Đang tải... (xem toàn văn)
Việc nghiên cứu các chất có hoạt tính sinhhọc trong các loại thực vật có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày là vấn đềquan tâm của toàn xã hội, mang tầm chiến lược của ngành côn
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNTTRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNTTRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Cao Thị Huệ
ii
Trang 3HÀ NỘI, NĂM 2023
iii
Trang 4LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là phần làm đồ án tốt nghiệp của mình Các kết quả thể hiệntrong đồ án là trung thực từ quá trình làm thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Côngnghệ Sinh học - Trường Đại học Thủy lợi, Trung tâm Sinh học Phân tử Nghĩa Đô -Viện nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam, không sao chép bất kì nguồn nào dưới bất kỳ hình thức nào Trong quá trình làmđồ án, em đã tham khảo một số nguồn tài liệu trong và ngoài nước Việc tham khảocác nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theođúng quy định.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Diễm
Trang 5LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin trân trọng cám ơn các thầy cô trongBộ môn Công nghệ sinh học – Khoa Hóa và Môi trường đã dìu dắt, dạy cho em nhữngkiến thức quý báu trong những năm học ở Trường Đại học Thủy lợi Em xin trân trọngcám ơn ThS Đỗ Đức Cảnh – Quản lý Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã tạođiều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian làm thực nghiệm đồ án tốt nghiệp Emxin gửi lời cám ơn tới TS Trần Thị Hồng và các anh chị thuộc Trung tâm Sinh họcPhân tử Nghĩa Đô - Viện Nghiên cứu Khoa học miền Trung thuộc Viện Hàn lâm Khoahọc và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn thành một phần thựcnghiệm trong khuôn khổ đồ án Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới côgiáo hướng dẫn - TS Cao Thị Huệ đã nhiệt tình hướng dẫn em trong suốt thời giannghiên cứu khoa học và làm đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình vàbạn bè, luôn là động lực giúp em học tập tốt và thành đồ án tốt nghiệp này.
ii
Trang 62 Mục tiêu nghiên cứu 9
3 Nội dung nghiên cứu 9
4 Thời gian và địa điểm thực hiện đồ án 9
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11
1.1 Tổng quan về cây dây lức 11
1.2 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây dây lức 12
1.2.1 Thành phần hóa học của cây Dây lức 12
1.2.2 Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của cây Dây lức 13
1.3 Tình hình nghiên cứu và khả năng ứng dụng của cây Dây lức 18
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 20
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20
2.1.2 Hóa chất 20
2.1.3 Các dụng cụ và thiết bị 22
2.2 Phương pháp nghiên cứu 24
2.2.1 Phương pháp tạo cao chiết 24
2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 25
2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng 25
2.2.4 Phương pháp đánh giá năng lực khử của cao chiết 26
2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết 26
2.2.6 Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH 27
2.2.7 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cao chiết 27iii
Trang 72.2.8 Xử lý số liệu và phân tích thống kê 27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28
3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết 28
3.2 Hàm lượng polyphenol có trong các cao chiết cây Dây lức 28
3.3 Hàm lượng flavonoid có trong các cao chiết cây Dây lức 30
3.4 Kết quả đánh giá năng lực khử của cây Dây lức 31
3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của cây Dây lức 32
3.6 Kết quả đánh giá khả năng ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết cây Dây lức 33
3.7 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cao chiết cây Dây lức 35
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
4.1 Kết luận 42
4.2 Kiến nghị 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44
iv
Trang 8DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cây dây lức Phyla nodiflora 11
Hình 1.2 Một số hợp chất phân lập từ cây dây lức 13
Hình 2.1 Cây dây lức tại Văn Giang, Hưng Yên 20
Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết 28
Hình 3.2 Đường chuẩn xác định hàm lượng polyphenol tổng số 29
Hình 3.3 Hàm lượng polyphenol có trong cao chiết cây Dây lức 29
Hình 3.4 Đường chuẩn xác định hàm lượng flavonoid tổng số 30
Hình 3.5 Hàm lượng Flavonoid có trong các cao chiết của cây Dây lức 30
Hình 3.6 Năng lực khử của các cao chiết từ cây dây lức 31
Hình 3.7 Giá trị EC50 của năng lực khử của vitamin C và các cao chiết cây Dây lức 32
Hình 3.8 Giá trị EC của hoạt tính chống oxy hóa tổng của các cao 50chiết từ cây dây lức 33
Hình 3.9 Khả năng ức chết gốc tự do DPPH của cao chiết cây Dây lức 34
Hình 3.10 Giá trị EC của hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 3450 Hình 3.11 Tác dụng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 36
Hình 3.12 Tác dụng kháng khuẩn của cao methanol 38
Hình 3.13 Tác dụng kháng khuẩn của cao ethyl acetate 39
Hình 3.14 Tác dụng kháng khuẩn của cao n-hexan 41
v
Trang 9DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Các loại hóa chất được sử dụng 21
Bảng 2.2 Các dụng cơ bản được sử dụng 22
Bảng 2.3 Các thiết bị máy móc được sử dụng 23
Bảng 3.1.Kích thước vòng kháng khuẩn của cao chiết Ethanol 35
Bảng 3.2 Kích thước vòng kháng khuẩn của cao chiết Methanol 37
Bảng 3.3 Kích thước vòng kháng khuẩn của cao chiết Ethyl acetate 39
Bảng 3.4 Kích thước vòng kháng khuẩn của cao chiết n-hexan 40
vi
Trang 10DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ GIẢI THÍCH CÁC THUẬT NGỮ
vii
Trang 11LỜI MỞ ĐẦU
1 Lý do chọn đề tài
Giới thực vật từ lâu đã đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì và hỗ trợ sựsống trên trái đất Thực vật được coi là xưởng sản xuất các hợp chất tự nhiên thiết yếu,góp phần vào sự phát triển của ngành công nghệ dược mỹ phẩm như hiện nay.Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và nhiệt đới gió mùa, ánh nắng chan hòa,lượng mưa và độ ẩm cao, tạo điều kiện tốt để thực vật phát triển, tạo ra nguồn nguyênliệu dồi dào phong phú cho đời sống con người và là nguyên liệu để thực hiện cácnghiên cứu khoa học tạo ra sản phẩm có giá trị Từ ngàn xưa, cha ông ta đã phát hiệnvà sử dụng nhiều loại thảo dược có nguồn gốc tự nhiên nhằm mục đích chữa bệnh,đồng thời tránh được một số tác nhân có hại cho sức khỏe.
Xã hội càng phát triển con người ngày càng phải đối đầu với những tác nhân, yếu tốbất lợi từ môi trường, tỷ lệ người mắc các bệnh như ung thư, béo phì, đái tháo đường,… có xu hướng tăng nhanh và trẻ hóa Do vậy, nhu cầu về các loại thuốc trị bệnh vàthực phẩm tốt cho sức khỏe cũng tăng cao Việc nghiên cứu các chất có hoạt tính sinhhọc trong các loại thực vật có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày là vấn đềquan tâm của toàn xã hội, mang tầm chiến lược của ngành công nghiệp dược phẩmcủa Việt Nam nói riêng và các nước trên thế giới nói chung.
Gốc tự do là những phân tử có khả năng phản ứng cao và kém ổn định Chúng đượctạo ra một cách tự nhiên trong cơ thể thông qua quá trình trao đổi chất hoặc do tiếpxúc với các tác nhân từ môi trường như khói thuốc, tia cực tím, ô nhiễm, v.v Các gốctự do có tuổi thọ chưa đến 1 giây, nhưng trong khoảng thời gian đó chúng đã có khảnăng phá hủy DNA và tạo ra các đột biến khác nhau Các chất chống oxy hóa hàngngày chúng ta sử dụng có khả năng trung hòa các phân tử không ổn định và làm giảmnguy cơ gây tổn thương đến các tế bào.
Cây Dây lức (Phyla nodiflora) là một trong những loài thực vật từ lâu đã có mặt trongcác bài thuốc dân gian ở nước ta, nhưng tính đến thời điểm hiện tại vẫn chưa có mộtnghiên cứu khoa học về loại cây hữu ích này được công bố trong nước Ở Văn Giang,Hưng Yên, người dân ven sông Hồng dùng loài cây này ở dạng tươi để đun lấy nước
Trang 12uống hàng ngày hoặc đun nước tắm cho các em bé sơ sinh, trẻ nhỏ và phụ nữ có thai,phụ nữ sau sinh nhằm tăng sức đề kháng, loại bỏ mụn nhọt, giảm thiểu các triệu chứngdị ứng da Để góp phần tìm hiểu thêm giá trị mà cây dây lức đem lại và khẳng định cơsở khoa học của các tác dụng của cây dây lức, em tiến hành thực hiện đề tài “ Sàng lọchoạt tính sinh học của cây Dây lức được thu hái tại Văn Giang, Hưng Yên”.
2 Mục tiêu nghiên cứu
Sàng lọc hoạt tính sinh học của cây dây lức thu hái tại Văn Giang, Hưng Yên, baogồm: hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.
3 Nội dung nghiên cứu
Tạo các cao chiết phân đoạn của cây dây lức, đánh giá hiệu suất của các cao chiết;Xác định hàm lượng flavonoid và polyphenol của các cao chiết từ cây dây lức;Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ cây dây lức: năng lực khử; hoạttính chống oxy hóa tổng; hoạt tính quét gốc tự do DPPH.
Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của cây dây lức
4 Thời gian và địa điểm thực hiện đồ án
Thời gian thực hiện đồ án: 6 tháng (T7/2022 - T1/2023)
Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Thủylợi và Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô - Viện Nghiên cứu Khoa học MiềnTrung – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Góp phần khai thác hợp lý và bảo tồn các loài thảo dược dân gian của địa phương, sửdụng hiệu quả các loài thảo dược này góp phần nâng cao sức khỏe và mang lại tính
Trang 13hiệu quả cho kinh tế - xã hội.
Trang 14CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về cây dây lức
Cây dây lức có tên khoa học là Phyla nodiflora, tùy thuộc vào mỗi địa phươngcó tên gọi khác là cây lức dây, lức lan, dây lưỡi, sài đất giả, chè rừng, thuộc họ Cỏ voingựa – Verbenacea Trên thế giới, họ Verbenacea có khoảng 100 chi và 2600 loài,phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, ít có ở vùng ôn đới Ở Việt Nam có26 chi và trên 130 loài thuộc họ này Dây lức là loại cây thân thảo, mọc hoang dã, mọcbò lan, phát triển nhanh [1] Tên khoa học khác của cây Dây lức là Lippa nodiflora.
Hình 1.1 Cây dây lức Phyla nodiflora
Cây dây lức có lá màu xanh lục, hình bầu dục, mép lá có răng cưa từ giữa đếnđầu lá Lá mọc đối xứng nhau Thân cây có thể dài tới 90 cm, trở thành thân gỗ ở gốccác cây trưởng thành Thân cây có màu xanh vàng, ở gần các đốt cây, lá có màu nâuđỏ [1] Hoa dây lức có màu tía đến hồng, đôi khi có màu trắng, thường có tâm màuvàng, rất nhỏ mọc thành cụm dày đặc hình trụ có đỉnh tròn, tràng hoa hình chuông.Quả có hai hạt nhỏ, được bao bọc trong đài hoa [2].
Theo một nghiên cứu về dòng bản địa và các dòng xâm lấn của cây Dây lức(Phyla nodiflora) với mục đích xác định phân bố tự nhiên hay do con người gây ranhằm kiểm soát và bảo tồn loài cây này cho thấy, các quần thể Phyla nodiflora ở miềntrung và nam Bắc Mỹ là các quần thể bản địa, hiện nay chắc chắn có ít nhất ba dòngbản địa bên ngoài phạm vi này thuộc lục địa Úc, Phi và lục địa Á Âu [3].
Trang 15Ngoài ra, cây dây lức Phyla nodiflora xuất hiện ở vùng nhiệt đới và cận nhiệtđới, một số vùng ôn đới Với sự phân bố của nó trên tất cả các lục địa có thảm thực vậtvà nhiều quần đảo trải dài trên 9000 km, phạm vi vĩ độ từ 39,5˚N đến 44,8˚N [1].
Ở Việt Nam, dây lức thường mọc dại tại các bờ bụi, xem vào khu vực các câyăn trái ở khu vực phía Bắc Nó được biết là một loại dược liệu có trong các bài thuốcnam, y học cổ truyền Loài cây này cũng được mọc nhiều ở các bụi cây ở ven sôngHồng, trong đó có khu vực xã Thắng Lợi, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên đượcngười dân phát hiện nhiều và dùng để hãm nước uống và tắm hàng ngày.
1.2 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây dây lức
1.2.1 Thành phần hóa học của cây dây lức
Cây dây lức từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian cho các bệnh khácnhau như hen suyễn, viêm phế quản, đau khớp gối, v.v Hiện nay, đã có những nghiêncứu bước đầu phân lập và phát hiện các chất chuyển hóa thứ cấp và các hoạt động sinhhọc, điều này tạo điều kiện cho các nghiên cứu và ứng dụng sâu hơn trong tương lai vềloài cây này [4].
Khi thực hiện khảo sát các chất và thành phần hóa học có trong cây dây lức, cho thấysự xuất hiện của các hợp chất thuộc nhóm alkaloid, glycoside, tanin, flavonoid,saponin và terpenoid [5].
Một số hợp chất thuộc nhóm flavonoid như herpidulin và eupafolin được tìm thấytrong cao chiết methanol của các bộ phận từ cây dây lức (Ko và cộng sự, 2013) [6].
Herpidulin Eupafolin
Cao chiết ethanol của toàn bộ cây dây lức được phát hiện có chứa lippiflorin,nodifloridin, jaceosidin, neppetin và batatifolin [7].
Trang 16Hình 1.2 Một số hợp chất phân lập từ cây dây lức
(1) Halleridone, (2) Halleron, (3) Eupafolin, (4) Hispidulin, (5) Nodifloretin, (6)Jaceosidin, (7) Nepetin, (8) Battatifolin, (9) 6-Hydroxyluteolin, (10) Luteolin-7-O-Glucoside, (11) Ecteoside, (12) Methyl salicylate, (13) Eugenol, (14) α-copaene, (15)β-bisabolene, (16) γ-sitosterol, (17) Stigmasterol, (18) -carbolene, (19) Linalool, (20)βCymen-8-ol [4].
1.2.2 Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của cây dây lức
Cây Dây lức (Phyla nodiflora) là loài cây thân thảo, mọc thành đám, loại thảodược này được biết đến có vị chát, có nhiều hoạt tính dược lý quan trọng.
Tác dụng lợi tiểu, chống sỏi niệu
Trang 17Trong cao chiết methanol của cây dây lức phân lập được hai glycoside phenylethanollà arenarioside và verbascoside, 03 flavonoid là 6-hydroxyluteolin, 6-hydroxyluteolin-7-0-glycoside và nodifloretin, các hợp chất này ức chế hoạt động của xanthineoxidase Tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết methanol của cây dây lức cũng đượcnghiên cứu đánh giá thử nghiệm trong chuột tăng axit uric máu do kali oxalat vàhypoxathine gây ra Khi cho chuột dùng cao chiết methanol của cây dây lức cho thấykết quả giảm nồng độ axit uric Ngoài ra, flavonoid trong cây dây lức chủ yếu có khảnăng hạ axit uric thông qua việc ức chế các hoạt động xanthinedehydrogenase/xanthine oxidase and oxidative stress là một phần do tác độnguricosuric [8] Một nghiên cứu khác cho thấy, cao chiết ethanol của cây dây lức có khảnăng ngăn ngừa đáng kể sự tạo thành sỏi canxi oxonat, làm tan sỏi hình thành trongthận của chuột gây ra bởi gentamycin và chế độ ăn làm tăng pH nước tiểu và bài tiếtcanxi, oxalate [8].
Tác dụng bảo vệ gan
Hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết ethanol từ lá cây dây lức được đánh giá chống lạitổn thương gan do CCl gây ra ở chuột cống Thí nghiệm được tiến hành ở nồng độ4 100 và 200 mg/kg thể trọng/ngày, thời gian thử nghiệm 15 ngày Ở cả hai nồng độ nàyđều cho kết quả tăng tổng số bilirubin, asartate transaminase, alanine transaminase vàphosphatase kiềm ở chuột bị nhiễm độc CCl phục hồi về mức bình thường [9].4
Hoạt tính bảo vệ gan và chống oxy hóa của cao chiết methanol từ cây dây lứccũng được xác định thử nghiệm với tổn thương gan cấp tính do paracetamol gây ra.Thí nghiệm này được tiến hành với 2 nồng độ cao chiết khác nhau: 200 và 400 mg/kg,thời gian thử nghiệm trong vòng 7 ngày Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiếtmethanol có tác dụng bảo vệ gan đáng kể, giúp làm giảm hoạt động của SGOT, SGPT,ALP, giảm bilirubin và peroxide hóa lipid, trong khi đó làm tăng đáng kể protein tổngsố, glutathione, catalase và superoside dismutase [10].
Tác dụng hạ huyết áp
Theo nghiên cứu của Gadhvi và cs (2015) khi kiểm tra hiệu quả các cao chiết khácnhau của cây dây lức đối với chuột bị tăng huyết áp do muối DOCA Dạng bột củatoàn bộ cây dây lức khô được chiết xuất bằng chlorofom, ethyl acetate, methanol và
Trang 18nước Trong tất cả các chiết xuất này, cao chiết methanol cho thấy có hiệu quả làmgiảm đáng kể huyết áp tâm thu ở chuột [11].
Tác dụng dược lý đối với hệ thần kinh
Các cao chiết chloroform và ethanol của phần trên mặt đất của cây dây lức đã đượcđánh giá trong các mô hình thử nghiệm bằng cách sử dụng khả năng tăng thời gianngủ do diazepam gây ra, hoạt động vận động, phối hợp vận động, mô hình hành vikhám phá và co giật điện giật tối đa Diazepam ở liều 5, 4 và 1 mg/kg được sử dụnglàm tiêu chuẩn Kết quả cho thấy chiết xuất ethanol của cây Dây lức ở cả hai liều (250và 500 mg/kg, uống) và chiết xuất chloroform ở liều cao hơn (500 mg/kg) tạo ra tácdụng ức chế trung tâm (an thần), chống co giật và giải lo âu đáng kể ở chuột [8].Ảnh hưởng đến quá trình đông máu
Cao chiết ethanol của cây dây lức làm tăng tốc độ đông máu đáng kể khi dùng với liều100 mg/kg (p<0,05) và 200 mg/kg (p<0,01) Tác dụng của cao chiết ethanol xuất hiệnphụ thuộc vào liều lượng Tuy nhiên, cao chiết nước không gây ảnh hưởng đáng kểđến thời gian đông máu ở cả hai liều [8].
Ảnh hưởng đến sự phát triển của tóc
Regupathi và cộng sự (2016) đã nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanolcủa Eclipta alba và Lippia nodiflora đối với sự phát triển của tóc Trong đó, cao chiết5% và 10% của E alba và L nodiflora và hỗn hợp 5% E alba và 10% của cây L.nodiflora trong thành phần gel được bôi lên vùng da đã cạo của chuột đen, thí nghiệmđược đánh giá trong 30 ngày Kết quả nhận được cho thấy tốc độ lông mọc nhanhđáng kể [12].
Tác dụng chống tăng sinh và gây chết tế bào
Dịch chiết methanol và ethyl acetate của lá và thân cây dây lức có tác dụng chống tăngsinh và gây chết tế bào đối với dòng tế bào ung thư vú của con người Các cao chiết ởdải nồng độ 90-120 μg/mL có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [13].Tác dụng chống ung thư
Trang 19Nghiên cứu đánh giá tác dụng gây chết tế bào theo chương trình của các cao chiết từ lácây dây lức đối với dòng tế bào ung thư da được thực hiện bởi Thariny và cộng sự(2021) bằng phương pháp MTT (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium
cao chiết từ lá dây lức chống lại các tế bào ung thư da (B16-F10) với nồng độ khácnhau trong 24 giờ Kết quả của nghiên cứu này cho thấy, các cao chiết từ lá cây dâylức có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào gây ung thư da [14].
Nhóm tác giả Asritha và cộng sự (2021) đã có nghiên cứu đánh giá tác dụngchống ung thư của các cao chiết từ lá cây dây lức đối với dòng tế bào ung thư phổiA549 Kết quả cho thấy, các tế bào ung thư phổi được điều trị bằng chiết xuất lá câydây lức giảm đáng kể, giá trị IC đạt nồng độ 20 µg/mL [9].50
Kết quả nghiên cứu thử nghiệm MTT cho thấy sự ức chế tăng trưởng tế bàophụ thuộc vào liều lượng Trong các tế bào PC-3 (tế bào nghiên cứu ung thư tuyến tiềnliệt) được điều trị bằng chiết xuất lá cây dây lức có giá trị IC ở 40 µg/mL (Sharmila50và cộng sự, 2021) [15].
Hoạt tính kháng vi sinh vật
Hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ thân và lá của cây dây lức đã được nghiêncứu chống lại một số chủng vi sinh vật kiểm định: Staphylococcus aureus,Micrococcus luteus Proteus micrococcus luteus, và Shigella boydiii Aspergillus niger, và Candida albicans Dịch chiết ethanol cho thấy khả năng kháng khuẩn và khángnấm đáng kể, chúng thể hiện vùng ức chế từ 3 đến 12 mm Phần lớn các vùng ức chếđạt 6-10 mm đối với tất cả các sinh vật được thử nghiệm ngoại trừ 2 chủngStaphylococcus aureus và Micrococcus luteus Hoạt tính kháng khuẩn của các caochiết hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol của các bộ phận trên mặt đấtn-của cây dây lức được đánh giá đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh cho người: Tụcầu vàng (+ MTCC 96), Staphylococcus cholermidis (+ MTCC2639), Klebsiellapneumoniae (- MTCC432), Enterococcus faecalis (+MTCC 126), Shigella flexneri (-MTCC 1457), Staphylococcus aureus kháng methicillin (+) phân lập lâm sàng,Micrococcus luteus (+MTCC 106), Salmonella paratyphi B (-) phân lập lâm sàng,Salmonella typhi (- MTCC733), Pseudomonas aeruginosa (- MTCC 424),Escherichia coli (- MTCC 2939), Vibrio cholerae (- MTCC 3906) và nấm (Candida
Trang 20albicans, Candida krussie Trichophyton mentagrophytes)., Tất cả các cao chiết có tácdụng ức chế cả vi khuẩn và nấm Trong đó, cao chiết ethyl acetate cho thấy khả năngkháng khuẩn và kháng nấm mạnh nhất Giá trị MIC của chiết xuất ethyl acetate củacác bộ phận trên mặt đất nằm trong khoảng từ 0,078 đến 0,312 mg/mL Tương tự nhưvậy, đối với dịch chiết methanol của rễ, các giá trị MIC ở giữa 0,625 và 2,5 mg/mL.Cao chiết ethyl acetate của loài cây này có khả năng ức chế sự phát triển củaStaphylococcus aureus, vi khuẩn Salmonella và Malassezia gây bệnh viêm da mủ [8].Hoạt tính kháng viêm: Hoạt tính kháng viêm của cao chiết methanol của cây dây lứcđược thử nghiệm trên chuột Cao chiết methanol cho thấy hoạt tính chống viêm đángkể (p<0,001) tương đương với phenylbutazone Hoạt tính chống nhiễm trùng của caochiết này cũng rất tốt (p<0,001) tương đương với natri diclofenac Ngoài ra, cao chiếtnước của cây dây lức cho thấy khả năng kháng viêm ở chuột bị phù chân docarrageenan gây ra ở mức 100 và 200 mg/kg thể trọng (p<0,01) Đối với cao chiếtethanol không gây ra tác dụng chống viêm ở cả hai liều lượng Khả năng chống viêmcủa cyclo-pentano phenanthrenol được phân lập từ cây dây lức đã được nghiên cứubằng cách sử dụng các mô hình viêm in-vitro Kết quả chứng minh rằng cyclo-pentanophenanthrenol đã ức chế biểu hiện TNF-α, IL-1β và IL-6, NO giải phóng thông qua ứcchế iNOS, sinh tổng hợp prostaglandin thông qua ức chế PLA2 và COX-2 và kíchhoạt các mục tiêu nội bào, MAPK và NF-κB Khả năng chống viêm của cyclo-pentanophenanthrenol có thể là do ức chế quá trình phosphoryl hóa MAPK và chuyển vị NF-κB Phương thức tác dụng chống viêm của cao chiết methanol và hợp chất 5-hydroxy-3',4',7-trimethoxyflavone (HTMF) được phân lập từ cây dây lức đã được nghiên cứuin vitro Phân tích chế độ liên kết của HTMF trong enzyme LOX cho thấy rằng, sựhình thành liên kết hydro, tương tác kỵ nước và xếp chồng π-π có thể giải thích cho sựliên kết của HTMF Kết quả động lực học phân tử cho thấy sự tương tác của HTMFvới LOX và tính ổn định của phức hợp phối tử-enzyme được duy trì trong suốt quátrình mô phỏng [8].
Hoạt tính chống oxy hóa
Tiềm năng chống oxy hóa của cao chiết methanol của cây dây lức được đánh giá môhình in vitro bằng cách sử dụng hoạt tính chống oxy hóa tổng, khả năng khử gốc tựdo, gốc anion superoxide, gốc hydroxyl, hydro peroxide, loại bỏ oxit nitric và tổng
Trang 21hàm lượng phenolic Cao chiết methanol thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh ở cácnồng độ: 50, 100, 200 và 400 μg/mL lần lượt là 58,96%, 63,07%, 68,29% và 74,59%,tương đương với chất chống oxy hóa phổ biến α-tocopherol (400 μg/mL) Cao chiếtmethanol cũng thể hiện khả năng khử hiệu quả, loại bỏ gốc tự do, loại bỏ gốc anionsuperoxide, loại bỏ gốc hydroxyl, loại bỏ gốc hydro peroxide và loại bỏ oxit nitric.Hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết này được xác định là 2-(3, 4-dimethoxyphenyl)-5hydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one (5-hydroxy-3', 4', 7-trimethoxyflavone) cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rất tốt thông qua tất cả cácthử nghiệm chống oxy hóa và cũng ức chế đáng kể quá trình peroxy hóa lipid ở nồngđộ 50 μg/mL [8].
1.3 Tình hình nghiên cứu và khả năng ứng dụng của cây dây lức
Trong y học cổ truyền, các bộ phận phía trên mặt đất của cây dây lức được sửdụng như thuốc giảm đau, làm dịu, kháng khuẩn, giải nhiệt, hen suyễn, cây được chếbiến thành thuốc đắp trị mụn nhọt Dịch chiết của lá và thân được sử dụng cho trẻ emđể chữa chứng khó tiêu và cho phụ nữ sau khi sinh Trong hệ thống y học Ayureda vàUnani, cây được sử dụng làm thuốc lợi tiểu và hỗ trợ điều trị bệnh tim, viêm phế quản,sốt, đau khớp gối và sỏi, v.v [8].
Ở Đài Loan, cây dây lức được sử dụng trong các bài thuốc dân gian để điều hòamiễn dịch, chống viêm, sát trùng, chống ho, hạ sốt Đã có nghiên cứu khẳng định ứngdụng dược học của cây dây lức đối với các bệnh ngoài da và trong dược học cổ truyềnđể điều trị mụn nhọt, bỏng da [16].
Chiết xuất ethanol của dây lức có khả năng hỗ trợ phòng chống sỏi niệu bằng cáchgiảm độ bão hòa của nước tiểu với canxi oxalate và có đặc tính lợi tiểu[17].Balamurugan và cộng sự đã chứng minh rằng γ-sitosterol được phân lập từ dịch chiếtmethanol của cây dây lức có hoạt tính ngăn ngừa và điều trị bệnh đái tháo đường dostreptozotocin gây ra[18].
Ở Việt Nam, từ lâu cây dây lức đã có mặt trong các bài thuốc dân gian giúp giảicảm, chống viêm, mụn nhọt, mề đay, dị ứng thời tiết Tuy nhiên, cho đến hiện nayhoàn toàn chưa có công bố khoa học về các thành phần hóa học, tác dụng dược lý củaloại cây này.
Trang 22Với khả năng sinh trưởng và phát triển tốt, không mất công chăm bón và cáctác dụng dược lý và cây Dây lức mang lại, sau khi có những đánh giá và nghiên cứuđầy đủ thì tiềm năng ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm có lợi cho sức khỏe từ câydây lức là rất lớn Hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học - Trường Đại họcThủy lợi đang nghiên cứu dòng sản phẩm dầu tắm thảo dược từ loài cây này, bước đầuđã có những đánh giá sơ bộ về khả năng kháng viêm, kháng vi sinh vật, thành phần visinh và kim loại nặng trong sản phẩm để có cơ sở khoa học về việc sử dụng loài dâylức trong dân gian và khả năng bào chế loài này thành sản phẩm tiện dụng, tốt cho sứckhỏe con người.
Trang 23CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu
Cây dây lức (Phyla nodiflora) được trồng tại xã Thắng Lợi, huyện Văn Giang,tỉnh Hưng Yên Mẫu được thu vào ngày 9/6/2022 Mẫu cây được định danh khoa họcbởi Tiến sỹ Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam Mẫu cây dây lức sau khi thu về được làm sạch sơbộ, rửa sạch đất, cát bám trên cây, sau đó phơi khô Tiêu bản được lưu tại Phòng thínghiệm Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Thủy lợi Mẫu khô được bảo quảntrong túi nilon kín tại vị trí khô ráo, tránh ánh nắng trực tiếp cho đến khi tiến hành thínghiệm
Hình 2.1 Cây dây lức tại Văn Giang, Hưng Yên2.1.2 Hóa chất
Nghiên cứu sử dụng những hóa chất thuộc Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinhhọc, Trường Đại học Thủy lợi Các hóa chất khác dùng trong phân tích thuộc các hãngFisher Scientific (Loughborough, Anh), Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Mỹ) và củaTrung Quốc Cụ thể các loại hóa chất dùng được liệt kê ở bảng dưới đây:
Trang 24Bảng 2.1 Các loại hóa chất được sử dụng
1 Methanol Dùng để tạo cao chiết và đánh giá hoạt tính2 Ethyl acetate Dùng để tạo cao chiết
5 Ethanol Dùng để tạo cao chiết tổng ethanol6 Pb(CH3COO)2 Dùng để định tính flavonoid
Dùng để định tính polyphenol và tannin, xác định năng lượng khử của cao chiết
15 CH3COOK Dùng để xác định hàm lượng flavonoid
16 Quercetin Dùng làm chất chuẩn xác định hàm lượng flavonoid17 Ascorbic acid Dùng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa tổng
Trang 2520 TCA Dùng để đánh giá năng lực khử của các cao chiết21 Na2HPO 12H42O Pha dung dịch đệm sử dụng trong đánh giá năng lực khử của cao chiết
22 NaH2PO 2H42O Pha dung dịch đệm sử dụng trong đánh giá năng lực khử của cao chiết
23 DMSO 10% Pha cao chiết xác định hoạt tính sinh học24 Tween 80 10% Pha cao chiết xác định hoạt tính sinh học
26 MgSO4.7H2O Pha môi trường Hansen2.1.3 Các dụng cụ và thiết bị
Đề tài được thực hiện dựa trên các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm của Phòng thínghiệm Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Thủy lợi và Trung tâm Sinh học phântử Nghĩa đô – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam Các thiết bị, máy móc chính được liệt kê ở bảng 2 và 3.
Bảng 2.2 Các dụng cơ bản được sử dụng
1 Bình định mức: 1000 mL, 100 mL, 250 mL Trung Quốc
3 Pipet thủy tinh 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL Trung Quốc4 Pipet man các kích thước khác nhau Trung Quốc
7 Ống đong các kích thước: 25 mL, 100 mL Việt Nam
9 Bình nón các kích thước: 100 mL, 250 mL Trung Quốc10 Bình cầu cô quay: 100 mL, 250 mL Buchi, Thụy Sỹ
Trang 2611 Ống falcon 15mL, 45 mL Eppendorf
16 Bình duran các kích thước: 250 mL, 500 mL Đức
22 Đầu côn, ống eppendorf, ống nghiệm Trung Quốc
Bảng 2.3 Các thiết bị máy móc được sử dụng
STTTên dụng cụModel, thông số kỹthuật, hãng sản xuất
Mục đích dùng trong nghiêncứu
2 Nồi hấp khử
6 Bếp điện gia nhiệt
RV- VELP, Ý Chưng cách thủy trong phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học7 Bể siêu âm Elma S120, Đức Dùng để chiết mẫu và rửa dụng
cụ