Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 1. Nguyên tắc của phương pháp PCR: DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi bị tách mạch thành mạch đơn). T m = 4(G + C) + 2(A + T) °C Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi. 2. Phản ứng PCR:  Thành phần phản ứng: - DNA bản mẫu - Mồi xuôi và mồi ngược - dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP) - MgCl 2 - Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu…) - Dung dịch đệm. - Nước cất 2 lần (đã khử trùng)  Các bước của phản ứng: Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Biến tính (denaturation) DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 95 0 C, trong thời gian 30s – 1 phút. Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization) Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với DNA mạch khuôn là T a (T a thấp hơn Tm khoảng 5 0 C). Bước 3: Kéo dài (elongation) Nhiệt độ được tăng lên đến 72 0 C, để DNA polymerase hoạt động kéo dài mạch. . Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 1. Nguyên tắc của phương pháp PCR: DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA. polymerase 5. Các dạng khác của PCR: - RT PCR (reverse transcriptase PCR) : RNA  cDNA  DNA. - RT – PCR (Realtime PCR – PCR định lượng): xác định hàm lượng sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm promoter, trình tự gắn của ribosome… 5. Hạn chế của phương pháp PCR - Ngoại nhiễm: Xử lí: Khử trùng khu vực thao tác . Việc thiết lập phản ứng PCR và phân tích sản phẩm được tiến hành ở các khu