK7GW enzym Xba I Hind III A M: thang DNA chuẩn kb; giếng pK7GW gốc, cắt Xba I HindIII thu đoạn DNA khoảng 1463bp 3310bp; giếng 2-3: pK7GW-CPi (SMV1,0kb  BYMV) cắt Xba I HindIII thu đoạn DNA khoảng 1,1kb 3,0kb Nghiên cứu biện pháp tăng cường trình phiên mã gen chuyển chủ tập trung tìm hiểu vùng điều khiển, đặc biệt promoternhân tố khởi đầu phiên mã Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật người ta thường sử dụng số promoter 35S, act, mas… 35S promoter mạnh Trong nghiên cứu này, cấu trúc RNAi thiết kế mang đoan gen CPi promoter 35S thực nghiệm chuyển vào thuốc C9-1 kết bước đầu đánh giá mức độ biểu tính kháng thuốc chuyển gen cho thấy tính khả thi nghiên cứu Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn CPi SMV M: Thang DNA 1kb; CPi: Đoạn CPi (0,294 kb) khuếch đại từ đoạn CPi -SMV B Hình 3.12 A: Hình ảnh điện di kiểm tra kết tách plasmid tái tổ hợp pEN-CPi-SMV; B: Sản phẩm PCR nhân đoạn CPi – SMV từ plasmid tái tổ hợp pEN-CPi-SMV cặp mồi đặc hiệu SMVCPi-Fi/SMV-CPi-Ri (M; Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3, 4: Dòng plasmid tái tổ hợp) thông qua việc biến nạp chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector pK7GW-CPi (SMV-BYMV) vào tế bào mảnh thuốc 3.2.1.2 Kết tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi- SMV) Tiến hành thí nghiệm tái tổ hợp vector pEN- CPi- SMV với vector nhận pK7GWIWG2(II), thành phần phản ứng LR gồm plasmid pENCPi-SMV, vector pK7GWIWG2(II) nước khử in on, tiệt trùng tạo vector chuyển gen mang cấu trúc CPi –SMV (pK7GW-CPi-SMV) Biến nạp vector pK7GW-CPi-SMV vào tế bào E.coli One Shot để khuếch đại plasmid mang đoạn CPi-SMV tiến hành chọn dòng Kết tách plasmid pK7GW-CPiSMV từ dịng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pK7GW-CPi-SMV enzyme giới hạn XbaI HindIII, kết điện di thu sản phẩm cắt gồm đoạn DNA tương ứng với kích thước khoảng 8,1kb, 3,1kb 0,85kb (Hình 3.14) Kết khẳng định vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi-SMV (pK7GW-CPi-SMV) thiết kế thành công Nicotiana tabacum C9-1 cắt tổn thương cạnh nuôi cấy 3.2.1.3 Tạo vi khuẩn A tumefaciens chứa vector chuyển gen 3.3 KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SMV VÀ BYMV 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào thuốc Tiến hành chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào thuốc lá, môi trường cảm ứng MS trước ngày (Hình 3.24) Tiến hành lần biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào mảnh thuốc với 30 mảnh lá/ lần, sau giai đoạn nuôi cấy chọn lọc, kết Vector mang cấu trúc pK7GW-CPi-SMV biến nạp vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens CV58C1 Sự có mặt vector chuyển gen pK7GWCPi-SMV vi khuẩn A tumefaciens kiểm tra phản ứng - 14 - - 15 - colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/SMVCPi-Ri Các dịng A tumefaciens tái tổ hợp dương tính với phản ứng PCR CPi (pEN-CPi (SMV-BYMV) Vector tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) biến nạp nhân dòng tế bào vi khuẩn E.coli Sử dụng phản ứng lưu giữ để phục vụ cho thí nghiệm tạo chuyển gen colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV- Hình 3.14 Kết kiểm tra điện di sản phẩm cắt Vector pK7GW enzym Xba I Hind III (Giếng 1-2-3-4: pK7GW- M 8,1kb 3310 3,1kb 0,85kb cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R 3310 CPi (SMV-BYMV) cắt Xba I HindIII 3,0kb M thu đoạn DNA, có đoạn 2,0kb CPi với kích thước 0,85kb; M: thang DNA 1,0kb 1463 CPi-R cặp mồi M13-F/M13-R (Hình 3.19) Tách plasmid kiểm tra plasmid tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) PCR trực tiếp từ plasmid với chuẩn 1kb; giếng pK7GW gốc, cắt Xba I HindIII thu đoạn 1,0kb DNA khoảng 1463bp 3310bp) 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng hai loài 0,5kb 0,5kb SMV BYMV A 3.2.2.1 Thiết kế đoạn gen CPi từ hai loài SMV BYMV Đoạn gen CPi hai loài SMV BYMV có ký hiệu CPi (SMVBYMV) với kích thước 573 nucleotide thiết kế bao gồm đoạn bảo thủ gen CP SMV có kích thước 294 nucleotide đoạn bảo thủ gen CP BYMV có kích thước 279 nucleotide, dựa phân tích đoạn gen CP đầu 3’ SMV BYMV phân lập trình tự cơng bố GenBank Cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri mà thiết kế B Hình 3.17 Hình ảnh điện Hình 3.19 Sơ đồ ghép nối kết điện di kiểm tra di sản phẩm PCR vùng sản phẩm colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) CPi SMV BYMV vector pEN-CPi (SMV-BYMV) M: Thang DNA 1kb; CPi: A: Sơ đồ ghép nối đoạn CPi (SMV-BYMV) vào vector Đoạn CPi khuếch đại từ đoạn pENTR /D-TOPO; B: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm CPi (SMV-BYMV) có kích colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) (1, 2: Đoạn CPi khuếch thước 573 nucleotide TM đại với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R; 3: đoạn CPi + attL1, attL2 với cặp mồi M13-F/M13-R; M: thang DNA 1kb) sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn CPi (SMV-BYMV) 3.2.2.1 Khuếch đại vùng CPi (SMV-BYMV) tạo vector pENTRTM/DTOPO tái tổ hợp Khuếch đại vùng CPi từ đoạn gen CPi (SMV-BYMV) PCR với cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri thiết kế sản phẩm kiểm tra điện di gel agarose cho thấy có băng điện di DNA có kích thước 0,573kb kích thước đoạn CPi thiết kế (Hình 3.17) Sản phẩm PCR nhân đoạn CPi (SMV-BYMV) làm gắn vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn 3.2.2.2 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi (SMV-BYMV) Trong thí nghiệm này, plasmid pEN-CPi (SMV-BYMV) tiếp tục tham gia phản ứng LR với vector tiếp nhận pK7GWIWG2(II) với xúc tác hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM II để tạo vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) (Hình 3.22) theo chế tái tổ hợp vector pEN- CPi (SMV-BYMV) với vector pK7GWIWG2(II) Vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) dịng hóa vào tế bào E.coli chọn dòng phản ứng colony-PCR Vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) sau ... khả kháng SMV BYMV cao đối chứng không chuyển gen; (iv) Tạo đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CP TỪ SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi. .. tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm đậu tương Việt Nam; (ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV hai loài SMV BYMV; (iii) Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi. .. chuyển gen đậu tương không phụ thuộc vào khả tiếp nhận gen kiểu gen đậu tương, mà phụ thuộc vào đặc điểm cấu trúc gen chuyển vào đậu tương Bệnh virus đậu tương có triệu chứng khó phân biệt, đậu