i L I C M ƠN Trư c tiên, xin bày t lòng bi t ơn chân thành sâu s c nh t n cô Nguy n Th Ng c Thanh th y Nguy n Văn Duy, Vi n Công ngh sinh h c Môi trư ng, Trư ng i h c Nha Trang ã t n tình hư ng d n, d y b o t o m i i u ki n cho tơi hồn thành án t t nghi p Tơi xin bày t lòng bi t ơn sâu s c Môi trư ng, Trư ng n Ban lãnh o Vi n Công ngh sinh h c i h c Nha Trang th y cô B môn Công ngh môi trư ng ã quan tâm, ch b o gi ng d y nhi t tình, giúp tơi có c nh ng ki n th c quý báu su t th i gian h c t p t i trư ng Tôi xin chân thành c m ơn n ch Nguy n Minh Nh t, cán b qu n lý phịng thí nghi m Công ngh sinh h c ã t o môi trư ng thu n l i giúp tơi hồn thành khóa lu n Cu i cùng, xin bày t lịng bi t ơn chân thành ngư i ln quan tâm giúp , ng viên, n gia ình, b n bè, nh ng ng th i ch d a tinh th n r t l n giúp tơi hồn thành t t m i công vi c c giao su t th i gian h c t p th c hi n án án v a qua Nha Trang, tháng năm 2012 Sinh viên Bùi Vĩnh i ii M CL C L I C M ƠN i M C L C ii DANH M C CÁC T , KÝ HI U VI T T T v DANH M C B NG vi DANH M C HÌNH vii M U CHƯƠNG I T NG QUAN .3 1.1 T ng quan v cá chim vây vàng 1.1.1 Gi i thi u chung v cá chim vây vàng .3 1.1.2 Tình hình nghiên c u cá chim vây vàng th gi i nư c 1.1.2.1 Tình hình nghiên c u cá chim vây vàng th gi i 1.1.2.2 Tình hình nghiên c u cá chim vây vàng Vi t Nam 1.2 T ng quan v bacteriocin 1.2.1 Gi i thi u v bacteriocin 1.2.1.1 Gi i thi u chung 1.2.1.2 Khái ni m 1.2.1.3 Phân lo i 1.2.1.4 M t s tính ch t c a bateriocin 14 1.2.1.5 Cơ ch ho t ng c a bacteriocin 14 1.2.1.6 M t s l i ích h n ch c a bacteriocin 17 1.2.1.7 ng d ng c a bacteriocin ngành công nghi p th y s n 18 1.2.2 Tình hình nghiên c u v bacteriocin Th gi i Vi t nam .24 1.2.2.1 Trên Th gi i .24 1.2.2.2 Vi t Nam 27 1.3 Tình hình ni tr ng th y s n v n nuôi tr ng th y s n Vi t Nam th gi i 28 1.3.1 Tình hình ni tr ng th y s n Vi t Nam th gi i 28 iii 1.3.1.1 Trên th gi i 28 1.3.1.2 Vi t Nam 31 1.3.2 Các v n phát sinh nuôi tr ng th y s n 34 1.3.2.1 D ch b nh nuôi tr ng th y s n 34 1.3.2.2 M t s v n môi trư ng nuôi tr ng th y s n 37 CHƯƠNG II NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 39 2.1 Nguyên v t li u .39 2.1.1 M u cá chim vây vàng 39 2.1.2 Ch ng vi khu n ch th .39 2.1.3 Thi t b chuyên d ng 40 2.1.4 Hóa ch t, mơi trư ng thu c th 40 2.1.4.1 Môi trư ng phân l p vi khu n 40 2.1.4.2 Hóa ch t thu c th 41 2.2 Phương pháp nghiên c u 43 2.2.1 Phân l p n ch n ch ng VK bi n có kh sinh bacteriocin t ru t cá chim vây vàng 44 2.2.1.1.Phân l p vi khu n 44 2.2.1.2 Gi gi ng c y chuy n 46 2.2.1.3 Tuy n ch n ch ng vi khu n sinh bacteriocin 47 2.2.2 Xác nh m t s c i m sinh h c phân lo i ch ng vi khu n bi n sinh bacteriocin phân l p t ru t cá chim vây vàng 50 2.2.2.1 C y i m xác 2.2.2.2 Xác nh hình thái khu n l c nhu m Gram 50 nh kh ch u mu i c a m t s ch ng vi khu n sinh bacteriocin .52 2.2.3 nh danh vi khu n 52 2.3 Phương pháp x lý s li u 53 CHƯƠNG III K T QU VÀ TH O LU N 54 3.1 K t qu phân l p vi khu n bi n t cá chim vây vàng 54 iv 3.2 K t qu n ch n ch ng vi khu n bi n sinh bacteriocin phân l p t ru t cá chim vây vàng 58 3.2.1 K t qu n ch n sơ b tính i kháng c a ch ng vi khu n phân l p v i ch ng vi khu n ích Bacillus B1.1 Vibrio V1.1 58 3.2.2 K t qu ki m tra v i enzym proteinase K trypsin .60 3.3 M t s c i m sinh h c, phân lo i nh danh ch ng vi khu n bi n sinh bacteriocin phân l p t ru t cá chim vây vàng 63 3.3.1 Hình thái khu n l c nhu m Gram .63 3.3.2 Kh ch u mu i 64 3.3.3 nh danh ch ng vi khu n bi n sinh bacteriocin 65 K T LU N VÀ KI N NGH 68 TÀI LI U THAM KH O PH L C v DANH M C CÁC T , KÝ HI U VI T T T TT Ký hi u vi t t t Nghĩa BLIS Bacteriocin-like substance DNA Deoxyribonucleotide Acid LAB Lactic Acid Bacteria NTTS Nuôi tr ng th y s n PE Polyetylen PCR Polymerase Chain Reaction TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TSA Tryptone Soya Agar TSB Tryptone Soya Broth 10 VK Vi khu n 11 VSV Vi sinh v t vi DANH M C B NG B ng 1.1 Bacteriocin kháng sinh (Cleveland et al.,2001) B ng 1.2 Tóm t t c i m c a bacteriocin 12 B ng 1.3 Phân lo i bacteriocin .13 B ng 1.4 Ví d v th nghi m bacteriocin s n ph m th y s n (Adapted from Galvez et al 2008) 20 B ng 1.5 M t s bacteriocin t vi khu n bi n 26 B ng 1.6 S n lư ng nuôi tr ng th y s n Th gi i năm 2001 theo vùng nư c 29 B ng 1.7 Di n tích m t nư c nuôi tr ng thu s n năm 2006–2010 31 B ng 1.8 Các loài di n tích ni tr ng th y s n khu v c Nam Trung B .32 B ng 1.9 S n lư ng nuôi tr ng th y s n kim ng ch xu t kh u th y s n năm 2006 – 2010 .33 B ng 2.1 M u cá chim vây vàng 39 B ng 2.2 Thành ph n môi trư ng TSB t ng h p (trong 1000ml) 40 B ng 3.1 S khu n l c m c ĩa petri n ng khác 54 B ng 3.2 S ch ng vi khu n phân l p t ru t cá chim vây vàng 55 B ng 3.3 K t qu phân l p ch ng vi khu n t ru t cá chim vây vàng l n th nh t 56 B ng 3.4 K t qu phân l p ch ng vi khu n t ru t cá chim vây vàng l n th hai 57 B ng 3.5 B ng kh o sát kh kháng khu n c a d ch ngo i bào c a vi khu n phân l p t ru t cá chim vây vàng 58 B ng 3.6 K t qu sau x lý enzym proteinase k c a ch ng c n ch n i v i vi khu n ích Bacillus B1.1 60 B ng 3.7 K t qu sau x lý enzym trypsin c a ch ng c n ch n i v i vi khu n ích Bacillus B1.1 61 B ng 3.8 c i m hình thái khu n l c t bào c a ch ng vi khu n n ch n 63 B ng 3.9 K t qu v kh ch u mu i c a ch ng Cr15 .64 B ng 3.10 So sánh trình t o n gen 16S rDNA c a ch ng Cr15 v i trình t tương ng Genbank b ng công c BLAST 67 vii DANH M C HÌNH Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) Hình 1.2 Sơ phân lo i bacteriocin c a Klaenhammer Cotter .10 Hình 1.3 C u trúc minh h a Bacteriocin thu c nhóm II 11 Hình 1.4 Hình nh minh h a c u t o c a Daptomycin 12 Hình 1.5 Ki u ho t ng c a bacteriocin .16 Hình 1.6 S lư ng báo nghiên c u v bacteriocin m i th i kỳ 10 năm t 1950-2010 c trích d n Pubmed 25 Hình 2.1 Cách ti p c n n i dung nghiên c u tài 43 Hình 2.2 Quá trình phân l p vi sinh v t 44 Hình 2.3 Hình minh h a bư c c y ria thu n t khu n l c 45 Hình 2.4 Quy trình th tính i kháng c a d ch VK phân l p i v i ch ng ch th (Bacillus B1.1 Vibrio V1.1) 48 Hình 2.5 Hình nh minh h a bư c nhu m Gram 52 Hình 3.1 Khu n l c m c riêng r ĩa th ch pha loãng 10-6 10-7 55 Hình 3.2 Các ch ng vi khu n c y ria ĩa petri 55 Hình 3.3 Vịng kháng khu n c a m t s ch ng phân l p i v i Baciluss B1.1 59 Hình 3.4 K t qu ki m tra d ch bacteriocin c a ch ng vi khu n Cr11, Cr15 v i enzym proteinase K môi trư ng TSA, ch ng ch th Bacillus B1.1 .62 Hình 3.5 K t qu ki m tra d ch bacteriocin c a ch ng vi khu n Cr9 v i enzym trypsin môi trư ng TSA, ch ng ch th Bacillus B1.1 63 Hình 3.6 Hình thái khu n l c t bào ch ng Cr15 dư i phóng i X-100 64 Hình 3.7 Kh ch u mu i c a ch ng Cr15 65 Hình 3.8 Trình t o n gen 16S rDNA c a ch ng Cr15 (1290 bp) 66 M Nư c ta n m dày vùng nhi t i gió mùa c v i 3.260km b bi n, 3000 hình vùng nư c th m l c chu i U ông Nam Á v i h th ng sông su i o, qu n o h sinh thái i n a r ng l n r n san hô, r ng ng p m n, m phá ven bi n, h c a sông…Chúng không ch nơi sinh s ng, ti n hóa phát tri n hưng th nh c a hàng v n lồi th y sinh v t mà cịn s r t quan tr ng cho s phát tri n kinh t -xã h i nói chung hay ngh cá c a nư c ta nói riêng NTTS hi n m t nh ng lĩnh v c s n xu t th c ph m phát tri n m nh nh t nư c ta Ho t ng nuôi tr ng th y s n ang t o ngu n thu nh p cho ngư dân vùng ven bi n nư c ta nh có i u ki n t nhiên phù h p cho ni tr ng m t s lồi h i s n nh ó có ngu n thu l n t xu t kh u Tuy nhiên, d ch b nh thư ng xuyên x y ã gây thi t h i kinh t hàng tri u ô la M m i năm Trong tác nhân gây b nh vi khu n, i n hình loài Vibrio, c coi m t nh ng nguyên nhân Hơn n a, v i bi n nh ng quan ng i i khí h u toàn c u, i v i VK gây b nh ngày tăng lên, b i nhi t cao kh gây b nh truy n nhi m tăng lên Ch t kháng sinh dư ng ã m t hi u qu nuôi tr ng th y s n vi c l m d ng m c Vi c s d ng ch t kháng sinh không ch làm tăng kh kháng b nh c a VK, phá v h vi sinh bình thư ng gây hi n tư ng m t cân b ng vi sinh mà cịn làm tích lũy g c kháng sinh s n ph m th y s n có h i cho s c kh e ngư i tiêu dùng Vì v y, gi i pháp thay th thân thi n v i môi trư ng s d ng vaccine, ch t kháng sinh th h m i hay probiotic ã c xu t (Corripio-Myar et al ,2007; Smith, 2007) Tuy nhiên, s d ng vaccine thư ng t n chi phí s n xu t, chi phí nhân cơng gây stress m nh cho ng v t nuôi Do v y, vi c s d ng VK sinh bacteriocin có th gi i pháp thay th r t phù h p v i vai trị kép b i bacteriocin s m t ch t kháng sinh th h m i an toàn thân thi n v i s c kh e ngư i môi trư ng, ó vi khu n óng vai trò c a probiotic Nghiên c u phân l p m t s ch ng VK có kh sinh bacteriocin thư ng c ng d ng nhi u ngành ch bi n b o qu n th c ph m, cịn khơng ch i v i ngành NTTS v n r t m i m chưa c nghiên c u nhi u Vi t Nam mà bình di n qu c t tài:‘‘Nghiên c u kh kháng Xu t phát t th c t trên, ch n khu n c a ch ng vi khu n bi n sinh bacteriocin phân l p t ru t cá chim vây vàng nh m làm nh hư ng ng d ng nuôi tr ng th y s n b n v ng’’ án t t nghi p N i dung th c hi n: 1) Thu m u cá chim vây vàng t i tr i nuôi cá Vũng Ngán-Nha Trang-Khánh Hòa 2) Phân l p vi khu n t ng s t ru t cá chim vây vàng 3) Tuy n ch n ch ng sinh bacteriocin kháng ch ng vi khu n ích Bacillus B1.1 Vibrio V1.1 4) Nghiên c u m t s bacteriocin c i m sinh h c c a ch ng vi khu n sinh nh danh Vi c th c hi n thành công tài s óng góp nhi u ý nghĩa v khoa h c th c ti n, b sung vào b sưu t p ch ng VK bi n có ho t tính sinh h c, ch ng có th lồi m i ho c sinh lo i bacteriocin m i K t qu nghiên c u c a tài s nghiên c u s n xu t lo i thu c a (như kháng sinh th h m i, probiotic) t ch ng VK bi n sinh bacteriocin Do th i gian có h n tài m i m i v i m t sinh viên Môi trư ng nên báo cáo ch c h n s có h n ch , em kính mong nh n c ý ki n óng góp c a q th y b n bè thi n Em xin chân thành c m ơn ! ng nghi p nghiên c u thêm hoàn CHƯƠNG I T NG QUAN 1.1 T ng quan v cá chim vây vàng 1.1.1 Gi i thi u chung v cá chim vây vàng Cá chim vây vàng có th trịn, cao d p bên, gi a lưng hình vịng cung S v y ng bên t 135-136 cái, t l chi u dài th so v i chi u cao t 1.6-1.7 l n 3.5-4 l n so v i chi u cao nh chi u cao u l n chi u dài u, cu ng uôi ng n d p, u u, mơi bù v phía trư c L mũi m i bên có g n nhau, l mũi trư c nh hình trịn, l mũi sau to hình b u d c Mi ng nh xiên, xương hàm l i, hàm dư i nh có nhung, phía sau d n thối hóa, lư i khơng có răng, rìa phía trư c xương n p hình cung tương sau cong B ph n i to, rìa u khơng có v y, th có nhi u v y trịn dính dư i da Vây lưng th vây h u mơn có v y, phía trư c ng bên hình cung cong trịn tương i l n, ng bên v y khơng có g , vây lưng th nh t hư ng v phía trư c, gai b ng có 5-6 gai ng n Cá gi ng gi a gai có màng li n nhau, cá trư ng thành màng thối hóa thành nh ng gai tách r i nhau, vây lưng th có gai 1820 tia vây, ph n trư c c a vây kéo dài hình lư i li m Vây h u mơn có gai 16-18 tia vây phía trư c có gai ng n, có d ng hình lư i li m Còn vây ng c tương i ng n, vây i hình trăng lư i li m Ru t u n cong l n (chi u dài ru t/chi u dài th =0.8) Lưng màu tro b c, b ng màu ánh b c, khơng có vân en, vây lưng màu ánh b c vàng, rìa vây màu tro en, vây h u môn màu ánh b c vàng, vây uôi màu vàng tro (Ngô Vĩnh H nh, 2007) Cá chim vây vàng loài cá bi n có giá tr kinh t cao, c ni nhi u ài Loan, Trung Qu c, Singapore tiêu th m nh th trư ng th gi i Tuy nhiên nư c ta, cá chim tr ng vây vàng i tư ng nuôi m i m V i ng b bi n dài, di n tích m t nư c bi n l n, ngành nuôi cá bi n ang phát tri n m nh c bi t, i u ki n bi n t nhiên nư c ta r t thích h p v i lồi cá chim tr ng vây vàng Vì mơi trư ng s ng c a lo i cá vùng bi n m, v trí r t thích h p, nh ng vùng v nh, m phá, eo bi n, bi n n i a sóng gió Bên c nh ó, 62 Sau ki m tra v i enzym proteinase K ta ti n hành ki m tra ti p v i enzym trypsin v i t t c 10 ch ng (B ng 3.7) Trong s 10 ch ng có ch ng làm m t ho t tính kháng khu n VK ích c a d ch ngo i bào bao g m: Cr9, Cr11, Cr16 chi m t l 30 %, ng th i ch ng ã m t ho t tính kháng khu n VK ích ki m tra v i enzym proteinase K K t qu ki m tra v i enzym ã ch ng t r ng d ch ngo i bào c a ch ng bacteriocin tùy vào c u trúc protein c a chúng nên s b phân c t b i enzym khác nhau, i u gi i thích c n ph i ti n hành ki m tra b n ch t protein c a d ch ngo i bào i v i enzym khác ây phù h p v i m t s nghiên c u trư c ó Nguy n Th Thanh Tâm[11], Jose´ L Balca´zar c ng s [16] Jose´ L Balca´zar c ng s ã ti n hành ki m tra d ch ngo i bào c a 13 ch ng VK phân l p t loài cá ng a (Hippocampus Guttulatus) v i lo i enzym khác Controlb, Proteinase K Trypsin[13] Các ch ng ti p t c c nghiên c u thêm v m t s c i m sinh h c, phân lo i Trong ch ng sinh bacteriocin ta th y ch ng Cr15 có ho t tính kháng khu n m nh nh t nên ch ng s c ch n ti n hành g i i gi i trình t gen nh danh sau Hình 3.4 K t qu ki m tra d ch bacteriocin c a ch ng vi khu n Cr11, Cr15 v i enzym proteinase K môi trư ng TSA, ch ng ch th Bacillus B1.1 (Chú Thích: Gi ng s 1:d ch ngo i bào mát 2-40C,3 gi ; gi ng s nhi t 370C, gi ; Gi ng s : gi ng x lý enzym Catalase+Proteinase K, 500C, gi ; Gi ng s : gi ng ch x lý catalase, 370C, 30 phút ) 63 Hình 3.5 K t qu ki m tra d ch bacteriocin c a ch ng vi khu n Cr9 v i enzym trypsin môi trư ng TSA, ch ng ch th Bacillus B1.1 (Chú Thích: Gi ng s 1:d ch ngo i bào mát 2-40C,3 gi ; gi ng s nhi t 370C, gi ; Gi ng s : gi ng x lý enzym Catalase+Proteinase K, 500C, gi ; Gi ng s : gi ng ch x lý catalase, 370C, 30 phút ) 3.3 M t s c i m sinh h c, phân lo i nh danh ch ng vi khu n bi n sinh bacteriocin phân l p t ru t cá chim vây vàng 3.3.1 Hình thái khu n l c nhu m Gram Các ch ng vi khu n sinh bacteriocin (6 ch ng) c ti n hành ki m tra m t s c i m sinh h c phân lo i, k t qu th hi n B ng 3.8 B ng 3.7 c i m hình thái khu n l c t bào c a ch ng vi khu n n ch n STT Tên ch ng Hình thái khu n l c Hình thái t bào Cr2 Hình trịn, có nhân, màu tr ng s a, ng kính 0.4 cm Vi khu n Gram (-), hình que Cr9 Hình trịn, có nhân, màu nâu c, ng kính 1cm Vi khu n Gram (+), hình que Cr10 Hình trịn , có nhân, màu nâu nh t, ng kính 0.5 cm Vi khu n Gram (+), hình que 64 STT Tên ch ng Hình thái khu n l c Hình thái t bào Cr11 Hình trịn, có nhân màu tr ng c, xung quanh màu nh t hơn, ng kính 0.8 cm Vi khu n Gram (+), hình que Cr15 C nh khơng u, có nhân, màu nâu m, ng kính cm Vi khu n Gram(-), hình que Cr16 Hình trịn, có nhân màu vàng c, xung quanh màu tr ng s a, ng kính 0.5 cm Vi khu n Gram(-), hình que (Chú thích: T t c c ni c y môi trư ng TSA sau 24 gi , 370C) V i ch ng sau ki m tra b n ch t protein c a bacteriocin ti n hành c y i m nhu m Gram xác nh m t s c i m hình thái khu n l c, hình thái t bào phân lo i c a ch ng K t qu nhu m Gram cho th y ch ng có ch ng ch ng Gram âm (Cr2, Cr15, Cr16) ch ng Gram dương (Cr9, Cr10, Cr11) Hình 3.6 Hình thái khu n l c t bào ch ng Cr15 dư i phóng i X-100 3.3.2 Kh ch u mu i V i k t qu vòng kháng t t nh t, ch ng Cr15 c em i nh danh xác nh kh ch u mu i K t qu v kh ch u mu i (NaCl) c a ch ng Cr15 c trình bày b ng 3.9 B ng 3.9 K t qu v kh ch u mu i c a ch ng Cr15 N ng mu i NaCl (%) Kh ch u mu i +++ +++ +++ ++ ++ + - - (Chú thích : +++ r t t t; ++ t t; + trung bình; - khơng có) 65 K t qu t B ng 3.9 cho th y, v i n ng trư ng r t t t, n ng mu i t 1-3 % ch ng Cr15 sinh n %, %, % sinh trư ng có d u hi u gi m d n cho mu i NaCl t % tr n i ch ng Cr15 khơng th phát tri n c Hình 3.7 Kh ch u mu i c a ch ng Cr15 3.3.3 nh danh ch ng vi khu n bi n sinh bacteriocin Sau ki m tra b n ch t protein c a d ch bacteriocin, ch ng sinh bacteriocin c em i nh danh nh k thu t PCR Ch ng c ch n nh danh ch ng Cr15 • K t qu gi i trình t (Hình 3.8) o n gen 16S rDNA c a vi khu n phân l p Cr15 66 TAATGTATGG GGATCTGCCC GATAGAGGGG GATAACTACT GGAAACGGTG 50 51 GCTAATACCG CATAATGTCT ACGGACCAAA GCAGGGGCTC TTCGGACCTT 100 101 GCACTATCGG ATGAACCCAT ATGGGATTAG CTAGTAGGTG GGGTAAAGGC 150 151 TCACCTAGGC GACGATCTCT AGCTGGTCTG AGAGGATGAT CAGCCACACT 200 201 GGGACTGAGA CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT 250 251 TGCACAATGG GCGCAAGCCT GATGCAGCCA TGCCGCGTGT ATGAAGAAGG 300 301 CCTTAGGGTT GTAAAGTACT TTCAGCGGGG AGGAAGGTGA TAAGGTTAAT 350 351 ACCCTTATCA ATTGACGTTA CCCGCAGAAG AAGCACCGGC TAACTCCGTG 400 401 CCAGCAGCCG CGGTAATACG GAGGGTGCAA GCGTTAATCG GAATTACTGG 450 451 GCGTAAAGCG CACGCAGGCG GTCAATTAAG TCAGATGTGA AAGCCCCGAG 500 501 CTTAACTTGG GAATTGCATC TGAAACTGGT TGGCTAGAGT CTTGTAGAGG 550 551 GGGGTAGAAT TCCATGTGTA GCGGTGAAAT GCGTAGAGAT GTGGAGGAAT 600 601 ACCGGTGGCG AAGGCGGCCC CCTGGACAAA GACTGACGCT CAGGTGCGAA 650 651 AGCGTGGGGA GCAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCTGTAAAC 700 701 GATGTCGATT TAGAGGTTGT GGTCTTGAAC CGTGGCTTCT GGAGCTAACG 750 751 CGTTAAATCG ACCGCCTGGG GAGTACGGCC GCAAGGTTAA AACTCAAATG 800 801 AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGATGC 850 851 AACGCGAAGA ACCTTACCTA CTCTTGACAT CCAGCGAATC CTTTAGAGAT 900 901 AGAGGAGTGC CTTCGGGAAC GCTGAGACAG GTGCTGCATG GCTGTCGTCA 950 951 GCTCGTGTTG TGAAATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTA 1000 1001 TCCTTTGTTG CCAGCACGTA ATGGTGGGAA CTCAAAGGAG ACTGCCGGTG 1050 1051 ATAAACCGGA GGAAGGTGGG GATGACGTCA AGTCATCATG GCCCTTACGA 1100 1101 GTAGGGCTAC ACACGTGCTA CAATGGCAGA TACAAAGAGA AGCGACCTCG 1150 1151 CGAGAGCAAG CGGAACTCAT AAAGTCTGTC GTAGTCCGGA TTGGAGTCTG 1200 1201 CAACTCGACT CCATGAAGTC GGAATCGCTA GTAATCGTAG ATCAGAATGC 1250 1251 TACGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT Hình 3.8 Trình t 1290 o n gen 16S rDNA c a ch ng Cr15 (1290 bp) 67 Các trình t c phân tích, ch nh s a b ng ph n m m BioEdit 7.1.3.0 Genious Pro 5.5.7, c so sánh v i trình t nucleotide tương ng Genbank b ng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) K t qu so sánh i m tương ng c trình bày B ng 3.10 So sánh trình t t tương B ng 3.10 o n gen 16S rDNA c a ch ng Cr15 v i trình ng Genbank b ng công c BLAST T l che ph M cý nghĩa Proteus mirabilis strain NCTC NR_043997.1 11938 16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 99% Proteus penneri strain NCTC NR_043998.1 12737 16S ribosomal RNA, partial sequence 97% 0.0 99% Proteus vulgaris strain DSM NR_025336.1 30118 16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 99% Proteus myxofaciens strain NR_043999.1 NCIMB 13273 16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 98% Xenorhabdus hominickii strain NR_043648.1 KE01 16S ribosomal RNA, partial sequence 99% 0.0 96% Xenorhabdus ehlersii strain :DSM NR_042327.1 16337 16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 95% S hi u gen Mô t tương ng K t lu n : K t qu t b ng 3.10 cho th y trình t nucleotide c a o n gen 16S rDNA c a ch ng Cr15 có tương ng cao nh t (99%) v i lồi ó : Proteus mirabilis; Proteus penneri; Proteus vulgaris Vì v y, ch ng Cr15 phân l p t ru t cá chim vây vàng thu c chi Proteus 68 K T LU N VÀ KI N NGH K t lu n T m u ru t cá chim vây vàng c l y t Tr i cá Trư ng i h c Nha Trang (t i Vũng Ngán - Nha Trang - Khánh Hịa) chúng tơi ã phân l p c 43 ch ng vi khu n Trong ó có ch ng có kh sinh bacteriocin bao g m Cr2, Cr9, Cr10, Cr11, Cr15 Cr16 chi m t l 14% C ch ng u m t ho t tính kháng khu n x lý b ng enzym proteinase K Ti p t c x lý b ng enzym trypsin s ch ng m t ho t tính kháng khu n (Cr9, Cr11 , Cr16 ) Ti n hành nhu m Gram quan sát hình thái t bào ch ng sinh bacteriocin có ch ng Gram dương (Cr9, Cr10, Cr11,) ch ng Gram âm (Cr2, Cr15, Cr16), t t c ch ng u hình que Ch ng Cr15 ch ng có ho t tính kháng khu n m nh nh t nên c l a ch n nh danh c i m hình thái khu n l c ch ng Cr15: Có nhân, c nh khơng u, gi a màu vàng nh t nh t d n t ngồi, ng kính cm sau 24 gi ni c y Ch ng có kh ch u mu i mu i NaCl K t qu nh danh b ng k n 6% thu t PCR cho th y ch ng Cr15 thu c chi Proteus Ki n ngh Ti p t c nh danh ch ng sinh bacteriocin l i (Cr2, Cr9, Cr11, Cr16) Nghiên c u thêm m t s tính ch t c a d ch bacteriocin thơ như: kh b n nhi t, b n pH, kh o sát ph ho t tính, xác nh ch ho t ng c a bacteriocin c a ch ng ã phân l p (Cr2, Cr9, Cr11, Cr15, Cr16) Ti p t c nghiên c u áp d ng lĩnh v c nuôi tr ng th y s n như: Tinh ch d ch bacteriocin tinh t t ch ng dùng làm thu c kháng sinh sinh h c, th nghi m b sung ch ng vi khu n sinh bacteriocin vào ch ph m sinh h c nh m c i t o môi trư ng nuôi TÀI LI U THAM KH O Ti ng Vi t : Bích Trâm, Võ Th Trúc Linh, Huỳnh Th Thu Vân, Nguy n Th Thanh Th y, 10/2010 Bacteriocin ng d ng b o qu n th c ph m, ih c Nơng lâm Tp H Chí Minh, tr.3 – 15 Th Hòa, Bùi Quang T , Nguy n H u Dũng Nguy n Th Mu i, 2004 B nh h c th y s n, NXB Nơng nghi p Tp H Chí Minh, Tp H Chí Minh, tr.224 -231 Th Hịa, Tr n V Hích, Nguy n Th Thùy Giang, Nguy n Th Nguy t Hu , s 1/2008 Các lo i b nh thư ng g p cá bi n ni khánh hịa, T p chí khoa h c cơng ngh th y s n- i h c Nha Trang, tr.16 – 24 L i Mai Hương, Lê Văn Vi t M n Giáo trình thí nghi m vi sinh v t h c th c ph m, Trư ng i h c Bách khoa- i h c qu c gia Tp H Chí Minh, tr.7 - 47 Lê Thanh Huân, 2011 Phân l p n ch n ánh giá c tính probiotic m t s ch ng Lactobacillus Cá Chim vây vàng, Lu n văn t t nghi p i h c, i h c Nha Trang, tr - 18 Lương c Ph m, 1998 Công ngh vi sinh v t, NXB Nông nghi p, Hà N i, tr.358 Nguy n ình Mão, Vũ Trung T ng, 2006 Khai thác s d ng b n v ng a d ng sinh h c th y sinh v t Nuôi tr ng th y s n Vi t Nam, NXB Nông nghi p, tr 45-48 Nguy n Lân Dũng tác gi , 1972 M t s phương pháp nghiên c u vi sinh v t h c, T p 1, NXB KH & KT, Hà N i Nguy n Lân Dũng tác gi , 1976 M t s phương pháp nghiên c u vi sinh v t h c, T p 2, NXB KH & KT, Hà N i 10 Nguy n Lân Dũng tác gi , 1978 M t s phương pháp nghiên c u vi sinh v t h c, T p NXB KH & KT, Hà N i 11 Nguy n Th Thanh Tâm, 2011 Phân l p n ch n ch ng vi khu n lactic sinh bacteriocin t nư c dưa lên men truy n th ng nh m b o qu n th c ph m, án t t nghi p i h c, i h c Nha Trang, tr.23 - 37 12 Tr n Văn V , 2004 Giáo trình th y s n, NXB i h c Sư ph m Ti ng Anh : 13 Balca´zar J L, Loureiro1 L, Silva Y J D, Pintado1 J and Planas M, 2010 Identification and characterization of bacteria with antibacterial activities isolated from seahorses(Hippocampus guttulatus), The Journal of Antibiotics 63, p 271- 274 14 Dutton C J Peptide antibiotics: discovery, modes of action, and applications 15 Gálvez A, Abriouel H, López R L, Omar N B, 2007 Bacteriocin-based strategies for food biopreservation, International Journal Food Microbiology, p 51 - 70 16 Fay J M Modern food microbiology-sixth edition 17 Hoang Hoa Hong, Book of abstracts Vietnam – Taiwan international conference on seed breeding technology and mariculture – H Nha Trang, p.4 – 18 Nguyen Van Duy, 2011 Marine bacteriocin as a new drug for aquaculture health T p chí KHCNTS, p.49 - 55 19 Riley M A, Osnat Gillor, research and applications in bacteriocins 20 Vuyst L D, Leroy F, 2007 Bacteriocin from Lactic Acid Bacteria: Production, Purrification, and Food Application, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnogy, p.194 - 199 PH L C • Ph L c Quy trình tách chi t DNA b ng theo b kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega) : 42oC 24 gi - Các ch ng vi khu n c tăng sinh môi trư ng LB 3% - L c - Ly tâm 13000 vòng phút, lo i b ph n d ch n i bên trên, r a c n t bào u, hút 1,5 ml d ch tăng sinh cho vào ng Eppendort 1,5 ml vô trùng l n b ng - m TE 1X r i ly tâm v i ch lo i b ph n d ch n i Sau ó thêm vào 275 l dung d ch phá t bào vào m i ng, vortex Thành ph n Th tích ( l) m TE 10:1 200 EDTA 0,5 M (pH 8,0) 50 Protease K 20 mg/ml 20 Rnase A mg/ml T ng - u 275 55oC gi ng m u block nhi t Thêm 250 l dung d ch m (Wizard SV Lysis Buffer) vào m i ng, sau ó em vortex nh - Spin nh , thu ph n d ch n i ( c m i ng sang c t Wizard SV Minicolumn t ng thu m u 1,5 ml) - Ly tâm 13000 vòng phút, lo i b d ch thu c - Chuy n c t Wizard SV Minicolumn sang ng thu m u 1,5 ml m i - Thêm vào 650 l dung d ch r a (Wizard SV Wash Solution) - Ly tâm 13000 vòng phút, lo i b ph n dung d ch r a thu c - L p l i bư c r a thêm l n n a - Chuy n c t Wizard SV minicolumn sang m t Eppendorf 1,5 ml m i - Thêm vào 100 l dung d ch - C t Wizard SV Minicolumn c lo i b , d ch chi t DNA c thu nh n m TE 1X, ly tâm 13000 vòng phút - D ch chi t DNA c b o qu n - 20oC cho n s d ng • Ph l c M t s hình nh v kh kháng khu n c a d ch ngo i bào ch ng VK phân l p • Ph l c M t s hình nh v vịng kháng khu n sau x lý b ng enzym proteinase K • Ph l c M t s hình nh v vòng kháng khu n sau x lý b ng enzym trypsin • Ph l c Hình thái khu n l c t bào ch ng sinh Bacteriocin Cr2 Cr16 Cr9 Cr10 Cr11 ... v cá chim vây vàng .3 1.1.2 Tình hình nghiên c u cá chim vây vàng th gi i nư c 1.1.2.1 Tình hình nghiên c u cá chim vây vàng th gi i 1.1.2.2 Tình hình nghiên c u cá chim vây vàng Vi. .. n vùng nuôi m t cách b n v ng 39 CHƯƠNG II NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Nguyên v t li u 2.1.1 M u cá chim vây vàng M u cá chim vây vàng c l y t l ng nuôi cá chim vây vàng t... Loan Vi t Nam, cá chim vây vàng c tìm th y v nh B c B , mi n Trung Nam B Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) Cá chim vây vàng lồi cá nư c m, có t p tính di cư, s ng m t Mùa v sinh