Công nghệ Enzyme – Protein Công nghệ Enzyme – Protein 1 Công nghệ Enzyme – Protein Mục lục PHẦN I CÔNG NGHỆ ENZYME 3 Chương 1 Những khái niệm cơ bản về enzyme 7 1.1. Định nghĩa enzyme 7 1.2. Thành phần cấu tạo của enzyme 7 1.3. Trung tâm hoạt động của enzyme 14 1.3.1. Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử 7 1.3.2. Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử 8 1.3.3. Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động 9 1.3.4. Sự tạo thành trung tâm hoạt động 12 1.4. Tính đặc hiệu của enzyme 16 1.4.1. Khái niệm chung 7 1.4.2. Các hình thức đặc hiệu 8 1.4.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng 9 1.4.2.2 Đặc hiệu cơ chất 12 1.5. Cơ chế tác dụng của enzyme 17 Chương 2 Động học enzyme 19 2.1. Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme 19 2.2. Động học các phản ứng enzyme 21 2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 21 2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 26 2.2.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm 28 2.2.3.1 Các chất kìm hãm không thuận nghịch 9 2.2.3.2 Các chất kìm hãm thuận nghịch 12 2.2.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa 38 2 Công nghệ Enzyme – Protein 2.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ 39 2.2.6. Ảnh hưởng của pH 38 Chương 3 Cách gọi tên và phân loại enzyme 44 3.1. Cách gọi tên enzyme 44 3.2. Phân loại enzyme 44 3.2.1. Các lớp enzyme 44 3.2.2. Các phản ứng enzyme 46 3.2.2.1 Lớp enzyme oxydoreductase 51 3.2.2.2 Lớp enzyme transferase 51 3.2.2.3 Lớp enzyme hydrolase 3.2.2.4 Lớp enzyme lyase 3.2.2.5 Lớp enzyme isomerase 3.2.2.6 Lớp enzyme ligase Chương 4 Phương pháp nghiên cứu enzyme 52 4.1. Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme 52 4.2. Tách và làm sạch (tinh chế) enzyme 53 4.2.1. Nguồn nguyên liệu 38 4.2.1.1 Nguồn thực vật 4.2.1.2 Nguồn động vật 4.2.1.3 Nguồn vi sinh vật 4.2.2. Thu hồi chế phẩm enzyme 39 4.3. Hoạt độ enzyme 54 4.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 56 4.3.2. Đơn vị hoạt độ enzyme 57 Chương 5 Sinh học enzyme 64 5.1. Điều hòa hoạt tính enzyme 64 5.2. Điều hòa sinh tổng hợp enzyme 64 5.2.1. Điều hòa theo kiểu đóng mở gen tác động 64 5.2.2. Điều hòa tương tác giữa RNA – polymerase với gen promotor 64 Chương 6 Công nghệ enzyme và ứng dụng 69 6.1. Công nghệ enzyme 69 6.1.1. Enzyme với công nghệ sinh học 111 6.1.2. Enzyme không tan 112 3 Công nghệ Enzyme – Protein 6.2. Ứng dụng 69 6.2.1. Ứng dụng trong y dược 111 6.2.2. Ứng dụng trong hóa học 112 6.2.3. Ứng dụng trong công nghiệp 113 6.2.4. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 111 6.2.5. Ứng dụng trong công nghiệp dệt 112 6.2.6. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 113 6.2.7. Ứng dụng trong nông nghiệp Chương 1 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME 1.1. Định nghĩa enzyme Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này được gọi là chất xúc tác. Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra trong cơ thể sinh vật) cũng có chất làm tăng các phản ứng, chất đó được gọi là enzyme. Enzyme được các cơ thể 4 Công nghệ Enzyme – Protein sinh vật sinh tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong cơ thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ. Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein. Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể. Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thể tóm tắt như sau: - Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất. - Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao. - Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo. - Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít. - Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme. - Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Enzyme học là khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chất protein. Hay nói cách khác, enzyme học là khoa học nghiên cứu những tính chất chung, điều kiện, cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu của các enzyme. 1.2. Thành phần cấu tạo của enzyme Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton (có kích thước nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton) Enzyme được cấu tạo từ các L – α – axitamin kết hợp với nhau bởi liên kết peptit. Dưới tác dụng của các peptithydrolase, axit hoặc kiềm các enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các L – α – axitamin. Trong nhiều truờng hợp ngoài axit amin còn thu được những thành phần khác, người ta chia thành hai nhóm:  Nhóm enzyme đơn cấu tử (enzym đơn giản): enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóa học duy nhất là protein.  Nhóm enzyme đa cấu tử (enzym phức tạp): enzyme có hai thành phần: 5 Công nghệ Enzyme – Protein - Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme. Apoenzyme thường quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme. - Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”: như ion kim loại, vitamin, glutation dạng khử, nucleotide và dẫn xuất este phosphat của monosacaride, Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần “apoenzyme” (khi cho thẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì những agon đó còn có tên riêng là coenzyme. Phần agon quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính. Đa số enzyme thuộc loại enzyme đa cấu tử. Hiện nay người ta cũng đã xác định được rằng phần lớn các enzyme trong tế bào là những protein có cấu trúc bậc bốn. Ở những điều kiện xác định, phân tử của chúng có thể phân ly thuận nghịch tạo thành các phần dưới đơn vị (protome), khi đó hoạt độ enzyme bị giảm hoặc bị mất hoàn toàn. Ở những điều kiện thích hợp các phần dưới đơn vị lại có thể kết hợp lại với nhau và hoạt độ xúc tác của enzyme được phục hồi. 1.3. Trung tâm hoạt động của enzyme Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất, phần đó được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trung tâm của enzyme được tạo nên do một số axit amin đảm trách. Các axit amin khác trong protein không tham gia gắn với cơ chất mà chỉ làm nhiệm vụ như một chiếc khung cấu trúc không gian của chiếc khung đó. 1.3.1. Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp các nhóm định chức của axit amin không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptit. Các nhóm chức của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là: - Nhóm SH (sunfidryl) của Cysteine - Nhóm ε - NH2 (amin) của Lysine - Nhóm OH (Hydroxyl) của Serine, Threonine và Tyrosine - Nhóm COOH (Cacboxyl) của axit Glutamic, Aspactic 6 Công nghệ Enzyme – Protein - Vòng imidazol của Histidine - Vòng indol của Tryptophan - Nhóm guanilic của Acginine Khi tạo thành trung tâm hoạt động các nhóm này phải ở vị trí gần nhau và được định hướng trong không gian sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình phản ứng. Ví dụ, Trung tâm hoạt động của Colinesteraza bao gồm các nhóm: -OH của serine, tyrosine, -COOH của glutamic, imidazolit của histidine. Hình 1.1 : Trung tâm hoạt động của enzym colinesteraza Các trung tâm hoạt động có thể hình thành dễ dàng khi các nhóm chức ở gần nhau trên Apoenzyme. Nhưng có khi chúng ở xa nhau thì phải hoạt hóa bằng cách cắt đi một đoạn peptide nào đó, chúng xích lại gần nhau và tạo thành trung tâm hoạt động. Ví dụ, Tripxinogen là trạng thái không hoạt động, nhưng khi dưới tác dụng của enzyme Enterokinaza thì 6 axit amin bị loại ra, các nhóm chức lúc này xích lại gần và trung tâm hoạt động được dễ dàng. 1.3.2. Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử thường bao gồm nhóm ngoại (vitamin, ion kim loại ) và các nhóm định chức của các axit amin ở phần apoenzyme. Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là những kim loại hóa trị 2: Fe, Co, Mn, Zn, Cu…các kim loại này có thể trực tiếp tham gia trong phản ứng xúc tác, liên kết bền với các phân tử enzyme. Enzyme bị mất hoạt động sau khi loại bỏ ion kim loại, tuy nhiên hoạt động có thể được phục hồi lại hoàn toàn ngay sau khi thêm ion kim loại vốn có trong phân tử của nó. Một số enzyme có thể được tái hoạt hóa dưới tác dụng của các ion kim loại khác. Tuy nhiên sự thay thế này thường làm thay đổi hoạt độ và tính đặc hiệu của enzyme. 7 Công nghệ Enzyme – Protein 1.3.3. Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động Dựa vào vai trò của trung tâm hoạt động các nhóm chức năng có thể phân thành các nhóm sau đây: - Các nhóm xúc tác: là những nhóm trực tiếp tham gia trong phản ứng kết hợp với phần phân tử cơ chất bị chuyển hóa, kết hợp với cofacto. - Các nhóm tiếp xúc: kết hợp với phần cơ chất không bị chuyển hóa có vai trò tương tự dây neo buộc cơ chất lại. - Các gốc cấu tạo hay cố định: không trực tiếp kết hợp với cơ chất, nhưng tương tác với các nhóm xúc tác và tiếp xúc, cố định các gốc này trong những vị trí không gian nhất định và giữ chúng ở trạng thái hoạt động xúc tác. Sự liên hệ giữa trung tâm hoạt động với phần còn lại của cơ chất được thực hiện qua gốc này. 1.3.4. Sự tạo thành trung tâm hoạt động Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn có cấu trúc không gian tương ứng với cấu trúc của phân tử cơ chất cũng giống như ổ khóa tương ứng với chìa khóa. (Hình a) Hình 1.2 Mô hình Fisher (a) và mô hình Koshland (b) Từ đó có thể suy ra rằng enzyme có hình thể tương đối vững chắc, cố định, kết hợp với cơ chất như một khuôn nào đó. Tuy nhiên dần dần người ta thấy quan niệm của Fisher đã không giải thích thỏa đáng được nhiều dẫn liệu thực nghiệm. Đến năm 1958, Kosland đã đề ra thuyết “tương ứng cảm ứng” cho rằng phân tử enzyme cũng như trung tâm hoạt động của nó không có cấu tạo rắn chắc mà có tính mềm dẻo, cấu hình không gian của nó có thể thay đổi khi tiếp xúc với cơ chất…Theo Kosland thì 8 Công nghệ Enzyme – Protein trong phân tử enzyme có sẵn các nhóm định chức của trung tâm hoạt động nhưng chúng chưa được sắp xếp ở dạng thích hợp cho hoạt động xúc tác. Khi tương tác với cơ chất, các nhóm định chức ở phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme sẽ thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể cơ chất (Hình b). Trong trường hợp này cơ chất và enzyme có sự tương tác yếu. Do đó, chúng rất dễ bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng. Các chất có cùng kiểu cấu trúc với cơ chất thực nhưng có sự thay đổi ở một phần nào đó trong phân tử có thể vẫn kết hợp với enzyme nhưng tạo thành phức chất không hoạt động vì các nhóm định chức của trung tâm hoạt động không được định hướng đúng đắn. Ở những enzyme alosteric (enzym dị lập thể, enzym điều hòa) còn có trung tâm dị lập thể (trung tâm điều hòa). Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác. Các cơ chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa alosteric. Khi trung tâm điều hòa này tương tác với chất điều hòa alosteric sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động. Do đó hoạt tính xúc tác của enzyme sẽ bị thay đổi theo. Nếu quá trình này làm tăng hoạt tính của enzyme thì chất điều hòa alosteric này gọi là chất điều hòa dương. Ngược lại, nếu quá trình này làm giảm hoạt tính của enzyme thì chất điều hòa alosteric này gọi là chất điều hòa âm. Chất điều hòa này hoàn toàn không bị biến đổi khi chúng tương tác với enzyme. 1.4. Tính đặc hiệu của enzyme 1.4.1. Khái niệm chung Tính đặc hiệu cao của enzyme là một trong những khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Sự tác dụng có tính lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme. 1.4.2. Các hình thức đặc hiệu Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất. 1.4.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng 9 Công nghệ Enzyme – Protein Đặc hiệu này thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng chuyển hóa một chất nhất định. Ví dụ, amino axit có khả năng xảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm amin, vì vậy mỗi phản ứng ấy cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase, aminoacid oxydase và aminotransferase. 1.4.2.2 Đặc hiệu cơ chất Mỗi một cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng. Các enzyme có thể phân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng. Mức độ đặc hiệu của các enzyme không giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức sau:  Đặc hiệu tuyệt đối Enzyme chỉ tác dụng trên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụng với chất nào khác. Ví dụ, urease hầu như chỉ tác dụng với ure, thủy phân nó thành khí cacbonic và amoniac: Tuy nhiên, ure cũng tác dụng được với các chất khác có cấu trúc gần giống ure (hydroxyure) nhưng với vận tốc bé hơn 120 lần. Các enzyme khác như arginase, glucooxydase cũng thuộc loại có tính đặc hiệu tuyệt đối, vì arginase chỉ xúc tác thủy phân L- arginin tạo thành L-ornitin và ure mà không tác dụng lên este metylic của arginin. Những enzym có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượng chính xác cơ chất của nó.  Đặc hiệu nhóm tương đối 10 [...]... khác: ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu âm, tia bức xạ,… Công nghệ Enzyme – Protein 25 Trong hệ thống sống, hoạt tính enzyme còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển Công nghệ Enzyme – Protein 26 Chương 3 Cách gọi tên và phân loại enzyme 3.1 Cách gọi tên enzyme Theo qui ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme thường gồm hai phần: - Phần thứ nhất chỉ tên cơ chất (nếu có nhiều... enzym Công nghệ Enzyme – Protein 14 Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước Chương 2 ĐỘNG HỌC ENZYME 2.1 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme Nghiên cứu động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm… đến tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác Việc nghiên cứu động học enzyme. .. + NH3 + H2O R có tên gọi là L – axitamin : oxydoreductase (deamin) Ngoài ra hiện nay còn dùng tên thông dụng như amilase, papain, pepsin, Ví dụ enzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid) có: có tên hệ thống là: Carbamid – amidohydrodase, tên thông dụng: urease 3.2 Phân loại enzyme 3.2.1 Các lớp enzyme Công nghệ Enzyme – Protein 27 Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, Hội hóa sinh quốc tế (IUB)... giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của protein Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, thường ở trong khoảng từ 40-600C Tuy nhiên, mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn enzyme, cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng… Công nghệ Enzyme – Protein 24 Nhiệt độ mà enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc... 3.2.2.5 Lớp enzyme isomerase Lớp enzyme gồm 5 lớp phụ, trong quá trình này có sự sắp xếp lại trong phân tử cơ chất Có thể biểu thị như sau:  UDP - glucose - 4 – epimerase: xúc tác cho sự chuyển hóa tương hỗ phức tạp giữa galactose và glucose, tức là làm xoay nhóm OH xung quanh nguyên tử carbon ở vị trí thứ tư của đường galactose Enzyme có coenzyme NAD +, xúc tác cho phản ứng: Công nghệ Enzyme – Protein. .. hoặc trans Ví dụ, enzyme fumarathydratase chỉ tác dụng lên dạng trans của axit fumaric mà không tác dụng lên dạng cis để tạo thành axit L – malic Công nghệ Enzyme – Protein 12 Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hổ giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng Ví dụ, lactatracemase của vi khuẩn xúc tác cho phản ứng chuyển hóa lẫn nhau giữa axit D - và L – lactic, aldo... Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis - Menten Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn Công nghệ Enzyme – Protein 17 Hình 2.2 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất Khi tăng [S] thì V phản ứng tăng,... với enzyme ở chỗ khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi dạng không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của nó, do đó làm giảm vận độ phản ứng Vì vậy sau khi kết hợp với chất kìm hãm này, enzyme vẫn có thể tiếp tục kết hợp với cơ chất tạo thành phức chất Công nghệ Enzyme – Protein 21 Hình 2.8 Kiểu kìm hãm hỗn tạp Ngoài ra, chất kìm hãm không những kết hợp với enzyme. .. là: Công nghệ Enzyme – Protein - 23 Tồn tại nhiều trung tâm kết hợp với cơ chất bằng các ái lực khác nhau Khi nồng độ cơ chất thấp thì enzyme có thể chỉ kết hợp với một phân tử cơ chất, còn khi ở nồng độ cơ chất cao nó kết hợp với nhiều cơ chất dẫn đến hình thành phức hợp ES không hoạt động - Cơ chất cũng có thể được kết hợp nhờ những vị trí đặc biệt của enzyme Đó là một nhóm enzyme quan trọng (enzyme. .. - Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp Công nghệ Enzyme – Protein - 34 Tách kết tủa enzyme bằng cách ly tâm lạnh tốt hơn lọc lạnh vì tiến hành nhanh hơn, và cần thực hiện thí nghiệm liên tục, không ngắt quãng để tránh giảm hoạt độ của enzyme - Khi tiến hành xác định hoạt độ của các enzyme, nếu đã xác định trong khoảng nhiệt độ nào thì tất cả . Công nghệ Enzyme – Protein Công nghệ Enzyme – Protein 1 Công nghệ Enzyme – Protein Mục lục PHẦN I CÔNG NGHỆ ENZYME 3 Chương 1 Những khái niệm cơ bản về enzyme 7 1.1. Định nghĩa enzyme. cis để tạo thành axit L – malic 11 R – C – N – CH - COOH O H R’ RCOOH + H 2 N – CH - COOH R’ cacboxypeptidaza Công nghệ Enzyme – Protein Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản. enzyme và ứng dụng 69 6.1. Công nghệ enzyme 69 6.1.1. Enzyme với công nghệ sinh học 111 6.1.2. Enzyme không tan 112 3 Công nghệ Enzyme – Protein 6.2. Ứng dụng 69 6.2.1. Ứng dụng trong y dược