Đang tải... (xem toàn văn)
Samonella typhi có chiều dài 23µm và đường kính 0.5 µm, cấu trúc gồm 2 màng: màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào. Màng trong và màng ngoài đều là các lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế bào. Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra khỏi tế bào chất 16.Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O. Ở Samonella typhi và Samonella paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân tử của acid N acetylglucosamine uronic nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao phủ kháng nguyên O. Samonella typhi còn mang các roi dài 2 – 5 µm là sự kéo dài của các thể nền bên trong tế bào. Hầu hết Salmonella được bao phủ bởi lớp lông giúp cho sự gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ. Những sợi lông này có đường kính khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợi roi, cấu trúc từ các tiểu đơn vị fimbrillin hoặc pilin
LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS. Nguyễn văn Duy, ThS. Trần Đình Quang - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn trực tiếp đề tài, các thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài này. Tôi xin được cảm ơn KS. Lã Văn Hiền cán bộ phòng thực hành Sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền khoa CNSH & CNTP cùng học viên cao học Phạm Văn Phúc cùng các bạn sinh viên khoa CNSH & CNTP làm nghiên cứu tại phòng. Tôi xin được cảm ơn TS. Lê Quang Hòa, Viện CNSH & CNTP trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, TS. Nguyễn Khắc Trung bộ môn cơ sở Đại học Y Dược Thái Nguyên, KS. Đỗ Bích Duệ và các cán bộ Viện Khoa Học Sự Sống - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cán bộ Trung tâm Y tế Dự Phòng Thái Nguyên đã cung cấp các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài này.Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ chúng tôi trong suốt thời gian qua, cảm ơn các cán bộ đang công tác tại phòng thí nghiệm khoa CNSH &CNTP đã tạo môi trường thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ, thầy cô, bạn bè tôi đã ủng hộ về mặt vật chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, tháng 6 năm 2012 Sinh viên Trịnh Thị Tuyết DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp Kauffmann- White 6 Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 28 Bảng 3.2 : Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 29 Bảng 3.3 : Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 4.2. Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Cấu trúc của vi khuẩn Salmonella typhi 7 Hình 4.1: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA 35 Đường chạy 1: Mẫu YD1;Đường chạy 2: Mẫu YD2 35 Hình 4.2: Kết quả khuếch đại vùng gen đặc hiệu của Salmonella typhi bằng phản ứng PCR sử dụng sản phẩm DNA tách chiết bằng hóa chất 37 Hình 4.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng các nồng độ khuôn DNA khác nhau 38 Hình 4.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở nhiệt độ gắn mồi và nồng độ MgCl2 khác nhau 40 Hình 4.5. So sánh hiệu quả tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp sốc nhiệt và hóa chất 43 Hình 4.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách chiết từ các loài vi khuẩn kiểm định 45 DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Từ, thuật ngữ đầy đủ 1 BGLS Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar 2 BSA Bismuth Suffite Agar 3 CFU Cell Forming unit – đơn vị đo khuẩn lạc 4 CIAA 24 Chloroform : 1 Isoamylacohol 5 Cs Cộng sự 6 CTAB Hexadecyltrimethylammonium Bromide 7 DNA Deoxynucleotideacid 8 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme 9 HE Hektoen Entric Agar 10 MLPA Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification 11 OD Optical Density – Giá trị mật độ quang 12 PBW Buffered Peptone Water 13 PCR Polymerase Chain Rection 14 PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis – Điện di trường xung 15 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA – Tính đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên 16 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn 17 SC Selenite Cystein Broth 18 SSR Inter - Simple sequence repeat 19 TAE Tris Acid acetic EDTA 20 TE Tris EDTA 21 TT Mueler Kauffman Broth 22 v/p Vòng/phút 23 XLD Xylose Lysine Desoxycholate Agar MỤC LỤC Trang Phần 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu nghiên cứu 2 1.4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella typhi 3 2.1.1. Trên thế giới 3 2.1.2. Ở Việt Nam 4 2.2. Tổng quan về Salmonella typhi 5 2.2.1. Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica serotype typhi 5 2.2.2. . Đặc điểm cấu trúc 7 2.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8 2.2.4. Đặc điểm di truyền 9 2.2.5. Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella typhi 9 2.3. Các phương pháp phân loại di truyền Salmonella typhi 13 2.3.1. Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống 13 2.3.2. Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp hiện đại 16 2.3.3 Tổng quan phương pháp PCR 22 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 27 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 27 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 27 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu 27 3.2.2. Thời gian nghiên cứu: 27 Từ 12/2012 – 05/2013 27 3.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 27 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu 27 3.3.2. Hóa chất 28 3.3.3. Thiết bị 29 3.4. Nội dung nghiên cứu 30 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 30 3.4.2. Xây dựng quy trình phát hiện Salmonella typhi bằng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 30 3.4.3. Đánh giá khả năng tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Salmonella typhi bằng phương pháp tách chiết hóa chất và phương pháp sốc nhiệt 30 3.4.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 30 3.5. Phương pháp nghiên cứu 30 3.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 30 3.5.2. Phản ứng PCR 31 3.5.3. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện của phản ứng PCR [ 5].32 3.5.4. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR [ 13] 33 3.5.5. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 33 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 4.1. Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 35 4.1.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng phương pháp sử dụng hóa chất 35 4.1.3. Kết quả kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết bằng phản ứng PCR. .36 4.2. Xây dựng quy trình phát hiện Salmonella typhi bằng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 38 4.2.1 Xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 38 4.2.2. Tối ưu phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 39 4.3. Đánh giá khả năng tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Salmonella typhi bằng phương pháp tách chiết bằng hóa chất và phương pháp sốc nhiệt 42 4.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR 44 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1. Kết luận 47 5.2. Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm lớn của nhiều quốc gia. Thực phẩm không đảm bảo yêu cầu sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ và tính mạng của người tiêu dùng và chất lượng cuộc sống của nhân dân cùng với sự phát triển kinh tế xã hội. Phần lớn các vụ ngộ độc đã xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao nhất (43,2%) [18]. Đặc biệt là vi khuẩn Salmonella typhi là thủ phạm gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Ngày nay người ta đã biết được tới trên 2500 chủng hoặc chủng huyết thanh của Salmonella [18]. Bệnh Salmonella trên người do vi khuẩn Salmonella typhi gây nên, chủ yếu lây nhiễm thông qua sử dụng các thực phẩm có nguồn gốc động vật bị nhiễm vi khuẩn này (chủ yếu là thịt, gia cầm, trứng và sữa). Trên thế giới, các vụ ngộ độc thực phẩm do Salmonella là rất phổ biến: tháng 7 năm 2007 tại Rumani có 117 người lớn và trẻ em bị ngộ độc do ăn bánh kem trong thời gian cắm trại, tháng 8 năm 2007, tại Hungary bùng nổ vụ ngộ độc tại nhà hàng Budapes làm 31 du khách ngộ độc. Tác nhân gây ngộ độc chủ yếu là các vi khuẩn thương hàn, trong đó hàng đầu là Salmonella typhi. Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này luôn bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra sinh hóa, tốn nhiều thời gian (thời gian phát hiện là 4 – 6 ngày), tốn nhiều công sức, gây khó khăn trong việc phân tích nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên nhân gây ngộ độc được nghi ngờ do Salmonella gây ra. Mặt khác quy trình phân tích này không cho phép phân biệt các loài hay loài phụ Salmonella với nhau. Sự phát hiện chậm các vi khuẩn sẽ làm cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Đã có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để phát hiện vi khuẩn gây bệnh có trong mẫu phân tích như lai DNA, kỹ thuật PCR, ELISA, 1 …Trong số các phương pháp trên, PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật đã được sử dụng phổ biến trong phát hiện nhanh nhiều loài vi khuẩn gây bệnh vì kỹ thuật này đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian chẩn đoán ngắn và không yêu cầu thiết bị phức tạp. Dựa vào việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu với vùng DNA đặc hiệu cho từng chủng, kỹ thuật PCR cho phép phát hiện đến mức độ chủng vi khuẩn gây bệnh. Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh Salmonella typhi là một đề tài có ý nghĩa thiết thực, góp phần vào việc kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm do Salmonella gây nên, đảm bảo sức khỏe cộng đồng. Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của Khoa CNSH và CNTP – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi trong thực phẩm”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Salmonella typhi trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao. 1.3. Yêu cầu nghiên cứu - Xây dựng được quy trình tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi phục vụ phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi - Tối ưu được điều kiện của phản ứng PCR phát hiện Salmonella typhi. - Xác định được giới hạn phát hiện, độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi trong thực phẩm. 1.4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Xây dựng thành công quy trình phát hiện nhanh và đặc hiệu Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm. Tạo tiều đề cho việc xây dựng bộ kít chẩn đoán nhanh Salmonella typhi dựa trên kỹ thuật PCR. - Giúp sinh viên rèn luyện các kỹ năng thí nghiệm, nghiên cứu, tác phong làm việc chủ động, khoa học. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh và đặc hiệu Salmonella typhi gây bệnh trong thực phẩm. 2 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella typhi 2.1.1. Trên thế giới Bệnh Salmonella là một trong những bệnh ngộ độc thực phẩm phổ biến và phân bố rộng rãi nhất. Mỗi năm thế giới đã ghi nhận hàng triệu ca bệnh trên người và bệnh đã gây ra hàng nghìn ca tử vong. Bệnh Salmonella do vi khuẩn Salmonella gây ra. Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện cách đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt (heo, bò, gia cầm…) và các sản phẩm của thịt, trứng, và các sản phẩm của trứng. Ở Đan Mạch 1995 có 2911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó có 19% gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng và các sản phẩm của trứng bị nhiễm vi khuẩn này . Gần đây ở Mỹ hàng năm có khoảng 4000 trường hợp bị bệnh do thực phẩm bị nhiễm Salmonella [20] . Năm 2000, người ta ước tính rằng hơn 2,16 triệu người mắc bệnh thương hàn trên toàn thế giới, kết quả là 216000 người chết và tỷ lệ tử vong cao xảy ra ở châu Á [31]. Ở Indonesia, tỷ lệ mắc bệnh thương hàn là 1487 nghìn người mỗi năm. Năm 2001 nghiên cứu của Swanen Burg và cộng sự cho thấy 26% thịt heo nhiễm Salmonella. Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là các vi khuẩn thương hàn, trong đó hàng đầu là Salmonella typhi. Bệnh Salmonella đã trở thành một gánh nặng y tế công cộng lớn và thể hiện bằng chi phí đáng kể ở nhiều quốc gia. Một số quốc gia đã tính toán chi phí kinh tế của bệnh. Ở Mỹ hàng năm ước tính có khoảng 1,4 triệu người nhiễm trùng Salmonella không phải thương hàn đã đưa đến 168000 lượt khám, 15000 lượt điều trị nội trú và 580 ca tử vong. Chi phí ước tính cho mỗi ca nhiễm Salmonella ở người dao động trong khoảng từ 40 đô la Mỹ đến 4,6 triệu đô la Mỹ tương ứng với từ các ca đơn giản đến các ca phải nhập viện và 3 [...]... tính của Salmonella typhi dựa trên trình tự gen 16S rRNA Pathmanathan S G và Castro N C (2003) đã đưa ra phương pháp phát hiện nhanh chóng và đơn giản chủng Salmonella bởi PCR bằng các khyếch đại gen hilA [28] *Trong nước Tại Việt Nam kỹ thuật PCR đã được ứng dụng nhiều để phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm như TS Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên và cs nhằm phát hiện ra Salmonella. .. tinh sạch DNA từ thực phẩm và môi trường trước khi thực hiện phản ứng PCR cho 24 phép loại bỏ những hợp chất ức chế Tuy nhiên một vài quy trình phát hiện sinh vật gây bệnh thực phẩm bằng PCR không cần tách chiết, tinh sạch DNA - Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy tăng sinh để có đủ mật độ cho phát hiện bằng PCR - Phương... Việt Nam cũng có các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện nhanh Salmonella như công trình của Nguyễn Trí Nhân, Nguyễn Hồng Nhã Trân, Đặng Thị Phương Thảo, Trần Linh Thước (2005) tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên H:g,m của Salmonella enterica trong tế bào Ecoli Trong nghiên cứu này với mục đích xây dựng quy trình ELISA phát hiện Salmonella trong thực phẩm thì các nhà khoa học đã... hàn cho người qua con đường thực phẩm Có rất nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện ra Salmonella typhi nhưng PCR đang được coi là một công cụ giúp cho các 25 nghiên cứu của các nhà khoa học tiến xa hơn Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu như Radji M (2010) đã nghiên cứu về quy tình phát hiện nhanh Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm và đồ uống bằng PCR sử dụng đoạn mồi thích hợp được... dày Berthier và Ehrlich (1998) xét nghiệm PCR cho phép xác định Lactobacillus curvatus, Lactobacillus graminis, Lactobacillus sake Brooks et al (1992) sử dụng PCR để khuyếch đại trình tự rDNA đặc hiệu của Carnobacterium spp [19] 2.3.3.5 Ứng dụng của kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi * Ngoài nước: Về khía cạnh vệ sinh an toàn thực phẩm, Salmonella typhi là chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm... Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc - Đòi hỏi người thực hiện phải thành thạo về thao tác 2.3.3.4 Ứng dụng của PCR trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh Bằng các khuếch đại đoạn nucleic acid đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm, thử nghiệm PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ... hiện nhanh Salmonella trong thịt gà [32] Mục đích của nghiên cứu này là nhằm tìm ra giới hạn phát hiện Salmonella, thời gian ủ bệnh ( 0h, 6h, 8h, 24h,48h trước khi làm giàu trong môi trường PBW 1%) và 3 phương pháp tách chiết DNA đó là Phenol- Chloroform, xử lý nhiệt, Sephaglass Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện vi khuẩn Salmonella là 10-9 CFU/ml, cho phép phát hiện trong vòng 48 giờ và sử dụng phương... xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát 19 hiện [27] Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu thực hiện qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch... thiết - Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với huyết thanh học, không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện tại hiện trường - Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa để giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm * Nhược điểm - Sự ức chế của Taq polymerase bởi thành phần của mẫu vật, mẫu thực phẩm thường có những thành phần... cs nhằm phát hiện ra Salmonella spp trong thực phẩm bằng phương pháp PCR [13] Nội dung của nghiên cứu này nhằm xác định giới hạn phát hiện và tính đặc hiệu của kỹ thuật PCR Th.S Nguyễn Thị Nga (2005) khảo sát đột biến gen mã hoá cho kháng nguyên của chủng Salmonella typhi phân lập được ở Việt nam Nội dung của nghiên cứu này nhằm khảo sát 26 tỷ lệ chủng Salmonella typhi đột biến mất gen mã hoá cho kháng