MỤC LỤC Tóm tắt nội dung khóa luận - 1 - Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG SINH HỌC - 2 - 1.1 Giới thiệu về công nghệ nano - 2 - 1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano - 2 - 1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano - 2 - 1.1.3 Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học - 4 - 1.2 Hạt nano bạc - 5 - 1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại - 5 - 1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc - 6 - 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc - 6 - 1.2.4 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại - 8 - 1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc - 9 - 1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc - 9 - 1.2.5.2 Ứng dụng của nano bạc - 11 - 1.3 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn - 15 - 1.3.1 Đường cong sinh trưởng - 15 - 1.3.1.1 Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase) - 15 - 1.3.1.2 Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase) - 16 - 1.3.1.3 Giai đoạn tử vong (Death Phase) - 17 - 1.3.2 Xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn - 17 - 1.3.2.1 Xác định số lượng tế bào - 17 - 1.3.2.2 Xác định khối lượng tế bào - 18 - Chương 2: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM - 20 - 2.1 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc - 20 - 2.1.1 Quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hóa học với bức xạ UV kích thích. - 20 - 2.1.1.1 Hóa chất thí nghiệm sử dụng: - 20 - 2.1.1.2 Thiết bị sử dụng - 20 - 2.1.1.3 Quy trình tổng hợp - 20 - 2.1.2 Cơ chế hình thành hạt nano bạc - 22 - 2.2 Ảnh hưởng của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn - 23 - 2.2.1 Phương pháp đo OD - 23 - 2.2.2 Các trang thiết bị - 24 - 2.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm - 24 - 2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường - 24 - 2.2.3.2 Cấy vi khuẩn - 25 - 2.2.3.3 Đo OD - 25 - Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 26 - 3.1 Phân tích dung dịch nano bạc - 26 - 3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt của dung dịch nano bạc - 28 - 3.3 So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn - 34 - Chương 4: KẾT LUẬN - 35 - - 1 - Tóm tắt nội dung khóa luận Từ xa xưa, con người đã sử dụng bạc làm các dụng cụ chứa đồ ăn, nước uống để trị bệnh. Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời. Ngày nay, cùng với sự ra đời và phát triển của công nghệ nano, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano. Điều này làm tăng đáng kể số ứng dụng của bạc. Ở kích thước nano, bạc thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh mà không gây ảnh hưởng tới con người và môi trường. Chính vì vậy, giới khoa học đang đầu tư nghiên cứu bạc để phục vụ cho các ứng dụng trong y học, nhất là khi hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như ngày nay. Chính vì vậy, trong khóa luận này, chúng tôi tập trung vào các nhiệm vụ sau: 1. Nghiên cứu quy trình công nghệ và tham gia thử nghiệm chế tạo hạt nano bạc 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano bạc lên sự phát triển (khả năng ức chế sự phát triển) của vi khuẩn gây bệnh đường ruột E. coli 3. Đánh giá hiệu quả ức chế của nano bạc với E. coli - 2 - Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG SINH HỌC 1.1 Giới thiệu về công nghệ nano 1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano Công nghệ nano là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanômét (nm, 1 nm = 10 -9 m) [3] . Ở kích thước nano, vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống không có được đó là do sự thu nhỏ kích thước và việc tăng diện tích mặt ngoài. Ý tưởng cơ bản về công nghệ nano được đưa ra bởi nhà vật lý học người Mỹ Richard Feynman vào năm 1959, ông cho rằng khoa học đã đi vào chiều sâu của cấu trúc vật chất đến từng phân tử, nguyên tử vào sâu hơn nữa. Nhưng thuật ngữ “công nghệ nano” mới bắt đầu được sử dụng vào năm 1974 do Nario Taniguchi một nhà nghiên cứu tại trường đại học Tokyo sử dụng để đề cập khả năng chế tạo cấu trúc vi hình của mạch vi điện tử [4] . 1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano Công nghệ nano dựa trên những cơ sở khoa học chủ yếu sau: - Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử: Đối với vật liệu vĩ mô gồm rất nhiều nguyên tử, các hiệu ứng lượng tử được trung bình hóa với rất nhiều nguyên tử (1 µm3 có khoảng 1012 nguyên tử) và có thể bỏ qua các thăng giáng ngẫu nhiên. Nhưng các cấu trúc nano có ít nguyên tử hơn thì các tính chất lượng tử thể hiện rõ ràng hơn. - Hiệu ứng bề mặt: Khi vật liệu có kích thước nm, các số nguyên tử nằm trên bề mặt sẽ chiếm tỉ lệ đáng kể so với tổng số nguyên tử. Chính vì vậy các hiệu ứng có liên quan đến bề mặt, gọi tắt là hiệu ứng bề mặt sẽ trở nên quan trọng làm cho tính chất của vật liệu có kích thước nanomet khác biệt so với vật liệu ở dạng khối. - 3 - - Kích thước tới hạn: Các tính chất vật lý, hóa học của các vật liệu đều có một giới hạn về kích thước. Nếu vật liệu mà nhỏ hơn kích thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi. Người ta gọi đó là kích thước tới hạn. Vật liệu nano có tính chất đặc biệt là do kích thước của nó có thể so sánh được với kích thước tới hạn của các tính chất của vật liệu [3] . Bảng 1: Độ dài tới hạn của một số tính chất của vật liệu [3] . Lĩnh vực Tính chất Độ dài tới hạn (nm) Tính chất điện Bước sóng điện tử 10-100 Quãng đường tự do trung bình không đàn hồi 1-100 Hiệu ứng đường ngầm 1-10 Tính chất từ Độ dày vách đômen 10-100 Quãng đường tán xạ spin 1-100 Tính chất quang Hố lượng tử 1-100 Độ dài suy giảm 10-100 Độ sâu bề mặt kim loại 10-100 Tính siêu dẫn Độ dài liên kết cặp Cooper 0,1-100 Độ thẩm thấu Meisner 1-100 Tính chất cơ Tương tác bất định xứ 1-1000 Biên hạt 1-10 Bán kính khởi động đứt vỡ 1-100 Sai hỏng mầm 0,1-10 Độ nhăn bề mặt 1-10 Xúc tác Hình học topo bề mặt 1-10 Siêu phân tử Độ dài Kuhn 1-100 Cấu trúc nhị cấp 1-10 Cấu trúc tam cấp 10-1000 Miễn dịch Nhận biết phân tử 1-10 - 4 - 1.1.3 Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học Do có nhiều tính năng độc đáo và kích thước tương đương với các phân tử sinh học nên hiện nay, công nghệ nano đang được đầu tư nghiên cứu đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh. Các ứng dụng tiêu biểu của công nghệ nano trong lĩnh vực này là: - Chẩn đoán: Sử dụng các hạt nano (hạt nano vàng, nano từ, chấm lượng tử…) để đánh dấu các phân tử sinh học, vi sinh vật, phát hiện các chuỗi gen nhờ vào cơ chế bắt cặp bổ xung của DNA hoặc cơ chế bắt cặp kháng nguyên – kháng thể. - Vận chuyển thuốc: Cung cấp thuốc cho từng tế bào cụ thể bằng cách sử dụng các hạt nano nhằm tiết kiệm thuốc và tránh các tác dụng phụ. - Mô kỹ thuật: Công nghệ nano có thể giúp cơ thể tái sản xuất hoặc sửa chữa các mô bị hư hỏng bằng cách sử dụng “giàn” dựa trên vật liệu nano và các yếu tố tăng trưởng [7] . Hình 1: Hạt nano vàng sử dụng trong truyền dẫn thuốc. - 5 - 1.2 Hạt nano bạc 1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại Cấu hình electron của bạc: 1s 2 2s 2 2p 6 3s 2 3p 6 3d 10 4s 2 4p 6 4d 10 5s 1 Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm Bán kính ion bạc: 0,23 nm Bảng 2: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích [14] . Kích thước của hạt nano Ag (nm) Số nguyên tử chứa trong đó 1 31 5 3900 20 250000 Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo sau [14] : - Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi xa, chống tĩnh. - Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không có phụ gia hóa chất. - Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như benzene, toluene). - Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường. - Chi phí cho quá trình sản xuất thấp. - Ổn định ở nhiệt độ cao. - 6 - 1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm . Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính độc với con người. Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh. Người cổ đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm. Trong thế kỷ 20, người ta thường đặt một đồng bạc trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa. Bạc và các hợp chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và khử trùng [10] . Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano. 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc Hình 2: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn. [...]... thiệu về hạt nano bạc Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng... - 19 - Chương 2: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc Trong nghiên cứu này, dung dịch nano bạc được cung cấp bởi Viện tiên tiến Khoa học và công nghệ (AIST) của Đại Học Bách Khoa Hà Nội Dung dịch nano bạc được chế tạo bằng kỹ thuật khử hóa học sử dụng bức xạ UV kích thích với chất hoạt động bề mặt là axit oleic 2.1.1 Quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc sử dụng kỹ thuật... peptidoglican ở thành tế bào của vi khuẩn gây ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn Và sau khi tác động lên màng tế bào vi khuẩn, các hạt nano bạc sẽ thâm nhập vào bên trong tế bào, tương tác với các enzym tham gia vào quá trình hô hấp dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của vi khuẩn Điều đáng chú ý là nồng độ tế bào trong tất cả các mẫu có chứa hạt nano bạc đều xấp xỉ nhau... dụng của nano bạc Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như: - Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt nano bạc có tác dụng khử trùng Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi khuẩn - 11 - Hình 8: Bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc -... Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi Hình 9: Tất làm bằng sợi nilon có pha nano bạc - 12 - - Các thiết bị điện tử: Điều hòa, tủ lạnh, máy giặt Hình 10: Điều hòa sử dụng bộ lọc nano bạc - Y tế: + Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệt... dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các thuộc tính trên - 10 - Hình 7: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc[ 10] Do hạt nao bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất Người ta xử dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc[ 12] 1.2.5.2... không có chứa hạt nano (ngoài cùng bên phải) bị vẩn đục chứng tỏ vi khuẩn phát triển mạnh Các bình còn lại có chứa các hạt nano bạc bình gần như không đổi mầu Trong 10 giờ đầu, mật độ vi khuẩn hầu như không đổi Trong giai đoạn này vi khuẩn bị ức chế do tác dụng của các ion bạc được giải phóng từ hạt nano bạc Tuy nhiên cấu trúc tế bào của vi khuẩn vẫn chưa bị phá hủy Sau 10 giờ, nồng độ vi khuẩn giảm mạnh... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích dung dịch nano bạc Hình 23: Dung dịch chứa hạt nano bạc ở các nồng độ khác nhau Phân tích phổ UV-VIS của mẫu dung dịch có nồng độ 100ppm cho thấy sự xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 422nm Điều này cho thấy sự có mặt của các hạt nano bạc trong dung dịch - 26 - Hình24: Phổ UV-VIS của dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm Kết quả phân tích từ ảnh TEM cho thấy các hạt. .. có khả năng kháng lại nano bạc tồn tại - 33 - 3.3 So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn Trong phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn, ta tẩm dung dịch nano bạc vào một đĩa giấy ở nồng độ nhất định, rồi đặt đĩa có tẩm đó lên mặt môi trường thạch có cấy vi khuẩn thử nghiệm trước đó Dung dịch nano bạc sẽ nhanh chóng khuếch tán trên môi trường thạch ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, ... ảnh TEM cho thấy các hạt nano trong dung dịch có hình cầu với kích thước trung bình khoảng 9-10 nm Các hạt nano bạc phân tán đều, không bị kết đám cho thấy hiệu quả của việc sử dụng axit oleic làm chất hoạt động bề mặt - 27 - Hình 25: Ảnh TEM của mẫu dung dịch nano bạc 3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt của dung dịch nano bạc Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E coli bằng phương . nghiệm chế tạo hạt nano bạc 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano bạc lên sự phát triển (khả năng ức chế sự phát triển) của vi khuẩn gây bệnh đường ruột E. coli 3. Đánh giá hiệu quả ức chế của nano. pháp chế tạo hạt nano kim loại - 8 - 1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc - 9 - 1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc - 9 - 1.2.5.2 Ứng dụng của nano bạc - 11 - 1.3 Sự sinh trưởng và phát. dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học - 4 - 1.2 Hạt nano bạc - 5 - 1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại - 5 - 1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc - 6 - 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc