Can we do better than Agrobacterium ? Các phương pháp để đưa gene mới vào tế bào th ực vật có thể chia làm 2 loại: phương pháp vật lý như bắn gen hay điện biến nạp (electroporation) và phương pháp tự nhiên, sử dụngAgrobaterium. Phát kiến về việc Agrobaterium tumefaciens có khả năng chuyển gene vào thực vật đã biến loài này trở thành m ột trong những công cụ quan trong nhất của Công nghệ sinh học thực vật. A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gene của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gene này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ tạo ra các kh ối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra nh ững nốt sần ở cây (bệnh mụn cây-crown gall disease). Thập kỷ 70 là thời gian của hàng loạt nghiên cứu quan trọng về A. tumefaciens, tạo cơ sở cho phát minh về chuyển gene thực vật sau này. Người ta phát hiện ra bộ gene của các tế bào kh ối u ở thực vật có gắn 1 đoạn DNA từ vi khuẩn. Hơn thế, các DNA được chuyển vào tế bào thực vật này (gọi là T-DNA: tranferred DNA) là 1 phần của một phân tử DNA nhỏ nằm ngoài NST của vi khuẩn. Phân tử DNA vi khuẩn này được gọi là Ti (tumor-inducing) plasmid (1,2). Thực vật bị thương sẽ ứa ra các hợp chất phenol, kích thích sự biểu hiện của gene vir(virulence gene) nằm trên Ti-plasmid (3).Gene vir mã hóa cho các protein thực hiện việc cắt, chuyển và gắn T-DNA vào genome thực vật. Một số gene nằm trên vùng T- DNA có khả năng điều khiển sự tổng hợp các hormone sinh trưởng như auxin, cytokinin và phytohormones, dẫn đến sự phân bào nhanh chóng ở các tế bào chuyển gene (4), đây chính là lý do tế bào phát triển thành khối u (hay nốt sần). Đầu thập kỷ 80 có thể coi là "thời đại hoàng kim" của chuyển gen bằng Agrobacterium khi ngư ời ta phát hiện ra rằng: - T-DNA, 1 đoạn của Ti plasmid, sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u này sau đó không phụ thuộc vào sự có mặt của agrobacteria nữa. - T-DNA được xác định bởi 2 đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T- DNA borders), phần còn lại ngoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gene. Nh ờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T- DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gene mong muốn. Khi các o ncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gene sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho cây hữu thụ (5,6). - Các nghiên cứu về việc vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật trở nên d ễ dàng hơn nhiều nhờ việc sử dụng các marker có thể chọn lọc và kiểm tra được cho quá trình xác định tế bào chuyển gen. Các nghiên cứu về Agrobactrium và khả năng tự nhiên của chúng trong vi ệc biến đổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm đã giúp các nhà khoa học thiết kế được những phân t ử giúp chuyển gene mong muốn vào tế bào th ực vật. Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này đư ợc gọi chung là các vector. Một hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium thuờng bao gồm: - Một chủng Agrobacterium mang vùng vir và một T-DNA có chứa gen muốn chuyển. Vùng vir và T- DNA có thể nằm trên cùng 1 vector hoặc trên các vector riêng biệt. - T-DNA được chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật và sau đó được gắn vào genome thực vật. - Gene chuyển biểu hiện trong tế bào thực vật. - Các tế bào hoặc mô chuyển gene tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Agrobacterium vẫn được coi là giống vi khuẩn duy nh ất có khả năng chuyển gene vào thực vật cho tới khi công trình của Broothaerts và cộng sự đư ợc công bố trên Nature tháng 2 năm 2005 (7). Trong thời gian làm việc tại Viện CNSH, công việc hàng ngày c ủa tôi là chuyển gen, chuyển gen và chuyển gen .Thêm nữa hầu hết các vector sử dụng đều của CAMBIA (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture), vì v ậy khỏi phải nói tôi đã hứng thú thế nào khi có cơ hội tham dự buổi seminar của Richard A. Jefferson, trưởng nhóm nghiên cứu trên của CAMBIA, hỏi han và trao đổi thêm với ông những ngày sau đó. Trước đây, người ta đã từng chuyển Ti-plasmid vào các vi khuẩn khác để xem thử nó có khả năng tạo khối u hay không. Khi được đưa vàoE. coli hay Pseudomonas aeruginosa, Ti-plasmid không có khả năng tạo khối u ở thực vật, nhưng khi được chuyển vào các vi khuẩn có quan hệ rất gần với Agrobacterium như họ Rhizobiaceae, Ti-plasmid vẫn mang khả năng này (8). Tương tự như các kết quả đó, hệ thống chuyển gene nhờ vi khuẩn hoạt động tốt nhất khi sử dụng các vi khuẩn gần gũi với Agrobaterium. Nhóm tác giả đã tạo ra được 1 hệ thống chuyển gen ổn định cho 3 loài thực vật: thuốc lá, lúa và Arabidopsis khi sử dụng 3 chủng vi khuẩn thuộc 2 họ, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti và Mesorhizobium loti. Họ thu được rất nhiều cây thuốc lá, 1 cây lúa và một vài cây A. thaliana chuyển gene. Kỹ thuật lai Southern cho thấy T-DNA đã được gắn vào genome cây thuốc lá khi sử dụng cả 3 chủng,A.thaliana và lúa khi sử dụng Sinorhizobium. Các cây này có chứa 1-3 bản sao T-DNA và các phân tích ở thế hệ sau cho thấy sự di truyền ổn định của gene GUS và kiểu hình kháng hygromycin. Để chứng tỏ rằng việc chuyển gene không phải do bị nhiễm tế bào Agrobacterium(họ chuyển gen cả bằng Agrobacterium đ ể so sánh), các thí nghiệm đối chứng đã đư ợc thiết lập bao gồm: PCR đặc hiệu [...]... này Chuyển gene bằng Agrobacterium vào thực vật đòi hỏi rất nhiều giấy tờ, chứng chỉ phức tạp và hiện vẫn đang bị hạn chế ở rất nhiều nước Lý do chính là Agrobacterium vẫn bị coi là nguồn bệnh (pathogen) thực vật do đặc tính bám và lây nhiễm rất mạnh của nó Agrobacterium gây ra các phản ứng nhiễm bệnh điển hình ở thực vật, gây stress, chết hoại và các hậu quả di truyền khác cho cây Trong khi đó, các... ủ, ở thuốc lá khi thay đổi tuổi mô và ở Arabidopsis khi thay đổi môi trường ngâm để nhiễm hoa với Sinorhizobium Vậy ý nghĩa của công trình này là g ? Nhiều loại cây lương thực quan trọng rất khó chuyển gene bằng Agrobaterium, khó tái sinh từ những mô mẫn cảm hoặc dễ bị thay đổi kiểu hình và di truyền khi sử dụng hệ thống chuyển gene này Chuyển gene bằng Agrobacterium vào thực vật đòi hỏi rất nhiều... (unpublished data) Còn hiệu quả của hệ thống chuyển gene này ra sao? Dựa trên số lượng các điểmb-glucuronidase dương tính, hiệu suất chuyển gene bằng các vi khuẩn khác ở thuốc lá khoảng 10-30% (so với 95-100% khi sử dụng Agro), 0,6% ở lúa (so với 50-80% khi sử dụng Agrobacterium) , và ở A thaliana, bằng 1/10 hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium với cùng quy trình Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gene này... quả nhấtRhizobium lại rất gần với Agrobaterium như lời các tác giả thừa nhận Điều này khiến người ta đặt ra câu hỏi liệu chủng này có thật sự khác biệt với Agrobacterium, đặc biệt là khi vẫn còn đang tranh cãi về mặt phân loại của những thuật ngữ này Do vậy, dường như có vẻ "an toàn" hơn nếu tập trung nghiên cứu vào Sinorhizobium và Mesorhizobium, cố gắng cải tạo hiệu suất chuyển gen vốn còn thấp của... hơn cho các loài, các mô hay các loại tế bào thực vật khó chuyển gene Và hơn hết, trái ngược với những đòi hỏi ngày càng phức tạp phức tạp về việc cấp phép, bản quyền khi sử hệ thống chuyển gene bằngAgrobacterium, rào cản lớn cho việc cộng tác nghiên cứu hay cho việc thương mại hóa các sản phẩm tạo ra nhờ nghiên cứu chuyển gene, công nghệ mới này được các nhà khoa học ở CAMBIA cung cấp hoàn toàn miễn . Can we do better than Agrobacterium ? Các phương pháp để đưa gene mới vào tế bào th ực vật có thể chia. hình kháng hygromycin. Để chứng tỏ rằng việc chuyển gene không phải do bị nhiễm tế bào Agrobacterium( họ chuyển gen cả bằng Agrobacterium đ ể so sánh), các thí nghiệm đối chứng đã đư ợc thiết. gene này. Chuyển gene bằng Agrobacterium vào thực vật đòi hỏi rất nhiều giấy tờ, chứng chỉ phức tạp và hiện vẫn đang bị hạn chế ở rất nhiều nước. Lý do chính là Agrobacterium vẫn bị coi là