BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chaetoceros phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy-Nam ðịnh và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hoài Hà KS. Phạm Thị Bích ðào Sinh viên : Nguyễn Ngọc Tuyền Lớp : CNSH 06.02 Hà Nội - 2010 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, trưởng phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS. Phạm Thị Bích Đào, phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã góp ý, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tập thể các Thầy, Cô giáo và cán bộ của Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Hà Nội, tháng 05 năm 2010 Sinh viên Nguyễn Ngọc Tuyền DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết ñầy ñủ kDa Kilo Dalton (khối lượng phân tử) Bp Base pair (cặp bazơ) Taq Taq (Thermus aquaticus) polymerases EPA Eicosapentaenoic acid AA Arachinoic acid DHA Decoxahexaenoic acid PUFA Polyunsaturated fatty acid LA Linoleic acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction MT F/2 Môi trường F/2 MT ASW Môi trường ASW MT F/2 ko Si Môi trường F/2 không silic TB/ml Tế bào/ml RNM Rừng ngập mặn DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG Danh mục hình Hình 1.1. Rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam Định 1 Hình 1.2. Bản đồ khu hệ Rừng ngập mặn Xuân Thủy 2 Hinh 1.3. Cơ cấu các ngành tảo trong mẫu thu được ở mùa khô năm 1996 tại RNM Xuân Thủy-Nam Định 4 Hình 1.4. Cơ cấu các ngành tảo trong mẫu thu được ở mùa mưa năm 1996 tại RNM Xuân Thủy-Nam Định 5 Hình 1.5. Cấu trúc tế bào ở tảo silic 8 Hình 1.6. Một số loài tảo silic thường gặp 9 Hình 1.7. Hình ảnh một số loài trong chi tảo Chaetoceros 12 Hình 2.1. Các điểm lấy mẫu được định vị trên bản đồ 19 Hình 3.1. Phân lập tảo trên các đĩa thạch 34 Hình 3.2. Nuôi tảo trong các lọ Penicillin 34 Hình 3.3. Nuôi giữ giống vi tảo trong các bình tam giác dung tích 250 ml 35 Hình 3.4. Khả năng sinh trưởng của vi tảo chủng TC1 trên các môi trường khác nhau 37 Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của vi tảo chủng TC1 trên các thang độ mặn 40 Hình 3.6. Nuôi sinh khối vi tảo trong bình 5 lít có sục khí 24/24 và chiếu sáng.43 Hình 3.7. Hình ảnh vi tảo chủng TC1 trên kýnh hiển vi quang học Olympus CX41 44 Hình 3.8. Sắc ký đồ thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1.49 Hình 3.9. Mật độ tế bào ung thư biểu mô sau thử nghiệm 54 Hình 3.10. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng 55 Danh mục bảng Bảng 1.1. Thành phần loài thực vật nổi ven biển Xuân Thủy 6 Bảng 3.1. Số lượng tế bào chủng TC1 nuôi cấy trên sáu môi trường 36 Bảng 3.2. Mật độ tế bào chủng TC1 trên môi trường ASW với độ mặn khác nhau 40 Bảng 3.3. Thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 46 Bảng 3.4. Kết quả so sánh tỉ lệ acid béo trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 và tỉ lệ acid béo trong vi tảo Amphiprora alata 50 Bảng 3.5. Kết quả thử khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô 53 MỤC LỤC CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY – NAM ĐỊNH 1 1.2. GIỚI THIỆU VỀ TẢO SILIC VÀ CHI Chaetoceros 7 1.2.1. Giới thiệu về tảo silic (Bacillariophyta) 7 1.2.1.1. ðặc ñiểm và cấu tạo tảo silic 7 1.2.1.2. Phân bố và vai trò tảo silic 8 1.2.2. Chi tảo Chaetoceros 9 1.2.2.1. Vị trí phân loại 9 1.2.2.2. ðặc ñiểm sinh học 10 Hình 1.7. Hình ảnh một số loài trong chi tảo Chaetoceros 12 1.2. 3. Tình hình nghiên cứu tảo và chi Chaetoceros 12 1.3. TẾ BÀO BIỂU MÔ VÀ UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO 14 1.3.1. Tế bào biểu mô 14 1.3.2. Ung thư biểu mô tế bào 15 1.4. KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA ACID BÉO TRONG VI TẢO 16 1.4.1 Giới thiệu chung về acid béo và vai trò 16 1.4.2. Khả năng kháng tế bào ung thư của acid béo 17 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. NGUYÊN LIỆU 20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20 2.1.3. Hóa chất 21 2.1.4. Máy móc và dụng cụ 21 2.1.5. Môi trường nuôi cấy 22 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu 22 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi tảo biển 23 2.2.2.1. Làm giàu mẫu 23 2.2.2.2. Phương pháp tách và thuần khiết trên ñĩa thạch 23 2.2.3. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi tảo biển 24 2.2.5. Phương pháp phân loại vi tảo biển 26 2.2.5.1. Phương pháp hình thái học 26 2.2.5.2. Phương pháp ñịnh loài bằng sinh học phân tử 26 2.2.6. Phương pháp nhân nuôi và thu sinh khối 30 2.2.7. Phương pháp xác định thành phần acid béo 32 2.2.8. Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) 32 2.2.9. Phương pháp thử khả năng kháng tế bào ung thư của acid béo 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1. PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO BIỂN 35 3.2. LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO VI TẢO CHỦNG TC1 ĐÃ TUYỂN CHỌN ĐƯỢC 36 3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ MẶN LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO CHỦNG TC1 40 3.4. NHÂN NUÔI SINH KHỐI 42 3.5. PHÂN LOẠI VI TẢO CHỦNG TC1 ĐÃ TUYỂN CHỌN 44 3.5.1. Phân loại theo hình thái học 44 3.5.2. Phân loại dựa theo sinh học phân tử 46 3.6. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO CỦA VI TẢO Chaetoceros muelleri TC1 47 3.7. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 MỞ ðẦU Trên thế giới mỗi năm có 10.9 triệu người được chẩn đoán là mắc ung thư, trong đó có 6.7 triệu người sẽ chết vì căn bệnh này. Ung thư đang gia tăng một cách nhanh chóng và điều này là nguyên nhân chính làm thay đổi nhân khẩu của dân số thế giới. Ung thư gan, phổi, vú, ruột, dạ dày, tuyến tiền liệt, cổ và thực quản là những căn bệnh ung thư phổ biến nhất, trong đó ung thư phổi và ung thư dạ dày gây tử vong cao nhất. Giáo sư John Toy, giám đốc của tổ chức từ thiện chuyên nghiên cứu về ung thư ở Anh cho biết ung thư vẫn là căn bệnh lớn trong thế giới phát triển [43]. Ở Việt Nam, số người mắc bệnh ung thư cũng khá cao, đặc biệt là ung thư gan. Trong những năm gần đây, mỗi năm, Việt Nam có đến 10000 ca mắc mới, và trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan đứng thứ 3 trên thế giới. Phần lớn các bệnh nhân lại phát hiện bệnh trong giai đoạn trễ nên việc chữa trị không còn hiệu quả. Chỉ khoảng 30% - 40% bệnh nhân sống được thêm 5 năm sau khi phát hiện bệnh [44]. Chính vì vậy, việc tìm ra liệu pháp điều trị bệnh ung thư đạt hiệu quả cao và chi phí vừa phải đang là vấn đề cần được quan tâm. Mặt khác, với địa hình thuận lợi: đường bờ biển kéo dài, nhiều sông, suối, ao, hồ… ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta trong những năm gần đây đang rất phát triển, song mới chỉ tập trung vào đánh bắt, nuôi các loài thủy hải sản, nên chưa phát huy được hết tiềm năng của ngành. Trong các tiềm năng đó, việc nuôi trồng các loài vi tảo cũng đang là một hướng được nhiều nước trên thế giới đặc biệt quan tâm. Bởi vi tảo không những đem lại nguồn thức ăn cho các loài thủy hải sản, mà còn là nguồn cung cấp dược liệu tự nhiên, cung cấp nguyên liệu để điều chế các chế phẩm sinh học có hoạt tính cao, giá thành vừa phải, mà nổi bật là các acid béo được chiết xuất từ vi tảo. Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra rất nhiều loại acid béo trong vi tảo có khả năng ngăn ngừa và ức chế tế bào ung thư, trong đó có thể kể đến các acid béo thuộc nhóm omega 3, omega 6… đều có hoạt tính diệt bào đối với các tế bào ung thư như ung thư vú, phổi và tuyến nhiếp hộ, và không tác động trên các tế bào bình thường. Trên thực tế, các acid béo chưa no loại có nhiều nối đôi có hoạt tính diệt bào (in vitro) ít nhất là đối với 16 dòng tế bào ung thư nơi người lấy từ các cơ quan khác nhau [41]. Vì những lý do trên, cùng với mong muốn phát triển ngành nuôi trồng thủy sản và tìm ra một nguồn nguyên liệu có hiệu quả góp phần trong điều trị ung thư, chúng tôi thực hiện khóa luận : “Phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chaetoceros phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam ðịnh và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô”. Với mục tiêu như sau: • Phân lập chủng vi tảo Chaetoceros từ các mẫu lấy từ rừng ngập mặn Xuân Thủy-Nam Định. • Phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chaetoceros phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy-Nam Định. • Bước đầu xác định khả năng kháng tế bào ung thư của vi tảo Chaetoceros. Công việc này không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội, khoa học cơ bản mà còn có ý nghĩa tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng khác sau này. [...]... gây ung thư nói chung hay ung thư bi u mô nói riêng là s sai h ng c a DNA, t o nên các ñ t bi n các gene thi t y u ñi u khi n quá trình phân bào cũng như các cơ ch quan tr ng khác M t ho c nhi u ñ t bi n ñư c tích lũy l i s gây ra s tăng sinh không ki m soát và t o thành kh i u [47] Có th k ñ n m t s lo i ung thư bi u mô thư ng g p như: ung thư bi u mô nhú, ung thư bi u mô t y, ung thư bi u mô gan, ung. .. các ch t 1.3.2 Ung thư bi u mô t bào 15 Nguy n Ng c Tuy n Khóa lu n t t nghi p Ung thư là m t nhóm các b nh liên quan ñ n vi c phân chia t bào m t cách vô t ch c và nh ng t bào ñó có kh năng xâm l n nh ng mô khác b ng cách phát tri n tr c ti p vào mô lân c n ho c di chuy n ñ n nơi xa (di căn) [47] Ung thư bi u mô là lo i ung thư r t ph bi n Ung thư bi u mô (carcinoma) có ngu n g c t t bào bi u mô Nguyên... bi u mô gan, ung thư bi u mô da, ung thư bi u mô vòm h ng… trong ñó ung thư bi u mô gan và ung thư bi u mô da ñang ngày càng xu t hi n nhi u nư c ta [44] 1.4 KH NĂNG KHÁNG T BÀO UNG THƯ C A ACID BÉO TRONG VI T O 1.4.1 Gi i thi u chung v acid béo và vai trò Acid béo là các chu i nguyên t cacbon th ng hàng và dài, ch a kho ng 12-22 nguyên t (C12-C22) Chúng có m t ñ u hòa tan trong nư c và m t ñ u methyl... th tr thành lo i thu c ng a ch ng vài lo i ung thư như ung thư vú và ung thư ru t già [42] Cũng theo hãng tin AFP, các nhà khoa h c M ñã ñưa ra và công b k t lu n v vi c b sung acid béo omega 3 có th gi m nguy cơ b kh i u nguy hi m nh ng ngư i d có nguy cơ m c ung thư ru t ð có ñư c k t qu trên, h ñã ti n hành th c nghi m trên 55 ngư i có nguy cơ nhi m ung thư ru t cao C th , 28 ngư i ñư c ch n vào nhóm... n Khóa lu n t t nghi p Ti n sĩ dư c khoa Tr n Vi t Hưng cũng cho r ng, c 2 acid béo omega 3 và omega 6 ñ u có ho t tính di t bào ñ i v i các t bào ung thư vú, ph i và tuy n nhi p h , và không tác ñ ng trên các t bào bình thư ng Trên th c t , các acid béo chưa no lo i có nhi u n i ñôi có ho t tính di t bào (in vitro) ít nh t là ñ i v i 16 dòng t bào ung thư nơi ngư i l y t các cơ quan khác nhau [41]... song hay xuyên tâm [1] Ch t t bào trong su t, thư ng chi m l p sát v hay n m cách xa v thành c c nh và n i li n v i v b ng các s i ch t t bào Nhân t bào có hình d ng bi n thiên tùy theo hình d ng t bào: hình tròn, thoi hay b u d c, t bào ch a 1 nhân và ña s loài nhân n m trên ch t t bào, nhưng m t s loài nhân n m gi a t bào trên các s i ch t t bào. Th màu n m trong ch t t bào, áp sát v dư i d ng b n l... béo thu c nhóm omega 3, omega 6… Có th k ñ n m t vài công b v kh năng kháng t bào ung thư c a acid béo như sau: T i trư ng ñ i h c Indian, nhóm nghiên c u c a giáo sư Rafat Siddiqui ñã nghiên c u tác ñ ng c a hai acid béo omega 3: docosahesaenoic acid (DHA) và eicosapentaenoic acid (EPA) ñ i v i b nh ung thư vú C hai ñ u có tác ñ ng nh lên các t bào ung thư khi ng d ng ñơn l Nhưng khi k t h p chúng... chúng có kh năng ngăn ch n s lây lan c a t bào ung thư m t ch ng m c nào ñó H ghi nh n c hai s k t h p propofol-DHA và propofol-EPA ñ u cho nhi u hi u qu rõ r t hơn Chúng không ch ngăn ch n s lây lan c a t bào ung thư, kìm hãm các kh i u m i ti m n mà còn có th gi t ch t m t s t bào ung thư [39] 17 Nguy n Ng c Tuy n Khóa lu n t t nghi p T i ñ i h c Kuopio, nhóm nghiên c u c a ti n sĩ David E Laaksonen... gen 28S rRNA; nghiên c u tính kháng v i m t s h p ch t gây ô nhi m môi trư ng nuôi tr ng th y s n và ñào th i chúng b ng vi c s d ng vi t o [37] T i phòng Sinh h c t o, Vi n Vi sinh v t và Công ngh Sinh h c, ð i h c Qu c Gia Hà N i cũng ñã có r t nhi u nghiên c u v ng d ng c a vi t o, ñ c bi t là các ch ng vi t o thu c chi Chaetoceros Chaetoceros mang nh ng ñ c trưng cơ b n và n i tr i c a ngành t o silic,... no nên khi không ñư c cung c p ñ t th c ăn thì các r i lo n s xu t hi n các cơ quan này trư c tiên Trong các lo i acid béo thì acid omega 3 và omega 6 là hai acid quan tr ng mà cơ th không t t ng h p ñư c [30] 1.4.2 Kh năng kháng t bào ung thư c a acid béo Hi n nay, trên th gi i, các nhà khoa h c ñã tìm ra r t nhi u lo i h p ch t sinh h c có kh năng ngăn ng a và c ch t bào ung thư, trong ñó có th k . nghiên cứu tảo và chi Chaetoceros 12 1.3. TẾ BÀO BIỂU MÔ VÀ UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO 14 1.3.1. Tế bào biểu mô 14 1.3.2. Ung thư biểu mô tế bào 15 1.4. KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA ACID BÉO. kháng tế bào ung thư biểu mô . Với mục tiêu như sau: • Phân lập chủng vi tảo Chaetoceros từ các mẫu lấy từ rừng ngập mặn Xuân Thủy-Nam Định. • Phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chaetoceros. góp phần trong điều trị ung thư, chúng tôi thực hiện khóa luận : Phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chaetoceros phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam ðịnh và thăm dò khả năng kháng