i LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin chân thành gửi lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô trong Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập. Con xin gửi lòng biết ơn đến bố mẹ cùng gia đình đã tạo mọi điều kiện về mặt tinh thần cũng như về vật chất trong suốt quá trình của khóa học. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể Lớp 50 CNSH, những bạn đồng hành cùng tôi trong bốn năm qua, cùng chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình cảm quý báu này. Nha Trang, tháng 06 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Trà ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 4 1.1 Tổng quan về cây Dó bầu 4 1.1.1 Đặc điểm phân loại 4 1.1.2 Đặc điểm hình thái 4 1.1.3 Đặc điểm sinh thái 5 1.1.4 Lợi ích của cây Dó bầu 7 1.2 Tổng quan về Trầm hương 8 1.2.1 Sự hình thành Trầm hương trong tự nhiên 8 1.2.2 Đặc điểm chung của Trầm hương 8 1.2.3 Phân loại và tính chất của Trầm hương 9 1.2.4 Công dụng của Trầm hương 10 1.2.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ Trầm hương 12 1.3 Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học của hệ vi sinh vật trên gỗ Trầm hương 16 1.3.1 Trên thế giới 16 1.3.2. Ở Việt Nam 17 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Mẫu Trầm hương 19 2.1.2 Môi trường và thuốc thử 19 iii 2.1.3 Thiết bị chuyên dụng 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phân lập các chủng vi sinh vật 21 2.2.2 Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật 22 2.2.3 Xác định đặc điểm hình thái 25 2.2.4 Nhuộm Gram 25 2.2.5 Xác định khả năng sinh bào tử 25 2.2.6 Thí nghiệm cấy sinh khối vi sinh vật trên cây Dó bầu 26 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ mẫu gỗ Trầm hương 27 3.2 Đặc điểm hình thái và hóa sinh 27 3.2.1 Hình thái khuẩn lạc 27 3.2.2 Nhuộm gram 35 3.2.3 Khả năng sinh bào tử 40 3.2.4 Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật phân lập được thành các nhóm 41 3.3 Thử nghiệm cấy sinh khối vi sinh vật trên cây Dó bầu 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44  Kết luận 44  Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 iv BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Viết đầy đủ 1 CFU Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) 2 OD Optical Density (Mật độ quang) 3 TSA Trypton Soy Agar (Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số) 4 TSB Trypton Soy Broth (Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số) 5 IUCN The International Union for the Conservation of Nature and Natural Resources (Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên và Tài nguyên Quốc tế) v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hệ thống phân loại vi khuẩn Gram (+) của Bergey 23 Bảng 2.2. Hệ thống phân loại vi khuẩn Gram (-) của Bergey 24 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật hiếu khí phân lập được trên môi trường TSB 27 Bảng 3.2. Phân loại Gram các chủng vi khuẩn sau khi tiến hành nhuộm Gram 35 Bảng 3.3. Khả năng sinh bào tử của các chủng vi khuẩn sau khi được kiểm tra bằng phương pháp sốc nhiệt 40 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 0.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 3 Hình 3.1. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T1 30 Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T2 30 Hình 3.3. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T3 30 Hình 3.4. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T4 30 Hình 3.5. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T5 30 Hình 3.6. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T6 30 Hình 3.7. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T7 31 Hình 3.8. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T8 31 Hình 3.9. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T9 31 Hình 3.10. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T10 31 Hình 3.11. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T11 31 Hình 3.13. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T13 32 Hình 3.14. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T14 32 Hình 3.15. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T15 32 Hình 3.16. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T16 32 Hình 3.17. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T17 32 Hình 3.18. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T18 32 Hình 3.19. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T19 33 Hình 3.20. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T20 33 Hình 3.21 Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T21 33 Hình 3.22 Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T23 33 Hình 3.23. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T24 33 Hình 3.24. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T25 33 Hình 3.25. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T26 34 Hình 3.26. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn T27 34 Hình 3.27. Màu môi trường chuyển sang màu xanh sau khi nuôi cấy chủng T24 so với chủng T4 34 Hình 3.28. Màu môi trường TSB sau khi nuôi cấy chủng vi khuẩn T17 34 Hình 3.29. Tế bào của chủng vi khuẩn T20 sau khi nhuộm Gram 35 vii Hình 3.30. Tế bào của chủng vi khuẩn T7 sau khi nhuộm Gram 35 Hình 3.31. Tế bào của chủng vi khuẩn T11 sau khi nhuộm Gram 36 Hình 3.32. Tế bào của chủng vi khuẩn T12 sau khi nhuộm Gram 36 Hình 3.33. Tế bào của chủng vi khuẩn T13 sau khi nhuộm Gram 36 Hình 3.34. Tế bào của chủng vi khuẩn T14 sau khi nhuộm Gram 36 Hình 3.35. Tế bào của chủng vi khuẩn T18 sau khi nhuộm Gram 36 Hình 3.36. Tế bào của chủng vi khuẩn T21 sau khi nhuộm Gram 36 Hình 3.37. Tế bào của chủng vi khuẩn T26 sau khi nhuộm Gram 37 Hình 3.38. Tế bào của chủng vi khuẩn T27 sau khi nhuộm Gram 37 Hình 3.39. Tế bào của chủng vi khuẩn T2 sau khi nhuộm Gram 37 Hình 3.40. Tế bào của chủng vi khuẩn T8 sau khi nhuộm Gram 37 Hình 3.41. Tế bào của chủng vi khuẩn T10 sau khi nhuộm Gram 37 Hình 3.42. Tế bào của chủng vi khuẩn T17 sau khi nhuộm Gram 37 Hình 3.43. Tế bào của chủng vi khuẩn T19 sau khi nhuộm Gram 38 Hình 3.44. Tế bào của chủng vi khuẩn T23 sau khi nhuộm Gram 38 Hình 3.45. Tế bào của chủng vi khuẩn T4 sau khi nhuộm Gram 38 Hình 3.46. Tế bào của chủng vi khuẩn T5 sau khi nhuộm Gram 38 Hình 3.47. Tế bào của chủng vi khuẩn T16 sau khi nhuộm Gram 38 Hình 3.48. Tế bào của chủng vi khuẩn T24 sau khi nhuộm Gram 38 Hình 3.49. Tế bào của chủng vi khuẩn T25 sau khi nhuộm Gram 39 Hình 3.50. Tế bào của chủng vi khuẩn T6 sau khi nhuộm Gram 39 Hình 3.51. Tế bào của chủng vi khuẩn T9 sau khi nhuộm Gram 39 Hình 3.52. Tế bào của chủng vi khuẩn T1 sau khi nhuộm Gram 39 Hình 3.53. Tế bào của chủng vi khuẩn T3 sau khi nhuộm Gram 39 Hình 3.54. Tế bào của chủng vi khuẩn T15 sau khi nhuộm Gram 39 Hình 3.55. Khoan lỗ trên cây Dó bầu 42 Hình 3. 56. Cấy chủng vi khuẩn lên cây Dó bầu 43 1 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam có nhiều loài thực vật quý hiếm. Bên cạnh nhóm cây dược liệu, nước ta còn có nhóm cây tinh dầu. Các tinh dầu thu được từ nhóm cây có thể dùng để làm: dược phẩm, hương liệu, thực phẩm, mỹ phẩm… Trong đó, cây Dó bầu là cây sinh ra Trầm hương hoặc Kỳ nam những loại tinh dầu quý rất có giá trị. Cây Dó bầu hay còn được gọi là cây Trầm hương, cây Dó trầm, Cây Tóc… Loài cây này trong điều kiện đặc biệt thì gỗ của chúng sẽ tích tụ chất nhựa và tỏa ra mùi thơm đặc trưng, căn cứ vào mức độ nhiễm dầu, tính chất và chất lượng của nhựa chứa trong gỗ mà người ta chia thành các loại sản phẩm như: Tóc, Trầm hương, Kỳ nam. Đây là nguồn nguyên liệu quý thường được dùng trong y học cổ truyền. Chúng được dùng làm thuốc chữa trị các chứng bệnh như: đau ngực, hen suyễn, khó thở, cảm hàn, đau bụng, lợi tiểu, trợ tim, thấp khớp, Trong công nghiệp mỹ phẩm tinh dầu Trầm dùng làm chất định hương, chế biến các loại dầu thơm, nước hoa cao cấp, Trong tín ngưỡng Trầm hương dùng làm hương nhang và nến đốt trong các dịp lễ Tết, dùng khi hoả táng hoặc ướp xác người quá cố, Từ xưa Trầm hương đã được xem như là một sản vật hết sức quý hiếm. Ngày nay với tên giao dịch thương mại quốc tế là Agarwood hay Eaglewood, Trầm hương vẫn được coi là sản vật có giá trị thương mại quốc tế cao. Với nền kinh tế đang ngày càng phát triển, đời sống vật chất lẫn tinh thần của người dân đang ngày càng được nâng cao thì sản phẩm tinh dầu Trầm và các sản phẩm khác từ Trầm hương ở trong nước cũng như trên thế giới đang ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Nhu cầu tiêu thụ Trầm hương và tinh dầu Trầm trên thế giới hiện nay là rất lớn, nhưng do hạn chế về nguồn nguyên liệu nên lượng cung cấp chỉ đạt khoảng 40% so với nhu cầu. Lượng Trầm tự nhiên gần như đã cạn kiệt do việc khai thác bừa bãi mang tính chất hủy diệt vào những thập niên cuối của thế kỷ XX đã làm cho diện tích trồng cây Trầm hương ngày càng bị thu hẹp cộng với việc chưa thực hiện tốt các biện pháp phục hồi dẫn đến sản lượng ngày càng bị giảm sút. Hiện nay chi Aquilaria cho Trầm-Kỳ đã được liệt kê trong sách đỏ của tổ chức IUCN (The International Union for the Conservation of Nature and Natural Resources) và được 2 xem có nguy cơ bị tuyệt chủng, cần được bảo tồn và phục hồi (Oldfield, 1998). Nếu không kịp thời được bảo vệ và phục hồi thì có lẽ một thời gian nữa con người sẽ khó có cơ hội được sử dụng và tận hưởng những tác dụng kỳ diệu của các sản phẩm từ Trầm hương mà thiên nhiên đã ban tặng. Trầm hương được hình thành từ cây Dó bầu nhưng không phải cây Dó nào cũng cho Trầm mà chỉ có những cây bị thương mới hình thành Trầm. Cây Dó bầu trong quá trình sinh trưởng, do những tác động nào đó, gây ra những tổn thương hoặc nhiễm bệnh và khi đó cây có phản ứng đề kháng bằng cách tiết ra nhựa nhằm tiêu diệt côn trùng, các loại vi khuẩn, nấm mốc… để cô lập vết thương. Lâu ngày cây tích tụ một chất dạng nhựa, rồi lan dần ra, làm biến đổi các phân tử gỗ. Đó chính là Trầm-Kỳ. Chính việc nắm được quá trình hình thành Trầm-Kỳ mà ở một số nước như: Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Nhật Bản người ta tạo Trầm nhân tạo bằng cách trồng cây Dó bầu rồi đục thân, tiêm vi khuẩn hoặc nấm vào để kích thích tạo Trầm nhanh chóng. Do đó việc phân lập và nghiên cứu những đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật trên gỗ Trầm hương nhằm tạo tiền đề cho việc nuôi cấy tạo trầm nhân tạo, nhằm mục đích đem lại hiệu quả kinh tế cao. Vì vậy, đề tài “Đa dạng sinh học của hệ vi sinh vật trên gỗ Trầm hương Khánh Hòa” được thực hiện nhằm mục đích:  Phân lập các chủng vi sinh vật trên gỗ cây Trầm hương  Xác định một số đặc điểm sinh học và sơ bộ phân loại các chủng phân lập được  Thí nghiệm cấy một số chủng vi khuẩn trên gỗ cây Dó bầu nhằm tạo Trầm hương 3 Nội dung nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu của đề tài được sơ đồ hóa trong Hình 0.1. Hình 0.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài M ẫ u Phân l ậ p các ch ủ ng vi sinh v ậ t Đ ồ ng nhất mẫu Pha loãng C ấ y trang C ấ y ria Nhu ộ m Gram Xác đ ị nh khả năng sinh bào tử Sơ b ộ phân lo ạ i C ấ y sinh kh ố i vi sinh v ậ t trên cây Dó b ầ u Xác đ ị nh đặc điểm hình thái [...]... về lâm sinh đối với cây Dó bầu, sự tương thích giữa các cây trồng xen, các loại bệnh của cây, phương pháp tạo Trầm chất lượng cao… đó là những vấn đề khó khăn trong công tác sản xuất Trầm hương ở nước ta hiện nay cần được giải quyết để tìm ra những giải pháp thích hợp nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người sản xuất 1.3 Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học của hệ vi sinh vật trên gỗ Trầm hương. .. Dó tạo ra Trầm hương Trong giao dịch mua bán, vi c phân loại Trầm hương phần lớn dựa vào cảm nhận, kinh nghiệm, thông qua hành vi trực tiếp của con người như nhìn, sờ, gọt, bấm, đốt, nếm, ngửi… 1.2.4 Công dụng của Trầm hương Trầm hương là một mặt hàng có giá trị cao, được sử dụng chủ yếu để làm hương liệu mỹ phẩm và dược liệu Hương liệu mỹ phẩm Tinh dầu Trầm thường được sử dụng làm chất định hương, điều... đặc biệt về khoa học và kinh tế của nước ta; góp phần làm cân bằng hệ sinh thái, quần xã sinh vật trong rừng 1.2 Tổng quan về Trầm hương 1.2.1 Sự hình thành Trầm hương trong tự nhiên Trong tự nhiên không phải bất kỳ thân cây Dó nào cũng có Trầm – Kỳ, chỉ có những cây bị thương và bị nhiễm trùng mới chứa Trầm − Kỳ (Chalermpongse và cs, 1990) Khi cây Dó bầu bị thương do các tác động vật lý như nứt, gãy…... loại 6 (màu vàng đốm dầu) Giá trị của Trầm hương giảm dần theo thứ tự các loại Sách xưa chia 10 Trầm hương thành 5 loại: Hoàng lạp trầm, Hoàng trầm, Giác trầm, Tiến hương, Kê cốt hương, trong đó Hoàng lạp trầm là tốt nhất Tóc: tóc có nguồn gốc từ chữ tok của người Campuchia Phần lớn tóc có mức nhiễm dầu ít hơn Trầm, chủ yếu là từ bên ngoài và dài theo thớ gỗ, nổi trên mặt nước, thường dùng để làm nhang... Pythium spp 1.3.1 Trên thế giới Trên thế giới, vi c nghiên cứu cấy tạo Trầm đã được các nhà khoa học theo đuổi nhiều năm qua và đã có những thành công đáng kể: Đầu tiên ở Mỹ, Trường Đại học Harvard đã nghiên cứu thành công phương pháp cấy tạo Trầm vào những năm 80 của thế kỷ 20 Sau đó đến năm 1993-1994 trường đại học Kyoto nghiên cứu thành công phương pháp cấy tạo Trầm bằng 17 men vi sinh và phương pháp này... quy trình công nghệ sinh học để gây tạo Trầm trên thân gỗ của cây Dó bầu tại Lâm Đồng Vi t Nam, kết quả bước đầu cho thấy sau khi cấy men từ 6-12 tháng lượng Trầm thu được trên một cây vào khoảng 700 gram Song song với vi c nhân giống cây Dó bầu để trồng (trong vườn hộ gia đình hoặc ở trang trại…) vi c cấy tạo Trầm cũng đã xuất hiện ở một số địa phương như: Hà Tỉnh, Quảng Nam, Đồng Nai, Khánh Hoà, Phú... cứu của Ishihara khi phân tích hóa học tinh dầu Trầm hương đã cho thấy thành phần chủ yếu của tinh dầu này là các dẫn xuất của chromone và một số sesquiterpene (Ishihara và cs, 1993) 1.2.3 Phân loại và tính chất của Trầm hương Theo phẩm cấp Trầm hương được xếp thành 3 hạng (hạng 1: Kỳ nam, hạng 2: Trầm, hạng 3: Tóc) và mỗi hạng chia thành nhiều loại khác nhau Kỳ nam (nghĩa là điều kỳ diệu của phương... cấp Trầm hương cho thị trường thế giới, trong đó Trầm hương Vi t Nam được đánh giá là có chất lượng cao nhất b Tình hình khai thác Trầm hương trong thiên nhiên Trầm hương, đinh hương, nhục quế, dầu thơm… là những dược liệu xuất hiện rất sớm trên thị trường Trong đó Trầm hương được xem là mặt hàng quý giá nhất do có những công dụng đặc biệt trong đời sống cũng như trong các tín ngưỡng tôn giáo Ở Vi t... tiêu thụ c Tình hình sản xuất Trầm hương hiện nay Từ đầu những năm 80 của thế kỷ trước nhiều công trình khoa học đã nghiên cứu thành công các phương pháp cấy tạo Trầm trên thân gỗ của cây Dó bầu đã mở ra một hướng đi mới cho thị trường Trầm hương trong nước cũng như trên thế giới Ngày nay, kỹ thuật cấy tạo Trầm nhân tạo đã trở nên phổ biến với chất lượng không thua kém trầm trong tự nhiên nhưng với... Trầm hương thu được từ cây Dó bầu có sự khác nhau giữa các địa phương Ở các tỉnh Miền Trung sản lượng và chất lượng Trầm hương luôn cao hơn những nơi khác, đặc biệt ở là vùng Vạn Giã - Vạn Ninh - Khánh Hòa là địa danh nổi tiếng nhất từ trước đến nay có loại Trầm- Kỳ tốt nhất thế giới Đó là sự khác biệt về địa lý của Trầm hương trong tự nhiên còn về Trầm hương nhân tạo thì cho đến nay các nhà khoa học . chất của Trầm hương 9 1.2.4 Công dụng của Trầm hương 10 1.2.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ Trầm hương 12 1.3 Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học của hệ vi sinh vật trên gỗ Trầm hương. sinh vật trên gỗ Trầm hương nhằm tạo tiền đề cho vi c nuôi cấy tạo trầm nhân tạo, nhằm mục đích đem lại hiệu quả kinh tế cao. Vì vậy, đề tài Đa dạng sinh học của hệ vi sinh vật trên gỗ Trầm hương. định khả năng sinh bào tử 25 2.2.6 Thí nghiệm cấy sinh khối vi sinh vật trên cây Dó bầu 26 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ mẫu gỗ Trầm hương 27 3.2