i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lưu Thị Ngọc Huyền, Phó trưởng Bộ Môn Sinh Học Phân Tử, Viện Di Truyền Nông Nghiệp – Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn. Cô là người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Tôi xin gửi đến thầy, Th.S Lê Phương Chung lời cảm ơn sâu sắc nhất. Thầy đã truyền cho tôi những kiến thức, chỉ hướng đi tốt nhất trong công việc cũng như tận tụy hướng dẫn tôi trong học tập để đồ án của tôi được hoàn thiện. Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ: Ban Giám Hiệu, Ban Giám Đốc Viện cùng các thầy cô giáo trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang, các anh chị trong Viện Di Truyền Nông Nghiệp – Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè. Chính họ là nguồn cổ vũ, động viên, là chỗ dựa để tôi có thể hoàn thành đồ án. Sinh Viên Nguyễn Thị Thu Thủy ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Giới thiệu chung về vi tảo 2 1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi tảo 3 1.2.1. Trên thế giới 3 1.2.2. Trong nước 4 1.2.3. Giá trị dinh dưỡng của vi tảo 6 1.2.4 Ứng dụng của vi tảo 7 1.2.5. Loài tảo N.Oculata 11 1.2.5.1. Vị trí phân loại tảo N. Oculata 11 1.2.5.2. Đặc điểm hình thái 11 1.2.5.3. Đặc điểm sinh lý 12 1.2.5.4. Đặc điểm sinh hóa 12 1.2.5.5. Đặc điểm sinh trưởng 14 1.2.5.6. Thành phần dinh dưỡng và vai trò của tảo N.Oculata 15 1.2.5.7. Một số yếu tố ảnh hưởng của đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata 17 1.2.5.8. Tình hình nghiên cứu về tảo N. Oculata 20 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25 2.2. Vật liệu nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phân lập tảo N.Oculata 26 iii 2.3.2. Môi trường nuôi tảo 28 2.3.3. Phương pháp lưu giữ và bảo quản giống tảo 28 2.3.3.1. Lưu giữ trên môi trường thạch 29 2.3.3.2. Lưu giữ giống trên môi trường lỏng 30 2.3.4 Xác định các điều kiện tối ưu để nuôi cấy tảo N.Oculata 30 2.3.4.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến 30 2.3.4.2. Phương pháp xác định mật độ tảo 32 2.3.4.3 Xác định nhiệt độ tối ưu 33 2.3.4.4 Xác định cường độ ánh sáng tối ưu. 34 2.3.4.5 Xác định độ mặn tối ưu 35 2.3.4.6 Xác định chu kỳ chiếu sáng tối ưu 36 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Kết quả phân lập tảo N.Oculata 38 3.2. Lưu giữ, bảo quản và nhân giống tảo N. Oculata 39 3.2.1 Lưu giữ và bảo quản giống 39 3.2.2 Nhân giống các cấp 40 3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện tối ưu đến sinh trưởng, phát triển của tảo N.Oculata 41 3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 41 3.3.2 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng 45 3.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn 48 3.3.4 Ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54 1. Kết luận 54 2. Đề xuất 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 52 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần sinh hóa của một số loài tảo 7 Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của môi trường F/2 28 Bảng 3.1: Mật độ tảo cực đại ở các mức nhiệt độ khác nhau 44 Bảng 3.2: Mật độ tảo cực đại ở cường độ ánh sáng khác nhau 47 Bảng 3.3: Mật độ tảo cực đại ở độ mặn khác nhau 49 Bảng 3.4: Mật độ tảo cực đại ở chu kỳ chiếu sáng khác nhau 52 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh của N.Oculata qua kính hiển vi 11 Hình 1.2: Thành phần acid béo của các nhóm lipid chính trong Nannochloropsis sp.13 Hình1.3. Đường cong sinh trưởng của vi tảo N.Oculata 15 Hình 1.4. Các đối tượng sử dụng thức ăn là vi tảo biển 16 Hình 2.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến 31 Hình 2.2. Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata 34 Hình 2.3. Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata 35 Hình 2.4. Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của độ mặn đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata 36 Hình 2.5. Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của độ dài chiếu sáng đến sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata 37 Hình 3.1. Quá trình phân lập giống tảo thuần N.Oculata đã được phân lập 38 Hình 3.2. Lưu giữ tảo trên môi trường thạch nghiêng và môi trường lỏng trong tủ lạnh (A và B) hoặc trong môi trường lỏng ánh sáng yếu ở nhiệt độ 25 o C (C và D).40 Hình 3.3. Tảo giống các cấp 41 Hình 3.4. Biến động mật độ trung bình tảo N. Oculata theo nhiệt độ 43 Hình 3.5. Biến động mật độ tảo N. Oculata theo cường độ ánh sáng 45 Hình 3.6. Lô thí nghiệm nuôi tảo tại các cường độ ánh sáng khác nhau 46 Hình 3.7. Biến động mật độ tảo N. Oculata theo độ mặn khác nhau 48 Hình 3.8. Lô thí nghiệm nuôi tảo ở các độ mặn khác nhau 25‰ (A), 30‰ (B) và 35‰ (C) 50 Hình 3.9. Biến động mật độ tảo N. Oculata theo chu kỳ chiếu sáng khác nhau 51 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT % Phần trăm ‰ Phần nghìn H Giờ & Và Tb/ml Tế bào/mililít ml, L Mililít, Lít T o Nhiệt độ CĐCS Cường độ chiếu sáng ĐM Độ mặn CKCS Chu kỳ chiếu sáng 1 MỞ ĐẦU Trên thế giới, vi tảo biển đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học và kinh doanh sản xuất thủy sản. Tảo biển ngày càng trở nên quan trọng, chúng đóng góp khoảng 40-50% lượng oxy trong khí quyển hay là lượng oxy trong quá trình hô hấp của sinh vật. Tảo biển là nguồn gốc tạo ra cacbon hóa thạch trong dầu thô và khí gas tự nhiên. Bên cạnh đó, tảo biển là nguồn thức ăn chính của hầu hết các loài sinh vật biển [27]. Tại Việt Nam công nghệ nuôi tảo còn quá lạc hậu, chỉ theo các phương pháp cổ truyền, bán liên tục như nuôi kín trong bịch nylon, nuôi hở trong bể xi măng, bể sợi thủy tinh chắc chắn không đảm bảo về mặt số lượng lẫn chất lượng con giống…đã và đang làm hạn chế quy mô và công suất của các trại sản xuất giống. Việc nuôi không ổn định, rủi ro do bị nhiễm bẩn và tàn lụi đột ngột, mật độ thấp là những vấn đề tồn tại đối với bất kỳ hoạt động nuôi sinh khối các loài vi tảo đơn bào hiện nay. Vì vậy, cần phải có giải pháp về kỹ thuật nuôi nhằm ổn định việc nuôi, đảm bảo chất lượng tảo tốt. Người ta đã nghiên cứu một số loài vi tảo biển nuôi trồng để thu sinh khối đạt giá trị cao như: Chlorella, Nanochloropsis Oculata, Dunaliella, Spirulina Trong đó tảo Nanochloropsis Oculata là loài hiện nay có rất nhiều ứng dụng thực tiễn nên chúng là đối tượng đang được chú ý đặc biệt trong nuôi trồng nhằm thu sinh khối: làm thức ăn cho tôm, các loài động vật hai mảnh vỏ hay là một nguồn nguyên liệu mới trong ngành công nghiệp sản xuất dầu sinh học, chế biến và sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm… Nhưng vấn đề đặt ra là chưa có một công thức dinh dưỡng và điều kiện môi trường nuôi cấy cụ thể nào được đưa ra để áp dụng trong việc nuôi loại tảo này. Vì vậy mà tôi thực hiện đề tài: "Phân lập, bảo quản, nghiên cứu một số điều kiện thích hợp cho nuôi trồng tảo N.Oculata". Mục tiêu của đề tài là phân lập, bảo quản và nghiên cứu các điều kiện thích hợp để nuôi trồng loài tảo N.Oculata. Từ đó đề xuất quy trình hoàn thiện nuôi sinh khối tảo N.Oculata. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về vi tảo Vi tảo là những sinh vật xuất hiện sớm trên trái đất, trải qua hàng tỷ năm tiến hóa, được xem như là sinh vật có cấu trúc hình thái đa dạng nhất [33]. Sự phân bố và nơi sống của vi tảo rất đa dạng, chúng có thể sống và phát triển ở các vùng ẩm ướt, thủy vực, biển sâu cho đến các vùng có băng tuyết và sa mạc nóng bức Chúng có kích thước hiển vi mà mắt thường không nhìn thấy được và có chứa ít nhất một loại sắc tố chlorophyll - chlorophyll 1. Là một cấu thành quan trọng của các sinh vật phù du, tạo nên năng suất sơ cấp của thủy vực và giữ một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự phát triển của hệ sinh thái [24]. Là sinh vật có khả năng quang hợp, tạo ra các sản phẩm hữu cơ từ các chất vô cơ (H 2 O, CO 2 ) nhờ vào khả năng hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời [4]. Do vậy, ở trong các thủy vực vi tảo tạo nên năng suất sơ cấp khởi đầu trong chuỗi thức ăn, nền đáy của tháp dinh dưỡng trong hệ sinh thái. Không giống với thực vật bậc cao, vi tảo là những sinh vật đơn bào, tập đoàn hay dạng sợi phát triển đơn giản, hệ số vòng đời ngắn, tốc độ sinh trưởng nhanh, sử dụng năng lượng ánh sáng cao và thành phần sinh hóa thay đổi theo thành phần dinh dưỡng và các yếu tố môi trường sống [25]. Hiện nay, trên trái đất có khoảng 20.000 loài vi tảo, trong số đó có một số loài có giá trị kinh tế cao đã được dùng trong nuôi trồng thủy sản, chế biến thực phẩm như: Chaetoceros, Scenedesmus, Chlorella, Spirulina Trước tiềm năng đó, công nghệ vi tảo đang lôi cuốn sự chú ý của nhiều nhà khoa học tại nhiều nước trên thế giới, nhằm khai thác nguồn lợi to lớn của vi tảo phục vụ cho con người [11],[15]. 3 1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi tảo 1.2.1. Trên thế giới Việc nghiên cứu tảo có từ lâu đời, nó gắn liền với sự ra đời của kính hiển vi quang học và việc tìm thấy tế bào đầu tiên do nhà tự nhiên học người Anh R.Hooke khám phá ra vào năm 1665. Tuy nhiên, mãi đến năm 1910, Allen và Nelson lần đầu tiên đã nuôi tảo Silic để làm thức ăn cho một số động vật không xương sống, mở ra một bước tiến mới trong quá trình nuôi trồng tảo [21]. Ngày nay công nghệ sinh học phát triển nhanh tạo một cuộc cách mạng trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, vật liệu mới và bảo vệ môi trường. Ở phạm vi hẹp hơn chúng ta đang chứng kiến sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sản xuất vi tảo trên thế giới do nhiều ưu thế của cơ thể so với thực vật bậc cao như vòng đời ngắn, năng suất cao, hiệu số sử dụng ánh sáng cao, công nghệ sản xuất không phức tạp, thích hợp với quy mô sản xuất công nghiệp. Khoảng 1/3 sinh khối thực vật trên thế giới là sinh khối tảo. Trong tổng số khoảng 25.000 loài vi tảo hiện nay có khoảng 50 loài được nghiên cứu tỉ mỉ về mặt sinh hóa, sinh lý và sinh thái học. Cho đến nay hàng loạt các công nghệ nuôi trồng, thu hoạch chế biến sinh khối tảo đang không ngừng được hoàn thiện , hạ giá thành và nâng cao chất lượng sinh khối [7]. Mặt khác sử dụng vi tảo đang được mở rộng trong các lĩnh vực khác nhau và được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu công nghệ sản xuất vi tảo đại trà. Vào đầu năm 1940 ở Đức bắt đầu có những thực nghiệm nuôi trồng đại trà Chlorella sau khi người ta thấy tế bào tảo này có tới 50% protein trong sinh khối khô và có khả năng tăng sinh khối gấp nhiều lần trong ngày [30]. Đầu những năm 1950 các nhà khoa học Mĩ đã bắt đầu nuôi đại trà tảo Chlorella. 4 Năm 1953, các nhà khoa học Đức đã nghiên cứu khả năng dùng CO 2 , phế thải của nhà máy công nghiệp vùng Rhur để nuôi trồng tảo Chlorella và Scenedesmus acutus.Nghiên cứu này được giáo sư Soeder và cộng sự được tiếp tục tiến hành trong nhiều năm sau đó. Cũng loài tảo này, năm 1957, Tamiya và cộng sự ở Viện Sinh học Tokugama (Tokyo) đã công bố các kết quả nuôi trồng tảo Chlorella ở ngoài trời và cũng từ Chlorella họ chiết ra một hợp chất gọi là “nhân tố sinh trưởng Chlorella” cùng với 15 loại vitamin khác nhau, được ứng dụng rộng rãi trong y học [37]. Năm 1960 tại Tiệp Khắc các nhà khoa học đã xây dựng một mô hình nuôi tảo đại trà Scenedesmus trên nền bể có độ nghiêng 3 0 và tạo dòng chảy nhờ bơm kĩ thuật Cascade. Mô hình bể này được ứng dụng thành công tại Rupite, Bungart- một địa danh có suối nước nóng nổi tiếng để sản xuất đại trà tảo Chlorella và Scenedesmus. Ở Nhật Bản đã sản xuất tảo Chlorella đạt sản lượng 1100 tấn/năm và Trung Quốc sản xuất 2798 tấn/năm tảo Spirulina để xuất khẩu. Đầu năm 1960, vi khuẩn lam Spirulina lần đầu tiên được phát hiện tại hồ Tchad, Châu Phi và nhanh chóng được các nhà khoa hcoj pháp nuôi đại trà Mehico. Năm 1996 - 1997, Nhật Bản nuôi N.Oculata làm thức ăn cho trùng bánh xe rất phổ biến. Tại Oxtraylia các loài tảo đơn bào như Tetraselmis sp, Palova lutheri được nuôi phổ biến làm thức ăn cho động vật thân mềm. [34]. Ngoài ra một số vi tảo khác như Dunaliella (có nguồn caroten và gliceron) và Porphyridium (có nguồn polisaccarit và phycoerythrin) đã và đang được đưa vào nuôi trồng với quy mô nhỏ. 1.2.2. Trong nước Tại Việt Nam, những nghiên cứu về tảo đã được thực hiện từ rất lâu, chủ [...]... Xác định các điều kiện tối ưu để nuôi cấy tảo N.Oculata 2.3.4.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến Để xây dựng quy trình nuôi sinh khối N Oculata cần dựa trên kết quả thu được từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, độ mặn, ánh sáng) lên sinh trưởng và phát triển của tảo N Oculata Từ đó xây dựng quy trình nuôi phù hợp cho N Oculata trong điều kiện phòng thí... công nghệ nuôi tảo ngày càng được phát triển Người ta nghiên cứu các cơ sở sinh lý, sinh hóa và các kĩ thuật nuôi sinh khối một số loài vi tảo ( Spirulina, Chlorella, Dunadiella, Chaetoceros ) làm thuốc, thực phẩm chức năng và thức ăn tươi sống, nhân tạo cho nuôi trồng thủy sản Bên cạnh đó thì công nghệ nuôi trồng và sử dụng tảo đang ngày càng phát triển mạnh mẽ đặc biệt là việc sử dụng tảo để sản... như không được tảo sử dụng Do đó cần phải có biện pháp bổ sung CO2 khi nuôi đại trà [7] 1.2.5.8 Tình hình nghiên cứu về tảo N Oculata a Tình hình nghiên cứu trên thế giới Để phục vụ cho mục đích nuôi thủy sản, nhiều loài vi tảo trong đó có N Oculata đã được nghiên cứu và nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm hoặc ở quy mô sản xuất thử nghiệm Theo Wendy & Kevan (1991), ở Hoa Kỳ các loài tảo Thalasiossira... khối tảo Silic làm thức ăn cho ấu trùng tôm mang tính chất phục vụ sản xuất là chính đồng thời tiến hành một số thí nghiệm nghiên cứu cơ bản Năm 1974 một số thí nghiệm nuôi tảo Skeletonema costatum trong điều kiện phòng thí nghiệm được tiến hành ở trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang Cũng loài tảo này năm 1989 tại trung tâm nghiên cứu thủy sản III, Nguyễn Thị Xuân Thu và các cộng tác viên đã tiến hành một. .. nghiên cứu 2.3.1 Phân lập tảo N.Oculata Chủng tảo N.Oculata sử dụng trong nghiên cứu được thu thập và phân lập từ nước biển Hạ Long Việc phân lập tảo được làm qua các bước sau: Lấy mẫu ở biển Kiểm tra các điều kiện (nhiệt độ, pH, độ mặn ) Lọc mẫu Nuôi bằng cách bổ sung môi trường F/2 vào nước biển Cấy chuyền nhiều lần trên môi trường thạch F/2( pha loãng các tỉ lệ khác nhau để thu được khuẩn lạc, kết hợp. .. ảnh hưởng trên cả phương diện số lượng và chất lượng của tảo N.Oculata Các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tảo N.Oculata bao gồm: nhóm nitơ (một số hợp chất muối nitơ như NaNO3, KNO 3 ), nhóm phốt pho (một số hợp chất muối phốt pho NaH 2PO4, KH2PO4), các nguyên tố vi lượng (hợp chất chứa Co, Cu, Fe…), vitamin (B6, B12, B1…) và một số nhóm chất khác Nitơ chiếm từ... nghiệm, cho thấy việc bổ sung vi tảo N.Oculata vàotrong nước nuôi sẽ mang lại hiệu quả tích cực trong việc duy trì chất lượng nước và tăng cường chất dinh dưỡng cho luân trùng [28] Converti & cs (2009) tiến hành nghiên cứu về sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên mức độ sinh trưởng và hàm lượng lipid đối với N.Oculata nhằm ứng dụng cho việc nuôi cấy loài vi tảo này phục vụ cho sản xuất biodiesel Trong nghiên cứu. .. cacbohydrat, và một số chất chống ôxy hoá khác Có thể nói rằng hiện nay, tảo được khai thác dưới góc độ là nguồn thức ăn dinh dưỡng cho người và thức ăn cho động vật, nguồn hóa chất và dược liệu, nguồn phân bón sinh học và đối tượng sinh học để xử lý môi trường Cụ thể một số ứng dụng công nghệ vi tảo trong cuộc sống như: * Nguồn thức ăn cho người và động vật : - Sử dụng vi tảo cho người: Bất cứ một loại protein... thì tảo thường hay sốc và ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của vi tảo như sự vận chuyển các chất qua màng và sự phân chia 19 tế bào bị dừng lại Nhìn chung, phổ chịu muối của vi tảo là rất rộng Tảo N.Oculata cũng thuộc loài rộng muối thích ứng trong khoảng 10 - 35‰ [8] Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về phạm vi ảnh hưởng của độ mặn lên sự phát triển của vi tảo này Tuy những nghiên cứu này đều khẳng... động theo cùng một nguyên lý và ưu điểm đều là năng suất mật độ cao, ít tốn công lao động không bị nhiễm tạp trong quá trình nuôi, tảo thu đạt chất lượng cao [16] 23 b Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở nước ta, những năm gần đây vi tảo N.Oculata được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản, nên đã có nhiều nghiên cứu về nó nhưng chỉ dừng ở mức ứng dụng trong thủy sản Như trong nghiên cứu về quy trình . hi n đề tài: " ;Ph n lập, bảo qu n, nghi n cứu một số điều ki n thích hợp cho nuôi trồng tảo N. Oculata& quot;. Mục tiêu của đề tài là ph n lập, bảo qu n và nghi n cứu các điều ki n thích hợp. chức n ng và thức n tươi sống, nh n tạo cho nuôi trồng thủy s n. B n cạnh đó thì công nghệ nuôi trồng và sử dụng tảo đang ngày càng phát tri n mạnh mẽ đặc biệt là việc sử dụng tảo để s n xuất. ti n hành một số thí nghiệm nghi n cứu cơ b n. N m 1974 một số thí nghiệm nuôi tảo Skeletonema costatum trong điều ki n phòng thí nghiệm được ti n hành ở trường Đại Học Thủy S n Nha Trang.