lipocalin trong nước mắt của người mắc bệnh võng mạc đái tháo đường

Có ba loạitinh thể quang tử: một chiều 1D, hai chiều 2D và ba chiều 3D, a Tinh thể quang tử 1D b Tinh thể quang tử2Dc Tinh thể quang tử 3D Cấu trúc tinh thể quang tử PC được tạo thành từ

Đ I H C QUỐỐC GIA HÀ N IẠ ỌỘTRƯỜNG Đ I H C KHOA H C T NHIÊNẠ ỌỌỰ

KHOA HÓA H CỌ- - -   - - -

L p : K66 TT Hóaớ

MỤC LỤC1.TỔNG QUAN

Giới thiệu về vấn đề nghiên cứu

1.1 Tổng quan tinh thể quang tử

1.2 Tổng quan về tinh thể quang tử opal nghịch đảo1.3 Tổng quan bệnh võng mạc đái tháo đường

1.4 Lipocalin trong nước mắt của người mắc bệnh võng mạc đái tháo đường

2 THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất và dụng cụ2.1.1 Hóa chất

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ2.2 Quy trình tổng hợp PC và IOPC

2.2.1 Chế tạo PC

2.2.1 Chế tạo IOPC PEGDA/ SiO2

2.2.3 Gắn lipocalin lên IOPC và PC

2.3 Các kết quả chế tạo PC, IOPC và cảm biến lipocalin

2.3.1 Kết quả hiển vi huỳnh quang vật liệu PC và IOPC khi được gắnlipocalin

2.3.2 Kết quả đo phản xạ vật liệu PC và IOPC được gắn lipocalin

1 TỔNG QUAN

1 Giới thiệu về vấn đề nghiên cứu

1.1 Tổng quan tinh thể quang tử Giới thiệu về tinh thể quang tử

Tinh thể quang tử (Photonic crystal - PC) được định nghĩa là loại vật liệu có chỉsố khúc xạ được bố trí tuần hoàn theo thứ tự, hai hoặc cả ba chiều Có ba loạitinh thể quang tử: một chiều (1D), hai chiều (2D) và ba chiều (3D),

a) Tinh thể quang tử 1D b) Tinh thể quang tử2D

c) Tinh thể quang tử 3D Cấu trúc tinh thể quang tử

PC được tạo thành từ các vật liệu có hằng số điện môi khác nhau, có thể tácđộng lên sự lan truyền của sóng điện từ tương tự như cách các hố nănglượng tuần hoàn trong các tinh thể bán dẫn tác động lên chuyển động

tinh thể Ở đây, một vùng trống trong cấu trúc năng lượng photon là những kiểulan truyền mà sóng điện từ không được phép, hay những dải bước sóng khônglan truyền được Điều này dẫn đến các hiện tượng như ngăn cản phát xạ tự

thấp.Bản chất của các hiện tượng quan sát được là sự nhiễu xạ của sóng điện từ,trong đó chu kỳ không gian của các cấu trúc tinh thể phải có cùng kích cỡ

quang tử làm việc với ánh sáng Bước sóng ánh sáng khả kiến (400–800 nm).Các màu sắc của của tinh thể quang tuân theo định luật nhiễu xạ Bragg Một hệtinh thể quang tử tự nhiên khác có thể quan sát được trên cánh một sốloài bướm, như loài Morpho,

Tinh thể quang tử trong tự nhiên là opal

Các tinh thể quang tử 1D, hay còn gọi là cấu trúc đa lớp Chúng bao gồm cáclớp xen kẽ của hai vật liệu có chiết suất khác nhau dẫn đến chiết suất thay đổituần hoàn theo một hướng nhưng đồng nhất theo hai hướng còn lại.

Các tinh thể quang tử 2D là những tinh thể trong đó chiết suất thay đổi theo haihướng trong khi không có sự thay đổi theo hướng thứ ba Điều này có thể đạt đượcbằng cách khoan các lỗ đối xứng hình tam giác hoặc hình vuông trong vật liệu cóchỉ số khúc xạ cao hoặc bằng cách xếp chồng các hình trụ bằng bất kỳ vật liệuđiện môi nào trong không khí.

Tinh thể quang tử 3D là cấu trúc trong đó chiết suất thay đổi theo cả ba hướngcủa không gian chẳng hạn như bằng cách xếp chồng các quả cầu của một số vậtliệu điện môi trong không khí

1.2 Tổng quan về tinh thể quang tử opal nghịch đảo Giới thiệu về tinh thể quang tử opal nghịch đảo

Tinh thể quang tử opal nghịch đảo (Inverse opal photonic crystal - IOPC) là mộtcấu trúc ba chiều được hình thành từ quá trình tự sắp xếp của các hạt tiểu cầu điệnmôi trong dung dịch, có các lớp không khí xen kẽ với vật liệu tạo các mặt phẳngphản xạ nên chỉ số khúc xạ của không khí bằng 1 IOPC phản xạ ánh sáng dựatrên định luật Bragg’s

IOPC phản xạ ánh sáng Các phương pháp chế tạo tinh thể quang tử opal nghịch đảo

Phương pháp tự lắp ráp (Self Assembly) là một quá trình sử dụng các hạt nhựahoặc kính có kích thước nhỏ để xếp thành cấu trúc lỗ rỗng ba chiều Các lỗ rỗngtrong PC được lấp đầy bằng một vật liệu khác có chỉ số khúc xạ cao hơn và loạicác hạt chưa phản ứng bằng hóa chất hoặc nung cháy Phương pháp tự lắp ráp làmột phương pháp chế tạo IOPC đơn giản và hiệu quả để tạo ra các vật liệu có tínhchất quang học đặc biệt.

Cách làm: chọn các hạt cầu nhỏ có kích thước và hình dạng đồng nhất, thường làcác hạt polystyrene hoặc silica Sau đố đổ dung dịch chứa các hạt cầu vào mộtkhuôn hoặc một bề mặt phẳng Để dung dịch khô và các hạt cầu tự sắp xếpthành một cấu trúc PC ba chiều có thứ tự cao Đổ một vật liệu khác vào các lỗrỗng giữa các hạt cầu để tạo ra một cấu trúc composite Loại bỏ các hạt cầu bằngcách nung nóng hoặc hòa tan trong dung môi để thu được IOPC.

Ứng dụng của tinh thể quang tử opal nghịch đảo

IOPC có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như chất giao diện quang tử, vật liệuchức năng, cảm biến và xúc tác Có hai ứng dụng được sử dụng trong các cảmbiến dựa trên IOPC như:

 Gây ra màu sắc khác nhau do cấu trúc nano xốp Các màu sắc khác nhaucó thể được quan sát trực tiếp bằng mắt thường khi chỉ số khúc xạ trungbình của vật liệu thay đổi Nồng độ protein có thể gây ra sự thay đổi vềchỉ số khúc xạ và sự thay đổi về màu sắc.

 Cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cho việc phát hiện các chất phát quang Nênsử dụng để giảm giới hạn phát hiện của các phân tích nồng độ thấp vớicác chất huỳnh quang, chẳng hạn như protein chỉ thị sinh học trong mộtsố bệnh cụ thể.

1.3 Tổng quan bệnh võng mạc đái tháo đường

Hiện nay, đái tháo đường là một vấn đề y tế công cộng mang tính chất toàn cầu,ảnh hưởng đến sức khoẻ của nhiều người, nhất là trong độ tuổi lao động trêntoàn thế giới Đái tháo đường là một bệnh mãn tính, xảy ra khi tuyến tụy khôngsản xuất đủ insulin, hoặc khi cơ thể không thể sử dụng hiệu quả insulin mà nótạo ra Điều này dẫn đến tăng nồng độ glucose trong máu (tăng đường huyết) Phân loại

 Tiểu đường tuýp 1: nguyên nhân tự miễn, đây là hậu quả của trình trạngtuyến tụy không có khả năng sản xuất đủ hormone isulin có vai trò kiểmsoát đường huyết, khiến nồng độ đường trong máu tăng cao Triệu chứng: uống nước nhiều, tiểu nhiều, sụt cân nhiều Thường gặp ở lứa tuổi thanhthiếu niên.

 Tiểu đường tuýp 2: nguyên nhân liên quan đến tình trạng kháng insulin vàsự giảm bài tiết insulin Bệnh xảy ra cũng do một số yếu tố liên quan khácnhư các bệnh liên quan đến ruột, gan, thận, thần kinh…Tiệu chứng ít hơn

tuýp 1 như: đột nhiên sụt cân, đi khám sức khỏe, xét nghiệm đường huyếtphát hiện bệnh Thường gặp ở độ tuổi trung niên.

Bệnh võng mạc đái tháo đường là biến chứng cực kỳ nguy, một trong nhữngnguyên nhân hàng đầu gây mất thị lực trên thế giới Nếu không được điều trị vàphát hiện kịp thời sẽ gây ra những tổn thương nặng nề ở đáy mắt như: phùhoàng điểm, tân mạch võng mạc, xuất huyết dịch kính, xuất huyết võng mạc,…dẫn đến tình trạng mù lòa gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộcsống của người bệnh Đối với đái tháo đường tuýp 1, võng mạc sẽ bị tổn thươngtrong vong 5 năm phát hiện bệnh, còn ở đái tháo đường tuýp 2, võng mạc có thểbị tổn hương trước khi pháp hiện bệnh Điều đáng nói là, dù võng mạc đã tổnthương nhưng thông thường, người bệnh đái tháo đường ít cảm nhận được sựthay đổi ở thị lực Đến khi xuất hiện những triệu chứng rõ ràng như nhìn mờ,tầm nhìn dao động, nhìn hình thấy đốm đen, ,

1A Võng mạc bình thường 1B Võng mạc bị đái tháo đườngVõng mạc của người bình thường và người bị võng mạc đái tháo đườngNguyên nhân của bệnh võng mạc đái tháo đường là do có quá nhiều đường trongmáu làm hỏng những mạch máu nhỏ (mao mach) nuôi dưỡng võng mạc Cácmao mạch dãn ra để cho máu, các chất dịch, mỡ… thấm qua thành mao mạch vàlàm cho võng mạc bị phù Nếu vùng phù này ở hoàng điểm sẽ làm cho mắt nhìnmờ Ngoài ra, bệnh đái tháo đường cũng làm giảm tốc độ hồng cầu, tăng khảnăng kết tụ của tiểu cầu, tăng độ quánh của máu… do đó làm cho các mao mạchbị tắc, gây ra thiếu máu võng mạc Võng mạc không được nuôi dưỡng đầy đủ sẽsinh ra những mạch máu mới, bất thường còn gọi là tân mạch, có thể vỡ và gâychảy máu trong mắt.

Cách phát hiện và sàng lọc Bệnh nhân võng mạc đái tháo đường phải đượckhám mắt toàn diện bao gồm: đo và kiểm tra thị lực; khám bằng sinh hiển vi; đonhãn áp; soi góc tiền phòng và kiểm tra đáy mắt để đánh giá mức độ của bệnh.Ngoài ra có thể sử dụng chụp mạch huỳnh quang để diều tra rõ nguyên nhângiảm thị lực, xác định mao mạch rò rỉ và sử dụng hướng dẫn để điều trị phùhoảng điểm.

Như vậy hiện nay, việc phát hiện bệnh võng mạc đái tháo đường rất tốn nhiềuthời gian, người bệnh phải được chuẩn đoán, khám bệnh, cận lâm sàng thì mớiphát hiện được ra bệnh Để quá trình này rút ngắn đi thời gian và tiền bạc, vậtliệu IOPC nhờ sự quang học của nó và có thể gắn nước mắt của người bệnh đểphát hiện bệnh võng mạc đái tháo đường một cách nhanh chóng.

1.4 Lipocalin trong nước mắt của người mắc bệnh võng mạc đái tháo đường.Theo Khoa mắt BMC của Trung tâm BioMed Đức đã nghiên cứu và chỉ ra rằngtrong nước mắt của người có 6 nhóm protein chính đó là: lactoferrin và sIgA(IgA bài tiết), albumin, chuỗi nặng của sIgA, alpha sIgA, lipocalin được gọi đơngiản là albumin prae đặc hiệu cho nước mắt (TSPA) và 6: lys ozyme

Kết quả xét nhiệm Rheumatoid Factor (Rf) nước mắt của người mắc bệnhvõng mạc đái tháo đường

1: lactoferrin và sIgA (IgA bài tiết), 2: albumin, 3: chuỗi nặng của sIgA, 4:alpha sIgA, 5: lipocalin và 6: lys ozyme.

Theo các nghiên cứu nồng độ của lipocanin trong nước mắt người bìnhthường là khoảng 12 mg/ml Tuy nhiên, nồng độ của LCN của bệnh nhân mắcbệnh võng mạc đái tháo đường là trên 2 mg/ml Dựa vào sự khác biệt này, cóthể nhận biết bệnh trên vật liệu IOPC.

 Dung dịch kỵ nước Polyetrafluoroethylene, Đài Loan Phosphate Buffered Saline pH = 7

 Ethanol absolute , Đài Loan

 Bột 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, Đài Loan LCN 1 Monoclonal antibody (10B10), Invitrogen, USA LCN 1 Polyclonal antibody, USA Invitrogen, 1 mg/ml Rabbit anti-LCN polyclonal IgG (ab87786, Abcam)

 Tấm kính 1,5x4 cm, đầu hút cho micropipet, kẹp (nhíp), hộp kín

2.2 Quy trình tổng hợp PC và IOPC

Phương pháp tự lắp ráp hạt silica và đổ PEGDA vào để tạo cấu trúc tinh thểquang tử 2D và sau ăn mòn thành IOPC được lựa chọn, do đơn giản dễ thực hiệnvà hiệu quả để tạo ra các vật liệu có tính chất quang học.

2.2.1 Chế tạo PCBước 1: Chuẩn bị

Rửa tấm kính bằng nước cất, tia lên 2 mặt Dùng khăn vải thấm ethanol và sấytấm kính đến khi khô Nhỏ dung dịch kỵ nước lên nghiêng tấm, để lớp kỵ nướctự khô sau đó sấy bằng máy sấy trong 5 phút.

Bước 2: Chế tạo PC

Siêu âm lọ epp đựng hạt sau đó ly tâm (4000 rpm, 10 phút) Hút nước sangmột lọ khác Cân một lượng 20 mg hạt và thêm 10 µL nước bảo quản hạt Dùngpipet khuấy và hút/nhả nhiều lần để phân tán sơ bộ hạt vào nước.

Thả giọt lên tấm kính kỵ nước, chờ 10 phút Đặt 3 tấm giấy ở hai đầu tấm kínhđể tạo độ dày có miếng PC Hạ từ từ tấm kính không bọc kỵ nước xuống, chạmchẹ vào giọt Thả tay ra và dùng kẹp bươm bướm để cố định hai đầu tấm kính.Đặt hệ hai tấm kính vào hộp nhựa kín, để qua đêm.

Nhỏ PEGDA vào khe giữa hai tấm kính Đặt nghiêng tấm kính mặt kỵ ở trên.Đặt hệ tránh ánh sáng trong 1 tiếng, sau đó chiếu đèn UV 312 nm Chiếu đènđến khi miếng PEGDA khô.

2.2.1 Chế tạo IOPC PEGDA/ SiO2

Rửa miếng PC PEGDA/ bằng nước cất 2 lần Ngâm mẫu vào dung dịch BOEđể ăn mòn các hạt trong 5 tiếng Thỉnh thoảng chụp ảnh để quan sát sự thayđổi của bề mặt mẫu và bọp nhẹ vào túi ngâm (không bọp nhẹ vào miếng PC).Rửa mẫu bằng nước cất 2 lần, bảo quản trong hộp nhựa Không cần tránh ánhsáng.

2.2.3 Gắn lipocalin lên IOPC và PCBước 1: APTES bề mặt IOPC

Pha dung dịch phản ứng gồm 180 µL EtOH và 20 µL APTES, lắc nhẹ Ngâmmiếng IOPC đã ăn mòn vào dung dịch trên (ngâm từ 17h chiều hôm trước đến9h sáng hôm sau) Rửa mẫu bằng EtOH.

Bước 2: Gắn kháng thể và kháng nguyên lên IOPC

Chuẩn bị dung dịch mAb: lấy 4 µL mAb gốc thêm vào 2 µL dung dịch EDC 10µg/µL và 4 µL dung dịch NHS 10 µg/µL pha với 30 µL dung dịch MES 0,1M

pH=5.5, ly tâm (800 rpm, 15 phút) Nhỏ dung dịch mAb vào mẫu IOPC, ngâm 4giờ Sau đó rửa IOPC đã ngâm mAb bằng PBS 2 lần.

Chuẩn bị dung dịch LCN 1 antigen 0,03 µg/µL: pha 20 µL LCN gốc với 20 µLdung dịch PBS pH=7 Nhỏ dung dịch LCN vào IOPC để 3 giờ Rửa sạch IOPCđã ngâm LCN bằng PBS 2 lần.

Chuẩn bị dung dịch pAB: lấy 32 µL PBS pH=7 pha trong 4 µL pAB gốc và 4 µLAlexa Fluor 488 donkey anti-rabbit lgG Ngâm mẫu với dung dịch pAB quađêm, rửa sạch mẫu bằng PBS và đem mẫu đi đo huỳnh quang và phản xạ.Làm tương tự với PC.

2.3 Các kết quả chế tạo PC, IOPC và cảm biến lipocalin

2.3.1 Kết quả hiển vi huỳnh quang vật liệu PC và IOPC khi được gắnlipocalin

Khảo sát mẫu IOPC và PC với phần biến tính vật liệu như ở phần thực nghiệmvới nồng độ LCN là 0,03 µg/µL Kết quả ảnh huỳnh quang của vật liệu

Khảo sát huỳnh quang của PC và IOPC khi gắn LCN

Kết quả đo huỳnh quang vật liệu PC và IOPC được gắn LCNẢnh chụp huỳnh quang cho thấy PC không bắt được LCN và IOPC bắt tín hiệu rất tốt, cho phát hiện bằng những điểm sáng màu xanh.

2.3.2 Kết quả đo phản xạ vật liệu PC và IOPC được gắn lipocalin

Khảo sát 2 mẫu IOPC và 1 mẫu PC với phần biến tính vật liệu như ở phần thựcnghiệm với nồng độ LCN là 0,03 µg/µL Kết quả đo phản xạ được

Khảo sát tính phản xạ của PC và IOPC

IOPC mẫu 1’ với bước sóng cực đại khoảng 575 nm, mẫu 2’ bước sóng cực đaikhoảng 520 nm như vậy hợp với kết quả phản xạ của vật liệu khi chiếu bằng đènflash của điện thoại Với bước sóng nằm trong khoảng 520-575 nm tương ứng vớiánh sáng nhìn thấy màu lục, điều này toàn tương ứng với màu phản xạ và huỳnhquang đã đo của vật liệu IOPC Đỉnh của của đồ thị phản xạ khá nhọn cho thấycấu trúc vật liệu chặt chẽ gữa các liên kết cacbon C=C, O-O và N-H giữa vật liệu

và protein được gắn lên Tuy nhiên, cùng là một vật liệu nhưng mẫu 1’ dịchchuyển về bước sóng dài và mẫu 2’ lại dịch chuyển về bước sóng thấp Sự khácnhau này có thể được giải thích bởi vùng mờ của 2 mẫu IOPC, mẫu 1’ có vùngmờ to rõ và kín hết toàn bộ vật liệu, còn mẫu 2’ lại có vùng mờ kém chỉ nằm ởviền.

Đối với mẫu PC sự phản xạ kém rất nhiều so với IOPC do không thể liên kết vớicác protein (mAb, LCN và pAb) Đỉnh phản xạ có bước sóng cực đại khoảng 425nm, điều này khác so với lý thuyết là PC phải có bước sóng nằm trong khoảng650-700 nm Vậy cho thấy ở đây vật liệu PC có cấu trúc không tốt giữa các liênkết giữa các hạt SiO và PEGDA Nguyên nhân có thể do phần PEGDA bao phủ2

rất kín và nhiều quanh các hạt hạt SiO hoặc lượng hạt SiO ít không tạo được2 2

vật liệu có tính chất như mong muốn.

Hình 2.1 Kết quả đo phản xạ vật liệu PC và IOPC được gắn LCN