nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây ngọc nữ biển thu hái tại hải phòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG ---

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

-🙦 🕮 🙤

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY NGỌC NỮ BIỂN THU HÁI TẠI

HẢI PHÒNG

TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU BIỂN

HẢI PHÒNG, NĂM 2023

2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG -🙦 🕮 🙤 -

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY NGỌC NỮ BIỂN THU HÁI TẠI

HẢI PHÒNG

TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU BIỂN

BỘ MÔN: DƯỢC LIỆU – DƯỢC CỔ TRUYỀN

NHÓM THỰC HIỆN : NHÓM 5 TỔ 2 – LỚP DƯỢC K9B1 VŨ THU TRANG

2 LƯU PHƯƠNG THÚY 3 NGUYỄN HẢI VÂN 4 KIỀU HẢI YẾN 5 PHẠM HOÀNG YẾN

HẢI PHÒNG, NĂM 2023

3 MỤC L C Ụ

1.Tổng quan về chi Clerodendrum 13

1.1.Vị trí phân loại khoa học của chi Clerodendrum[6]: 13

1.2.Đặc điểm thực vật của chi Clerodendrum 13

1.3 Phân bố Chi Clerodendrum 14

1.4 Thành phần hoá học của chi Clerodendrum 15

1.5 Tác dụng và công dụng của Chi Clerodendrum 19

2 Tổng quan về Clerodendrum inerme (L.) Gaertn 21

2.1 Vị trí phân loại Clerodendrum inerme (L.) Gaertn [6] 21

2.2 Phân bố Clerodendrum inerme (L.) Gaertn 21

2.3 Thành phần hóa học Clerodendrum inerme (L.) Gaertn 22

2.4 Tác dụng sinh học của Clerodendrum inerme (L.) Gaertn 24

2.5.Công dụng: 28

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 30

NGHIÊN CỨU 30

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu .30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Đặc điểm thực vật Ngọc nữ biển 31

5 LỜI CẢM ƠN

Trước tiên với tình cảm sâu sắc và chân thành nhất, cho phép chúng em được bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả thầy cô bộ môn Dược liệu- Dược cổ truyền đã tạo điều kiện hỗ trợ, giúp đỡ chúng em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề

Vkinh Qvốgiph Bvàtrá

góp quý báu của quý thầy cô để kiến thức của chúng em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn đồng thời có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức của mình

Chúng em xin chân thành cảm ơn.

6 DANH M C CH ỤỮ VIẾT T T Ắ

Chữ Ý nghĩa C.inerme Clerodendrum inerme (L.) Gaertn C serratum Clerodendrum serratum

C bungei Clerodendrum bungei C infortunatum Clerodendrum infortunatum C trichotomum Clerodendrum trichotomum C chinense Clerodendrum chinese C Grayi Clerodendrum Grayi CFU/ml Colony Forming Units/ml

( Đơn vị hình thành khuẩn lạc / ml ) S.D Độ lệch chuẩn

DPPH 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl EtOAc Atyl acetat

IC50 Nồng độ ức chế tối đa một nửa SKLM Sắc ký lớp mỏng

7 DANH M C BỤẢNG

Bảng 1 Hàm lượng polyphenol của hai hợp chất chính trong lá cây C.inerme

Bảng 2 Dữ liệu phân tích và vật lý của hợp chất 1 và hợp chất 2 trong lá cây C.inerme

Bảng 3 Giá trị IC50 của mỗi hợp chất với tiêu chuẩn tương ứng được sử

dụng trong nghiên cứu này.

Bảng 4 Kết quả định tính hóa học Bảng 5 Kết quả định tính bằng SKLM

Bảng 6 Bảng so sánh màu sắc định tính các phân đoạn

8 DANH M C HÌNH ỤẢNH

Hình 1.1 Clerodendrum Viscosum Vent ( Cây Bạch đồng nam )

Hình 1.2 Clerodendrum japonicum (Cây Xích đồng nam) Hình 1.3 Hình ảnh cây Ngọc nữ biển

Hình 1.4 Hoạt tính chống oxy hóa của hai hợp chất phân lập được là squalene và axit linolenic ester

(A) Hoạt tính DPPH; (B) Oxit nitric; (C) Hydrogen peroxide và (D) Xét nghiệm năng lượng khử

Hình 3.1 Hình ảnh cây Ngọc nữ biển Hình 3.2 Lá cây Ngọc nữ biển Hình 3.3 Hoa của cây Ngọc nữ biển Hình 3.4 Quả của cây Ngọc nữ biển Hình 3.5 Đặc điểm hình thái thực vật học Hình 3.6 Mẫu tươi Ngọc nữ biển Hình 3.7 Mẫu dược liệu đã được rửa sạch Hình 3.8 Sấy mẫu dược liệu ở 35-40°C

Hình 3.9 Mẫu nhãn dán và tiêu bản sau khi dán nhãn, hoàn thành Hình 3.10 Mẫu dược liệu Ngọc nữ biển ngâm trong cồn

9

Hình 3.11 Cắt mẫu dược liệu

Hình 3.12 Mẫu lá và thân dược liệu sau khi tẩy nhuộm Hình 3.13 Phương pháp lên tiêu bản giọt ép Hình 3.14 Lên tiêu bản vi phẫu thân cây Ngọc nữ biển Hình 3.15 Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi

Hình 3.16 Vi phẫu lá cây Ngọc nữ biển trên vật kính 4X.Hình 3.17 Vi phẫu lá cây Ngọc nữ biển trên vật kính 10XHình 3.18 Sơ đồ tổng quát vi phẫu của lá Ngọc nữ biển Hình 3.19 Vi phẫu thân cây của Ngọc nữ biển trên vật kính 4XHình 3.20 Vi phẫu thân cây Ngọc nữ biển trên vật kính 10XHình 3.21 Sơ đồ tổng quát vi phẫu thân cây Ngọc nữ biển Hình 3.22 Quy trình chiết phân đoạn dược liệu biển Hình 3.23 Kết quả của phản ứng định tính sterol Hình 3.24 Kết quả của phản ứng định tính chất béo

Hình 3.25 Hình ảnh trước và sau phản ứng định tính carotenoid Hình 3.26 Kết quả định tính Polyphenol

Hình 3.27 Ống 1 và 2 trước định tính Tanin Hình 3.28 Ống 1 sau định tính Tanin

10

Hình 3.29 Ống 2 sau định tính Tanin Hình 3.30 Hình ảnh chấm SKLM

11 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Ngọc nữ biển là cây mọc tự nhiên, sống phổ biến ở các nước ven biển nhiệt đới và Ðông Nam Á, Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Malaysia, Indonesia, Philippines… Ở Việt Nam, cây Ngọc nữ biển sống trải dài dọc bờ biển từ Bắc đến Nam Từ lâu nó đã được coi là một loại thuốc quý chữa được rất nhiều bệnh trong dân gian Cây Ngọc nữ biển có vị đắng, tính hàn, mùi thơm, ít độc; có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tán ứ trừ thấp, thư cân hoạt lạc,….dịch lá có tác dụng giải nhiệt, hạ sốt, Mặc dù có ý nghĩa to lớn về mặt y học dân gian, song việc phân tích đặc điểm cấu tạo, nghiên cứu thành phần hóa học vẫn chưa được đầy đủ, rõ ràng Vì vậy, cần đẩy mạnh việc thu thập mẫu, nghiên cứu để định hướng phát triển nguồn dược liệu này trong thời gian tới nhằm phục vụ công tác kiểm nghiệm chất lượng dược liệu và mở ra các nghiên cứu tiếp theo về hóa học và tác dụng dược lý của loài Ý nghĩa :

- Khoa học : Góp phần xây dựng được quy trình thu hái, chiết xuất dược liệu cây Ngọc nữ cho năng suất cao, chất lượng an toàn Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp bổ sung phần nào vào tài liệu nghiên cứu cũng như giảng dạy của giảng viên

- Thực tiễn : Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở để phổ biến về quy trình, kỹ thuật thu hái, chiết xuất một số thành phần hóa học quan trọng cho nghiên cứu viên Góp phần bảo tồn đa dạng sinh học, mở rộng diện tích khai thác, thu hái mẫu đến nuôi trồng, chăm sóc cây Ngọc nữ biển ở Việt Nam

Mục tiêu :

23

EI-MS cho pic ion phân tử tại m/z 414 [M]* Phổ 'H NMR một tín hiệu multiplet ở 3,25 ppm đặc trưng cho proton ở C 3 có đính OH, một tín hiệu -multiplet ở Ôn 5,34 của proton trong liên kết đôi Sự có của nhóm OH và liên kết đôi C=C được khẳng định qua các dải hấp thụ v* 3434, 1645 cm mặt trên phổ IR Các số liệu phổ phân tích trên đây cùng với việc tham khảo tài liệu cho biết CE1 là nhóm B- sitosterol hay stigmast-5-en-3ß ol- [10].

-Theo nghiên cứu Elucidation of phytomedicinal efficacies of Clerodendrum inerme (L.) Gaertn đăng trên South African Journal of Botany tại tập 140, tháng 8 năm 2021, trang 356 – 364 của các tác giả Pallab Kar Dipu ,

Kumar Mishra Ayan , Roy, ArnabKumar Chakraborty Biswajit Sinha , ,

Arnab Sen cho biết [10] :

Sắc ký cột trọng lực của C inerme mang lại một số phân số được kết hợp thành hai phân số chính dựa trên sự giống nhau của cấu hình TLC Một phân tích về hàm lượng phenolic và flavonoid của hai phần này cho thấy các nhóm hợp chất này là thành phần chính trong lá của C inerme ( Bảng 1) Số lượng phenolics và flavonoid cao đáng ngạc nhiên trong các phân đoạn này đã thúc đẩy nỗ lực nghiên cứu chi tiết các thành phần chính trước khi phân tích khả năng chống oxy hóa tiềm năng trị liệu của các phân đoạn.

Bảng 1 Hàm lượng polyphenol của hai hợp chất trong lá cây C.inerme

Hợp chất Phenol (mg/g GAE) Flavonoid (mg/g QE) Hợp chất-1 (squalene) 215.34 112.21

Hợp chất-2 ( linolenic acid ester metyl 330.25 125.67

24

Bảng 2 Dữ liệu phân tích và vật lý của hợp chất 1 và hợp chất- -2 trong lá cây C.inerme

Hợp chất % C

Thành Lập H

Tình trạng thể chất

Màu sắc

Số lượng năng suất (mg) Hợp chất -1 (squalene) 87.21 11.93 Chất răn Màu

nâu tối 251.9 Hợp chất -2 (linodenic

acid ester metyl) 78.01 11.31 Chất rắn

Hai mươi ml thạch nóng chảy Mueller Hinton (45°C) được trộn vô trùng với 1000 µl huyền phù vi khuẩn (1–2 × 10 8 CFU /ml) và đổ vào các đĩa Petri vô trùng và giữ cho đông đặc Sau khi môi trường thạch đã cứng lại, các giếng có đường kính 8,0 mm được đục lỗ một cách vô trùng vào môi trường thạch bằng cách sử dụng đục nút chai vô trùng và các giếng được đổ đầy 100 µl mỗi hợp chất (10 mg/ml) Sau đó, các đĩa này được ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 37°C trong

-25

tủ ấm Penicillin (10 đơn vị/ml) (Pfizer) và Streptomycin (10 µg/ml) (Abbott) lần lượt đóng vai trò kiểm soát dương tính đối với vi khuẩn Gram dương và Gram âm Đường kính của vùng ức chế thu được (ZOI) được đo bằng phạm vi milimét (mm) gần nhất Vùng ức chế nhỏ hơn 9,0 mm không được xem xét Dung môi kiểm soát nước cất được đưa vào mọi thí nghiệm dưới dạng đối chứng âm Tất cả các mẫu đều được xét nghiệm ba lần và vùng kết quả ức chế được hiển thị là mức trung bình[10].

26

Chất chống oxy hóa tự nhiên có tầm quan trọng to lớn như chất dinh dưỡng và chất bổ sung sức khỏe Các thử nghiệm lâm sàng đã tiết lộ rằng có mối tương quan nghịch giữa việc ăn trái cây và rau quả với sự xuất hiện của các rối loạn như viêm, bệnh tim mạch, ung thư, lão hóa và trầm cảm, (Durackova, 2010) Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá C inerme được xác định bằng xét nghiệm loại bỏ gốc tự do DPPH được minh họa trong Bảng 3 Phương pháp này dựa vào khả năng khử DPPH − của một chất chiết hoặc hợp chất Hợp chất 2 dường như hiệu quả hơn hợp chất 1 và mang lại giá trị IC50 (164,56 ± 1,15) thấp hơn đáng kể so với axit ascorbic (203,20 ± 1,90) Khả năng tăng cường của các thành phần của hợp chất 2 trong việc cung cấp một electron hoặc nguyên tử hydro dường như tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình loại bỏ gốc DPPH được cải thiện (Hình 1.4A)[10].

Bảng 3 Giá trị IC50 của mỗi hợp chất với tiêu chuẩn tương ứng được sử dụng trong nghiên cứu này[10]

Thông số Hợp chất-1 (squalene)

Hợp chất-2

(ester methyl axit linolenic) Tiêu chuẩn DPPH 194.00 ± 2.31*** 164.56 ± 1.15*** 203,2 ± 1,9 (Axit

ascorbic) Oxit nitric 178.18 ± 3.54*** 128.58 ± 2.50*** 61,17 ± 0,41

(Curcumin) Hydro Peroxide295.52 ± 11.49** 289.30 ± 5.90** 2185,2 ± 187,4

(Natri Pyruvat)

[Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± S D ( n = 3) α p<0,05; βp < 0,01; γ p<0,001; ψ Không có ý nghĩa khi so sánh với tiêu chuẩn].-

Oxit nitric (NO) là một gốc tự do gây hại, chịu trách nhiệm phá hủy một số phân tử sinh học trong cơ thể con người dẫn đến sản xuất peroxynitrite (ONOOˉ) khi phản ứng với gốc superoxide Điều thú vị là Hợp chất 1 và 2 cho thấy tiềm năng hoạt động loại bỏ NO cao hơn đáng kể so với hợp chất tiêu

28

chuẩn (curcumin) ( Hình 1.4B) Những kết quả này cho thấy các thành phần của C inerme có thể mang lại ái lực quan trọng đối với anion superoxide cản trở sự hình thành peroxynitrite

Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), một chất oxy hóa khác, tích tụ trong tế bào và chuyển thành gốc hydroxyl (OH • ) khi tiếp xúc với các kim loại chuyển tiếp khác như Fe 2+ , Cu 2+, v.v ( Ray và Husain 2002 ; Valko và cộng sự, 2004 ) (Hình 1.4 C) Hợp chất 1 và 2 được phát hiện là chất khử H2O2 mạnh để vô hiệu hóa tác dụng của ROS và có thể có khả năng ngăn ngừa các loại rối loạn liên quan đến stress oxy hóa khác nhau như bệnh ngoài da, bệnh thận , bệnh Alzheimer và bệnh Parkinson ( Lapidot và cộng sự, 2002 )

Khả năng chống oxy hóa khử sắt của các hợp chất như được minh họa trong Hình 1.4D, cho thấy khả năng khử tuyệt vời của chúng, trong đó hợp chất 2 có khả năng khử tối đa khi so sánh với hợp chất 1 và chất chuẩn (BHT) Giá trị IC50 chi tiết của các thử nghiệm chống oxy hóa trong ống nghiệm tương ứng được liệt kê trong Bảng 3

- Loài C inerme có vị đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tán ứ, trừ thấp, dịch lá có tác dụng giải nhiệt, hạ sốt Trong dân gian, cây dùng để trị nhiều bệnh như phong thấp, đau dạ dày, cảm mạo, sốt rét, viêm gan… Lá dùng ngoài trị eczema, nấm tóc, chữa các vết thương chảy máu Vùng Cà Mau người ta dùng lá và rễ làm thuốc hạ nhiệt Quả và thân cây vạc mỏng, ngâm với rượu, mật ong, trứng gà làm thuốc bổ trị đau lưng

-Thực vật thuộc chi Clerodendrum từ lâu đã được dùng làm thuốc trừ sâu thảo mộc rất hiệu quả với tác dụng gây ngán ăn và ức chế sinh trưởng côn trùng Một số bài thuốc chữa bệnh từ loài C inerme:

29 • Bài thuốc chữa bệnh cảm lạnh, đau mỏi gân cốt, đau dây thần kinh: 30g rễ loài C inerme sắc nước uống ít nhất 3 lần trong ngày, uống liên tục trong 3-4 ngày

• Chữa vết thương đau nhức, bầm tím do bị ngã:

Giã lá tươi và thêm ít rượu, hơ nóng để đắp ngoài vùng bị đau • Bài thuốc chữa đau lưng:

Chuẩn bị 1 kg thân loài C inerme khô, 10 quả trứng gà, 2l rượu Đầu tiên cắt mỏng thân cây, sao vàng, hạ thổ, sau đó cho cây vào ngâm với 2l rượu cho ra hết chất thuốc màu đỏ thì bỏ bã Tiếp tục đập 10 quả trứng gà lấy lòng đỏ khuấy tan cho nổi bọt, cho thêm trứng mật ong vào rượu thuốc Ngày uống 1 ly nhỏ lúc sáng sớm và trước khi đi ngủ, có tác dụng trị suy thận, đau khớp ngang hông

30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Cây Ngọc nữ biển là loại cây ngập mặn được thu hái tại Phù Long Cát Hải- TP Hải Phòng Tọa độ : 20 47’ Bắc, 106 56’ Đông.oo

-2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp làm tiêu bản Phương pháp làm tiêu bản vi phẫu

Phương pháp lý hóa – định tính hóa học dược liệuPhương pháp tổng quan tài liệu

34 [12]

[13]

Hình 3.5 Đặc điểm hình thái thực vật học

35 a Phương pháp làm tiêu bản khô

Chu n b m u Ng c n ẩịẫọữ biển

Chọn những mẫu không quá già, cũng không quá non, chọn những đặc điểm điển hình thể hiện được cơ quan dinh dưỡng và cơ quan sinh sản của mẫu[1]

Hình 3.6 Mẫu tươi cây Ngọc nữ biển

Rửa mẫu bằng nước sạch và dùng bàn chải mềm chải sạch muối và đất cát trên bề mặt mẫu[1]

Hình 3.7 Mẫu dược liệu đã được rửa sạch

36 Ép và s y m u tiêu b n ấẫả

Ép và sấy mẫu khô là hai quá trình không tách rời nhau, trong khi sấy cần ép chặt mẫu để lá khỏi nhăn nheo, để mẫu cây nằm đúng vị trí dán mẫu[1]

Sắp xếp mẫu cây trên giấy trắng và dưới một lớp giấy thấm để cố định trước khi sấy Đặt trên tờ báo có kích thước gấp đôi kích thước mẫu (một nửa làm nền, một nửa gập đậy lên)[1]

Sau khi xếp mẫu lên tờ báo gập nửa tờ báo còn lại trên mẫu Đặt các mẫu lên cặp ép, buộc cặp ép lại sấy ở 35 40°C trong khoảng 8- -12h Trong quá trình sấy cần thường xuyên thông thoáng Lấy cặp ép ra buộc lại, thay báo và sấy cho đến khô[1]

Hình 3.8 Sấy mẫu dược liệu ở 35-40°C

Giấy để khâu có kích thước khổ A3 làm bằng bìa trắng dày Đặt mẫu đã ép và sấy khô lên bìa và khâu, dán vào bìa[1]

37

Khi đã dán xong ở góc phải phía dưới của tiêu bản ta dán nhãn vào Kích thước nhãn 8x13 cm Nhãn thường chứa thông tin là: cơ quan lưu trữ tiêu bản, số hiệu tiêu bản, tên mẫu, tên khoa học, họ, thời gian thu mẫu, người định danh[1].

Hình 3.9 Mẫu nhãn dán và tiêu bản sau khi dán nhãn, hoàn thành

3.1.2 Đặc điểm vi học:

Làm một tiêu bản vi học , cần tiến hành theo các bước sau:

Sử dụng mẫu ngâm trong cồn 70 Đối với mẫu vật là lá thì hình dạng lá phải o

còn nguyên vẹn, chọn những lá không già quá cũng không non quá (lá bánh tẻ) Đối với mẫu vật là cành, thân hoặc rễ cây thì nên chọn những đoạn tương đối thẳng có đường kính từ 0,1 0,5 cm Các mẫu khô nên được luộc hay ngâm - nước sôi trước khi cắt, thời gian ngâm hay luộc tùy thuộc vào mức độ rắn chắc của mẫu vật[1]