đánh giá khả năng phòng trừ sinh học nhện đỏ hai đốm tetranychus urticae của một số chủng vi khuẩn thực vật tiềm năng

393.6 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật.. 413.6.1 Kết quả thử nghiệm khả năng diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- ∞0∞ -

PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC

NHỆN ĐỎ HAI ĐỐM (Tetranychus urticae) CỦA

MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, THỰC VẬT TIỀM NĂNG

Chuyên ngành: Nông nghiệp - Môi trường Mã số chuyên ngành

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- ∞0∞ -

PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC

NHỆN ĐỎ HAI ĐỐM (Tetranychus urticae) CỦA

MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, THỰC VẬT TIỀM NĂNG

Chuyên ngành: Nông nghiệp - Môi trường Mã số chuyên ngành

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài thực tập tôt nghiệp ở phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh 1 tại trường Đại học Mở TP.HCM cơ sở 3 Bình Dương đã để lại cho em rất nhiều bài học quý báu, kinh nghiệm bổ ích và cả những kỉ niệm đáng quý

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình đã luôn ở phía sau ủng hộ, động viên và yêu thương em để em có thêm động lực đối mặt với những khó khăn

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Văn Minh đã luôn sẵn

sàng giúp đỡ em, đưa ra những lời khuyên hữu ích để em có thể hoàn thành đề tài một cách tốt nhất Không chỉ vậy, thầy cô đã luôn tạo cho em cơ hội tốt để có thể học hỏi, mở mang kiến thức và giúp em có thêm những kinh nghiệm đáng quý cho cuộc sống sau này

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Trường Đại học Mở TP.HCM đã hết lòng giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu làm tiền đề cho em thực hiện đề tài thành công

Ngoài ra, em xin cảm ơn anh Nguyễn Thương Toàn, anh Trần Kiến Đức, bạn Nguyễn Thị Lan Phương cùng tập thể các bạn sinh viên thực hiện đề tài thực

tập tốt nghiệp, các bạn sinh viên học việc ở phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh đã hết lòng động viên, giúp đỡ em những lúc khó khăn để em có thể hoàn thành đề tài một cách tốt nhất

Cuối cùng, em xin gửi đến gia đình, tập thể quý thầy cô, cán bộ công nhân viên trường Đại học Mở TP.HCM, các anh chị, bạn bè lời chúc sức khỏe, may mắn và thành công

Bình Dương, Tháng 07, năm 2020 Phạm Thị Phương Thảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

Tổng quan về nhện đỏ (Tetranychus urticae) 4

1.1.1.1.1 Giới thiệu 4

1.1.2 Phân loại 4

1.1.3 Đặc điểm của Tetranychus urticae 5

Tình hình gây hại 7

1.2.1.2.1 Trên thế giới 7

1.2.2 Ở Việt Nam 7

GIỚI THIỆU VỀ Bacillus 8

1.3.1.3.1 Giới thiệu về chi Bacillus 8

1.3.2 Vai trò của Bacillus trong phòng trừ sinh học 9

GIỚI THIỆU VỀ Pseudomonas 10

1.4.1.4.1 Giới thiệu về chi Pseudomonas 10

1.4.2 Vai trò của Pseudomonas trong phòng trừ sinh học 10

GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOẠI THỰC VẬT 11

1.5.1.5.1 Thì là 11

1.5.2 Ngải cứu 12

1.5.3 Neem 12

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

2.2 Vật liệu 15

2.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 15

2.3.1 Thiết bị 15

2.3.2 Dụng cụ 15

2.4 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm 16

2.5 Phương pháp nghiên cứu chính 16

2.7Thu nhận mẫu và nhân nuôi quần thể Tetranychus urticae 18

2.8 Sàng lọc các chủng vi khuẩn, dịch chiết thực vật có tiềm năng diệt Tetranychus urticae 18

2.8.1 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật 18

2.10 Công thức tính hiệu lực tiêu diệt nhện qua các thí nghiệm 25

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 26

3.1 KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ NHÂN NUÔI MẪU QUẦN THỂ NHỆN ĐỎ 27

3.2 KẾT QUẢ HOẠT HÓA CÁC CHỦNG VI KHUẨN 28

3.2.1 Quan sát đại thể 28

3.2.2 Kết quả quan sát vi thể 29

3.3.3 Kết quả thử nghiệm Catalase 31

3.4 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật 333.4.1 Thử nghiệm ảnh hưởng của dịch chiết ngải cứu đến khả năng tiêu diệt nhện đỏ 35

3.5 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch lên men một số chủng vi khuẩn tiềm năng 36

3.5.1 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của hai chủng vi khuẩn tiềm năng nhất 39

3.6 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật 41

3.6.1 Kết quả thử nghiệm khả năng diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật 44

3.7 Kết quả thử nghiệm khả năng diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật kết hợp vi khuẩn lên men 46

3.7.1 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật và 2 chủng vi khuẩn lên men tiềm năng nhất 49

3.8 Kết quả đánh giá hiệu quả tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật, vi khuẩn trên cây đậu ở quy mô nhà lưới 50

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 KẾT LUẬN 54

4.2 KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Tài liệu tiếng việt 55

Tài liệu tiếng anh 55

PHỤ LỤC 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Đặc điểm quan sát đại thể vi khuẩn 28Bảng 3.2 Đặc điểm vi thể vi khuẩn 30Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm catalase 31Bảng 3.4 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật 33

Bảng 3.5 : Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của dịch chiết ngải cứu đến khả năng tiêu diệt nhện đỏ 35

Bảng 3.6 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt của nhện đỏ của dịch lên men một số chủng vi khuẩn tiềm năng nồng độ 106 36

Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt của nhện đỏ của dịch lên men một số chủng vi khuẩn tiềm năng nồng độ 2.106 37

Bảng 3.8 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt của nhện đỏ của dịch lên men một số chủng vi khuẩn tiềm năng nồng độ 3.106 38

Bảng 3 9 Kết quả tác động dịch lên men của chủng vi khuẩn BT1 đến khả năng tiêu diệt nhện đỏ 39

Bảng 3.10 Hiệu lực tiêu diệt nhện của dịch lên men chủng vi khuẩn PH3 40Bảng 3.11 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật nồng độ 3% 41

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật nồng độ 6% 42

Bảng 3.13 Kết quả thử nghiệm khả năng diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật nồng độ 12% 43

Bảng 3.14 Kết quả tác động của chủng vi khuẩn BT1 được lên men trong dịch chiết thực vật đến khả năng diệt nhện đỏ 44

Bảng 3.15 Kết quả tác động của chủng vi khuẩn PH3 được lên men trong dịch chiết thực vật đến khả năng diệt nhện đỏ 45

Bảng 3.16 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật kết hợp vi khuẩn lên men nồng độ 3% 46

Bảng 3.17 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực

vật kết hợp vi khuẩn lên men nồng độ 6% 47

Bảng 3.18 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật kết hợp vi khuẩn lên men nồng độ 12% 48

Bảng 3.19 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởngcủa dịch chiết thực vật kết hợp chủng vi khuẩn BT1 đến khả năng tiêu diệt nhện đỏ 49

Bảng 3.20 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởngcủa dịch chiết thực vật kết hợp chủng vi khuẩn PH3 đến khả năng tiêu diệt nhện đỏ 49

Bảng 3.21 Kết quả đánh giá hiệu quả tiêu diệt nhện đỏ trên cây đậu ở quy mô nhà lưới 52

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Các giai đoạn phát triển của nhện (Koppert Biological Systems) 5

Hình 3.1 Hình ảnh quan sát nhện đỏ 27

Hình 3.2 Kết quả quan sát đại thể của một số chủng vi khuẩn 29

Hình 3.3 Kết quả quan sát vi thể của một số chủng vi khuẩn 30

Hình 3.4 Quan sát trạng thái trước và sau khi chết của Tetranychus urticae 35 Hình 3.5 Hình ảnh nhện đỏ được thả trên lá đậu trước khi được phun dịch vi khuẩn thử nghiệm……… 43

Hình 3.6 Hình ảnh nhện đỏ được thả trên lá đậu sau khi được phun dịch vi khuẩn TD13 thử nghiệm… ……… 43

Hình 3.7 Hình ảnh quan sát nghiệm thức đối chứng (ĐC)……… ….58

Hình 3.8 Kết quả quan sát cây đậu sau 4 ngày của nghiệm thức (TV) 59

Hình 3.9 Kết quả quan sát cây đậu sau 4 ngày của nghiệm thức LM (vi khuẩn PH3)……… 59

Hình 3.9 Kết quả quan sát cây đậu sau 4 ngày của nghiệm thức VK(vi khuẩn BT1)……… …60

Hình 3.10 Kết quả quan sát cây đậu sau 4 ngày nghiệm thức (TV+VK) của chủng vi khuẩn PH3 52

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm qua, sản xuất nông nghiệp nước ta gặp một trở ngại mới đó là sự gây hại của nhóm nhện hại cây trồng ngày một gia tăng Có rất nhiều loại cây trồng bị nhện gây hại đáng kể như bông, chè, cam, quýt, bưởi, nhãn, vải, đậu đỗ, cà chua, khoai tây, cây hoa (thược dược, hoa hồng, ), nhiều loại cây làm thuốc, cây cảnh, … Chúng dùng kìm chích vào mô cây và hút dịch cây làm cho cây còi cọc, làm chết điểm sinh trưởng, rụng lá, hoa và quả Ngoài tác hại trực tiếp, một số loại nhện hại còn truyền các bệnh virus nguy hiểm cho cây Theo thống kê tại một số nước, thiệt hại đối với cây táo có thể lên đến 50 – 60%, lê 90%, dâu tây 40 – 70% Chỉ tính riêng các nước trồng sắn tại Châu Phi hàng năm thiệt hại ước tính là 1,8 tỷ đô la Chúng là một trong các nguyên nhân làm trầm trọng thêm nạn đói tại lục địa này (Nguyễn Văn Đĩnh, 2000)

Nhện đỏ Tetranychus urticae (T urticae) là một trong những loài nhện phổ

biến nhất, phân bố trên toàn thế giới và phạm vi ký chủ rộng Chúng được coi là loài gây hại cho nhiều loại cây trồng và là loài nhện được nghiên cứu nhiều nhất với tỷ lệ kháng thuốc trừ sâu cao đã được báo cáo về loài này bởi nhiều tácgiả (GBIF Secretariat, 2017) Sự kiểm soát nhện đỏ chủ yếu vẫn dựa trên việc sử dụng thuốc trừ sâu do hiệu quả tác động mạnh và nhanh chóng Tuy nhiên, do vòng đời ngắn, đặc điểm sinh sản vô tính và phong phú, chúng có thể phát triển khả năng kháng thuốc trừ sâu rất nhanh chóng Ngoài ra, việc sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp có tác động có hại đến môi trường, sự an toàn của con người và các sinh vật không phải mục tiêu như thiên địch, ong mật và động vật hoang dã Do đó, cần phải phát triển các sản phẩm tự nhiên không độc hại và có tiềm năng thay thế thuốc trừ sâu tổng hợp để kiểm soát loại sâu bệnh này (Akyazı và cs., 2015)

Để quản lý sâu bệnh hiệu quả mà không gây hại môi trường, hiện nay có nhiều

nghiên cứu sử dụng thực vật như Neem (Azadirachta indica), có khả năng chống lại hơn 400 loài côn trùng gây hại (Schmutterer, 1995) Ngoài ra, ngải cứu (Artemisia

vulgris ), thì là (Anethum graveolens) chiết xuất từ những loài thực vật này có thể

tạo thành thuốc trừ sâu sinh học để kiểm soát nhện đỏ

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 2

Bên cạnh việc sử dụng thực vật, vi khuẩn Bacillus cũng được nhiều tác giả

nghiên cứu về khả năng phòng trừ sinh học côn trùng gây hại trong nông nghiệp

như Cavados và cs (2001) đã phân lập thành công 18 chủng Bacillus thuringiensis và 1 chủng Bacillus sphaericus từ một ấu trùng thuộc chi Simulium sp Các mầm

bệnh gây chết côn trùng có lịch sử nghiên cứu lâu dài trong kiểm soát sinh học: đặc

biệt là vi khuẩn, chủ yếu là các chủng Bacillus thuringiensis, nấm entomopathogen như Beauveria bassiana và Metarhiziu (Lacey và Kaya, 2007)

Theo nghiên cứu của Vodovar và cs (2006) nếu áp dụng các chủng

Pseudomonas, sự bám dính có thể làm tăng sự xâm nhập của protease, chitinase,

lipase và hydrolase qua lớp biểu bì và cơ thể của nhện đỏ làm cho chúng không thể sống được

Từ những lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá khả năng

phòng trừ sinh học nhện đỏ hai đốm (Tetranychus urticae) của một số chủng vi

khuẩn, thực vật tiềm năng” nhằm sàng lọc một số chủng vi khuẩn, thực vật có

tiềm năng trong phòng trừ nhện đỏ Từ đó tìm ra phương pháp kiểm soát nhện đỏ một cách an toàn, tạo tiềm năng cho sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nhện đỏ trên cây trồng, nhằm hướng đến một nền nông nghiệp hữu cơ an toàn và là tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn sau này

Nội dung nghiên cứu:

1 Thu nhận mẫu và nhân nuôi quần thể Tetranychus urticae

2 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật (hạt neem, thì là, ngải cứu)

3 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch lên men một số chủng vi khuẩn tiềm năng

4 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật

5 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ sự kết hợp 2 và 3

6 Tiếp tục đánh giá khả năng tiêu tiêu diệt nhện đỏ từ kết quả của 2,3,4 và 5 ở quy mô nhà lưới.

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 3

PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 4

Tổng quan về nhện đỏ (Tetranychus urticae)

1.1.1 Giới thiệu

Tetranychus urticae (Koch, 1836) thuộc họ Tetranychidae là một trong những

loài gây hại phổ biến nhất trên thế giới, gây hại trên 150 cây ký chủ có giá trị kinh tế và hơn 300 loài thực vật trong nhà kính (Zhan, 2003) như cà chua, dưa chuột, ớt và hoa như hoa cúc, hoa lan, nó cũng là một loài phổ biến trên dâu tây Ở một số vùng, đây là một vấn đề đối với các loại cây ăn quả được trồng trên đồng ruộng như táo, lê và trên cây nho Các loại cây trồng quan trọng khác bị nhiễm bệnh bao gồm bông, đậu nành và các loại cây họ đậu khác Loài ve này cũng có thể sống trên nhiều vật chủ không trồng trọt, có thể cung cấp nguồn lây nhiễm (Bolland và cs., 1998)

Cơ chế gây bệnh: do cơ thể nhện hại rất nhỏ, thường không nhìn thấy bằng mắt thường và vết gây hại của chúng rất li ti nên thời kỳ gây hại ban đầu không thể

phát hiện được (Nguyễn Văn Đĩnh, 2000) T urticae, giống như các loài nhện khác,

với phần miệng xâm nhập vào tế bào thực vật, thường là ở mặt dưới của lá, chúng ăn lục lạp và phá hủy lá Mỗi phút 18 - 22 tế bào có thể bị phá hủy theo cách này Các triệu chứng có thể nhìn thấy đầu tiên là các đốm nhỏ màu trắng, chủ yếu xung quanh gân giữa và các tĩnh mạch lớn hơn Khi các đốm này hợp nhất, các khoảng trống sẽ tạo cho các lá một màu trắng hoặc trong suốt Với sự phá hoại càng lớn, thiệt hại sẽ bao gồm cả nhu mô cũng như mô lá và cả lá có thể bị phá hủy hoàn toàn Chức năng của khí khổng bị ảnh hưởng và hạn chế sự thoát hơi nước Lá sẽ chuyển sang màu vàng, héo và cuối cùng bị rụng Thường thì toàn bộ tán lá của cây bị tấn công có màu vàng hoặc nâu Mất bề mặt hoạt động quang hợp cùng với giảm thoát hơi nước dẫn đến giảm năng suất, và cây có thể bị còi cọc hoặc trong trường hợp nghiêm trọng bị chết

1.1.2 Phân loại

Dựa vào khóa phân loại của CABI (2019), phân loại khoa học của

Tetranychus urticae như sau:

Tetranychus urticae là một phần của một nhóm các loài rất giống nhau trong

chi Tetranychus Bao gồm khoảng 60 loài, mỗi loài được mô tả từ các vật chủ khác nhau hoặc từ các nơi khác nhau trên thế giới, trong đó nổi tiếng nhất là Tetranychus

telarius L., Tetranychus bimaculatus và Tetranychus altheae von

1.1.3 Đặc điểm của Tetranychus urticae

Cơ thể của nhện được tách thành hai phần riêng biệt: (1) gnathosoma và (2) idiosoma Các gnathosoma chỉ bao gồm các miệng Idiosoma là phần còn lại của cơ thể và tương đương với đầu, ngực và bụng Sau khi nở ra từ trứng, giai đoạn chưa trưởng thành đầu tiên (ấu trùng) có ba đôi chân Các giai đoạn sau và con trưởng thành có bốn cặp chân (Fasulo và cs., 2000)

Hình 1.0.1: Các giai đoạn phát triển của nhện (Koppert Biological

Vòng đời: trứng được gắn vào màng lụa mịn và nở trong khoảng ba ngày Vòng đời bao gồm trứng, ấu trùng, hai giai đoạn ấu trùng (protonymousph và deutonymousph) và con trưởng thành Khoảng thời gian từ trứng đến trưởng thành

1 Trứng 2 Ấu trùng 3 Ấu trùng Protonymph 3 Ấu trùng Deutonymph 5 Nhện trưởng thành ♂♀

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 6 thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào nhiệt độ Sự phát triển của nhện rất nhanh, đặc biệt là ở nhiệt độ cao Ở nhiệt độ 30 - 32°C, là nhiệt độ tối ưu để phát triển, giai đoạn trứng kéo dài 3 - 5 ngày, giai đoạn ấu trùng / ấu trùng 4 - 5 ngày và với thời gian tiền rụng trứng là 1 - 2 ngày, tổng thời gian sống chu kỳ chỉ mất 8 - 12 ngày Mỗi con cái có thể đẻ trung bình 90 - 110 quả trứng trong vòng đời khoảng 30 ngày, do đó số lượng ve có thể tăng rất nhanh trong mùa hè Cơ thể nhện có hình bầu dục, dài khoảng 0,5 mm và có thể có màu nâu hoặc đỏ cam, cũng có màu xanh lục, vàng lục hoặc màu gần như trong suốt là phổ biến nhất Con cái có chiều dài khoảng 0,4 mm với cơ thể hình elip mang 12 cặp vây lưng Con cái đan xen có màu từ cam đến đỏ cam Các điểm trên cơ thể (điểm chấm đen) thường được nhìn thấy do cơ thể nhện trong suốt Vì các đốm là sự tích tụ của chất thải cơ thể, ve mới lột xác có thể thiếu các đốm Con đực có hình elip với đầu đuôi thon và nhỏ hơn con cái Nhện hai đốm thích thời tiết khô, nóng của mùa hè và tháng mùa thu, nhưng có thể xảy ra bất cứ lúc nào trong năm Con cái đan xen ngủ đông trong rác trên mặt đất hoặc dưới vỏ cây hoặc cây bụi (Fasulo và cs., 2000)

Hình 1.2. Hình ảnh quan sát nhện đỏ (Auger P và cs 2013)

A, B, C, D, E, F: Hình ảnh quan sát nhện cái; G, H, I, J, K, L, M, N: Hình ảnh quan sát nhện cái với sự thiếu hụt thức ăn; O, P: Hình ảnh quan sát nhện đực; Q, R: Hình ảnh quan

sát trứng của nhện

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 7

Tình hình gây hại 1.2.

1.2.1 Trên thế giới

Tetranychus urticae được mô tả ban đầu ở châu Âu Nó được coi là một loài

vùng ôn đới, nhưng cũng được tìm thấy ở các khu vực cận nhiệt đới Nó được tìm thấy trên khắp Hoa Kỳ trong các nhà kính nơi nó sống sót qua mùa đông vượt quá giới hạn tự nhiên của nó (Tuttle và Baker, 1968) Nó cũng được ghi nhận từ hầu hết các quốc gia ở Châu Âu, Châu Á, Châu Phi, Châu Úc, Thái Bình Dương và các đảo Caribbean, Bắc, Trung và Nam Mỹ (CABI, 2019)

Thống kê thiệt hại do loại sâu bệnh này gây ra trong các loại cây trồng như đậu, cam quýt, bông, bơ, táo, lê, mận và nhiều loại cây trồng làm vườn và cây cảnh khác ước tính khoảng 4.500 USD mỗi ha Chi phí này tương ứng với 30% tổng chi phí thuốc trừ sâu trong cây trồng hoa trang trí Vì thế một khoản chi gần 62% giá trị

thị trường toàn cầu cho kiểm soát T urticae dựa trên dữ liệu của năm 2008 (Van

Leeuwen và cs., 2015) Phương pháp để kiểm soát dịch hại này là thuốc trừ sâu hóa học Tuy nhiên, loài nhện này được biết là tạo ra tính kháng với các hóa chất trong

một khoảng thời gian ngắn (Landeros và cs, 2010) Ngoài ra, khi T urticae tiếp xúc

với nồng độ thuốc trừ sâu dưới mức, loài ve này có khả năng tăng tốc độ sinh sản, do đó quần thể của nó tăng lên trong thời gian rất ngắn (Hoy, 2016) Hơn nữa, nhiều thành phần hoạt chất trong các công thức thuốc trừ sâu không tương thích với các

động vật ăn thịt tự nhiên của T urticae Do đó, khi thuốc hóa học được phun lên

cây trồng, chúng ảnh hưởng đến quần thể động vật ăn thịt dẫn đến có thể góp phần làm tăng các loài ve thực vật (Kumral và cs., 2010)

1.2.2 Ở Việt Nam

Nhện đỏ gây hại cục bộ một số diện tích chè, tỷ lệ hại trung bình 3 - 5 %, nơi cao 10 - 20 % số lá, diện tích nhiễm nhẹ 3,5 ha Đối với cam chanh tỷ lệ hại trung bình 2 - 5 %, nơi cao 8 - 10 % số lá, quả Diện tích nhiễm 21,5 ha ( Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Tuyên Quang, 2019)

Theo chi cục bảo vệ thực vật TP Hồ Chí Minh nhện đỏ gây hại trên nhiều loài cây khác nhau, chúng hại nặng trên cây ớt, dưa, bầu bí, đậu đỗ, Nhện trưởng thành và nhện non chích hút lá tạo ra những đốm lá trắng vàng có thể nhận ra ở mặt

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 8 trên của lá Khi hại nặng chúng có thể làm lá héo rụng Cho đến nay, đã có một số công trình nghiên cứu về nhện đỏ hai chấm hại trên một số loại cây trồng như trên bông

Theo Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Quảng Ngãi, nhện đỏ và bệnh chổi rồng là 2 đối tượng gây hại chính làm ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây sắn tại địa phương này Theo kết quả điều tra, diện tích cây sắn nhiễm nhện đỏ biến động từ 320 - 740 ha, gây hại ở hầu hết các huyện trong tỉnh Hàng năm nhện đỏ thường phát sinh gây hại từ cuối tháng 2, mật độ gia tăng và tỷ lệ gây hại đến tháng 6 - 7 đến tháng 8 trở đi đến cuối vụ do ảnh hưởng của mưa giông, nhện đỏ giảm khả năng gây hại

GIỚI THIỆU VỀ Bacillus

1.3.1 Giới thiệu về chi Bacillus

Theo khóa phân loại của Cohn và cs., 1872 Bacillus được phân loại như sau:

Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus

Chi Bacillus được đặt tên vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg, để mô tả vi khuẩn hình que (trực khuẩn) Bacillus sau đó đã được sửa đổi bởi

Ferdinand Cohn để mô tả thêm về chúng đó là vi khuẩn hình thành nội bào tử,

Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, chúng có khả năng yếm khí trong

trường hợp không có oxy Các loài Bacillus thử nghiệm dương tính với enzyme

catalase Giống như các chi khác liên quan đến lịch sử vi trùng học ban đầu như

Pseudomonas và Vibrio, Bacillus có 266 loài có mặt khắp nơi

Bacillus có thể tự chuyển thành trạng thái nội bào tử hình bầu dục và giữ ở

trạng thái nội bào tử trong nhiều năm Nhiều loài Bacillus có thể sản xuất một lượng

lớn enzyme được sử dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau, ví dụ như sản xuất alpha amylase được sử dụng trong thủy phân tinh bột và protease subilisin

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 9

được sử dụng trong chất tẩy rửa Một số loài Bacillus có thể tổng hợp và tiết ra

lipopeptide, đặc biệt là các chất hoạt động bề mặt và mycosubtilin (GBIF, 2019)

Các loài Bacillus có mặt khắp nơi trong tự nhiên, ví dụ như trong đất Chúng

có thể sống trong môi trường khắc nghiệt như pH cao, nhiệt độ cao và nồng độ

muối cao B thuringiensis có thể tạo ra một loại độc tố có thể tiêu diệt côn trùng và

do đó đã được sử dụng làm thuốc trừ sâu Trong quá trình sinh bào tử , nhiều chủng

B thuringiensis tạo ra protein tinh thể, được gọi là endotoxin , có tác dụng diệt côn

trùng (Slonczewski và cs., 2011)

1.3.2 Vai trò của Bacillus trong phòng trừ sinh học

Một trong những chiến lược được nghiên cứu nhiều nhất trong những năm gần

đây là sử dụng vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng Trong số đó, một số loài Bacillus

cho kết quả kiểm soát quần thể một số loài sâu hại nông nghiệp thuộc nhóm lepidoptera, diptera, bọ cánh cứng (Cavados và cs., 2001; Cory và Franklin, 2012; Trevisori và cs., 2014)

Các nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng các loài Bacillus, như là một thay

thế cho việc giảm quần thể nhện, cho thấy kết quả khác nhau

Theo Larrea và cs (2015) trong 15 chủng Bacillus spp tiến hành thí nghiệm, có các chủng PSL 104, 113 và 114 và Bacillus thuringiensis có thể gây phá vỡ lớp biểu bì bên ngoài của nhện và làm giảm số lượng con cái của Tetranychus urticae

59,4% và làm giảm sự nở trứng là 63,3%, do đó chứng minh tính hiệu quả của vi khuẩn này như là một chất kiểm soát sinh học đối với các loài gây hại

Mặt khác, Chapman và cs (1991) đã quan sát thấy rằng các chế phẩm bột từ

Bacillus thuringiensis gây ra tỷ lệ tử vong thấp ở con cái của T urticae nhưng lại có

hiệu quả đối với trứng của T urticae, bột từ Bacillus thuringiensis làm giảm tỷ lệ

nở trứng 97,2% sau 24h thử nghiệm

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 10

GIỚI THIỆU VỀ Pseudomonas

1.4.1 Giới thiệu về chi Pseudomonas

Theo phân loại ITIS, 2012 Pseudomonas được phân loại như sau:

Pseudomonas là một vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Pseudomonadaceae và

chứa 191 loài được mô tả Tế bào của chúng hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử, chúng hô hấp hiếu khí, Catalase dương tính, Oxidase dương tính Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là 30 - 370C Tuy nhiên một số chủng Pseudomonas lại có thể sống tốt ở 40oC

Pseudomonas có thể được nuôi trong môi trường đơn giản và ở pH trung tính Một

vài chủng có thể tạo huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 254 nm

1.4.2 Vai trò của Pseudomonas trong phòng trừ sinh học

Các loài Pseudomonas fluorescens cũng đã được nghiên cứu cho thấy có hiệu quả trong việc kiểm soát sinh học T urticae Aksoy và cs (2008) chỉ ra rằng

Pseudomonas putida, phân lập từ đất trồng cà chua ở Thổ Nhĩ Kỳ, đã cho thấy tỷ lệ

tử vong cao đối với nhện hai đốm Hơn nữa, P fluorescens sản xuất chitinase vi

khuẩn có hiệu quả trong việc kiểm soát các con ve bằng cách thủy phân exoskeleton chitinous của chúng (Roobakkumar và cs., 2011)

Theo Ksoy và cs (2008) nghiên cứu Pseudomonas putida như là một tác nhân kiểm soát sinh học của T urticae Các vi khuẩn được nhân phân lập từ đất ở

Carsamba, Thổ Nhĩ Kỳ Thí nghiệm đã cho thấy giảm đáng kể tổng số trứng và nở trứng đối với nhện hai đốm, so với các điều kiện bình thường Phun vi khuẩn đạt hiệu quả hơn so với việc nhúng – phun (100%) Các kết quả nghiên cứu này đã chỉ

ra rằng P putida có hiệu quả mạnh mẽ trong việc gây tử vong đối với T urticae

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 11

Theo Babu và cs (2010) Pseudomona fluorescens có khả năng gây chết nhện 100%

bằng phương pháp phun trực tiếp sau 24h

GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOẠI THỰC VẬT 1.5.

Thì là (Anethum graveolens) là một loại thảo dược hàng năm trong họ cần tây

Apiaceae Đây là loài duy nhất trong chi Anethum Thì là được trồng rộng rãi ở Âu

Á, lá và hạt của nó được sử dụng như một loại thảo mộc hoặc gia vị cho hương vị thực phẩm

Vai trò của thì là trong phòng trừ bệnh hại: cây thì là (Anethum graveolens)

thu hút những con ruồi và ong bắp cày, (những loài côn trùng có lợi) sử dụng tán lá của nó làm thức ăn Thì là cũng giúp đẩy lùi rệp và nhện Nếu rắc lá thì là vào cây bí có thể xua đuổi bọ xít (Grainge, 1988) Nghiên cứu của Salman và cs (1836) cho thấy rằng dịch chiết từ cây thì là có khả năng diệt nhệt 100% đối với nhện đỏ trưởng thành sau 6 ngày và 91% đối với trứng của nhện đỏ

Loài: Artemisia Vulgaris

Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) là cây thân thảo, sống lâu năm, lá mọc so le,

chẻ lông chim, phiến men theo cuống đến tận gốc, dính vào thân như có bẹ, mặt trên màu lục sậm, mặt dưới phủ đầy lông nhung màu trắng Ngải cứu có nguồn gốc ôn đới ở châu Âu, châu Á, bắc Phi, Alaska và bắc Mỹ, trong đó một số vùng coi nó là cỏ dại xâm lấn

Vai trò của thì là trong phòng trừ bệnh hại: các loại tinh dầu thuộc loài

Artemisia có đặc tính diệt côn trùng hoặc chống côn trùng (Kordali và cs., 2006)

Theo nghiên cứu của El-Gepaly và cs (2016) dịch chiết ngải cứu đã gây tỷ lệ chết 61,56% đối với nhện đỏ trưởng thành

Neem là cây thân gỗ, chiều cao có thể lên đến 30 m, tán rộng xoè ra như cây sồi, chu vi tán lá khoảng 2,5 m và có thể vươn xa đến 10 m Bộ rễ của cây rất sâu, phát triển mạnh, rễ cái có thể dài gấp hai lần chiều dài của cây.Vỏ cây có chứa

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 13 khoảng 3,43 % protein; 0,68 % alkaloid; 4,16% chất khoáng và một số axit amin Vỏ cũng chứa nhiều hoạt chất nimbidin, interferon, acid gallic… có tính kháng dịch hại

Vai trò của thì là trong phòng trừ bệnh hại: neem (Azadirachta indica) thuộc họ Meliaceae với những hoạt chất sinh học từ lâu đã thu hút sự quan tâm của nhiều

nước trên thế giới Ngày nay, những sản phẩm của neem được sử dụng rộng rãi trong trồng trọt, bảo quản lương thực, hạt giống sau thu hoạch Hạt neem chứa nhiều hoạt chất bao gồm 40% dầu với azadirachtin là thành phần hoạt chất chính chịu trách nhiệm diệt côn trùng (Isman và cs., 1991).Những hoạt chất này tác động lên hormone của côn trùng mà không ảnh hưởng trực tiếp lên hệ thần kinh, hệ tiêu hóa, cơ quan sinh sản như các loại thuốc hóa học do đó khó phát triển tính kháng thuốc ở thế hệ sau (Dennis,1992)

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 14

PHẦN 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 15

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2020 đến tháng 08/2020 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh 1, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu

Nhện đỏ được thu nhận tại trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh

Các chủng vi khuẩn có khả năng trừ sâu, kháng nấm mạnh được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Mẫu cây ngải cứu (Artemisia vulgris L.) được thu nhận tại Xã Eatoh, Huyện

Krôngnăng, Tỉnh Đăklăk

Mẫu cây thì là (Anethum graveolens) được thu nhận tại Thành phố Thủ Dầu

Một, Tỉnh Bình Dương

Mẫu hạt neem (Azadirachta indica A Juss) được thu nhận tại tỉnh Tây Ninh

2.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị

✔ Tủ cấy vô trùng ✔ Cân kĩ thuật

✔ Bếp điện

✔ Lò vi sóng ✔ Tủ ấm

✔ Nồi hấp ✔ Kính hiển vi ✔ Tủ sấy

✔ Nồi hấp (autoclave)

2.3.2 Dụng cụ

✔ Ống nghiệm ✔ Đĩa petri ✔ Erlen ✔ Ống đong ✔ Bình serum ✔ Đũa thủy tinh ✔ Micropipet

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 16

2.4 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm

- Môi trường: NA, NB

- Thuốc nhuộm: thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet), safranin O, lugol, - Hóa chất: NaCl, cồn 96º, cồn 70º, NaOH 2M, HCl,

2.5 Phương pháp nghiên cứu chính

2.5.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, thí nghiệm được bố trí ở sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ thí nghiệm

Hoạt hóa các chủng vi khuẩn

Nhuộm Gram, quan sát hình thái, thử nghiệm Catalase Nhân nuôi quần thể nhện

đỏ

Thu nhận mẫu nhện đỏ

Thử nghiệm khả năng diệt nhện đỏ của:

chiết thực vật,

Thử nghiệm khả năng diệt nhện đỏ trên cây đậu 2 tuần tuổi

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 17

2.6 Hoạt hóa các chủng vi sinh vật

Sau khi nhận giống vi sinh vật từ phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh Trường Đại học Mở Tp.HCM chúng tôi tiến hành hoạt hóa trên đĩa môi trường NA để kiểm tra hình thái đại thể và nhuộm Gram để kiểm tra hình thái vi thể

Cách tiến hành

Việc nhuộm Gram được thực hiện như sau:

Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô

Phủ hoàn toàn vết bôi với Crystal violet Để yên 1 – 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước

Nhỏ dung dịch Lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước Tẩy cồn 96o từ 15 – 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi với Safranin O và để yên trong 1 phút Rửa với nước

Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X

Đọc kết quả

Tế bào vi khuẩn Gram dương (+) bắt màu tím Tế bào vi khuẩn Gram âm (–) bắt màu hồng

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 18 Cách sắp xếp, hình thái

Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu

2.6.3 Thử nghiệm Catalase

Phương pháp thử nghiệm Catalase Nguyên tắc

Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy nghi chứa chuỗi điện tử có cytochrome

đều có enzym catalase (trừ các Streptococcus spp.) Enzym này là một trong những

enzym có vai trò bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương bởi những dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức theo với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử, tạo H2O2 Catalase sẽ thủy phân hydrogen peroside (H2O2) thành H2O và O2 ngăn chặn sự tích tụ của các phân tử có độc tính cao này trong tế bào (Trần Linh Thước., 2010)

2.7 Thu nhận mẫu và nhân nuôi quần thể Tetranychus urticae

Nhện đỏ được thu nhận tại Trường đại học Mở TP Hồ Chí Minh

Nhện đỏ được nuôi trên cây đậu (Vigna angularis), đặt những tán lá có chứa nhiều T.urticae đã được thu nhận, đặt lên cây đậu ở giai đoạn 3 - 6 lá T urticae sẽ

di chuyển ra cây đậu (Akyazı R.,2015)

2.8 Sàng lọc các chủng vi khuẩn, dịch chiết thực vật có tiềm năng diệt Tetranychus urticae

2.8.1 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật 2.8.1.1 Tách chiết dịch chiết thực vật

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 19 Các loại thực vật được phơi, sấy khô tới khối lượng không đổi

Vật liệu được chiết xuất bằng cách đun sôi cùng với nước cho đến khi thể tích nước giảm còn một phần tư thể tích ban đầu (Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants, Handa ,2008)

Dịch chiết sau đó được lọc được lọc qua giấy lọc Whatman

Dịch chiết sau khi lọc được coi là dung dịch chuẩn (Nồng độ 100%) và được giữ lạnh Dịch chiết sau đó được pha loãng bằng nước cất vô trùng

Cách tiến hành

Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng lá đậu Lá được ngâm trong 3 loại dịch chiết thực vật 20 giây ở các nồng độ (3, 6, 12 %) với thể tích bằng nhau và để khô ở nhiệt độ phòng, đối chứng ngâm trong 20 giây trong nước cất Mỗi nồng độ được thực hiện với 3 lần lặp lại, mỗi lần với 10 con nhện trưởng thành

Các lá đã ngâm dịch chiết được đặt phía trên bông thấm nước trong một đĩa petri Các bông ướt ngăn chặn nhện bò ra ngoài và duy trì độ tươi của lá Những con nhện trưởng thành được thả ra ở trung tâm của mỗi lá Kết quả được kiểm tra sau 6, 24, 48, 72 và 96 giờ bằng cách đếm số lượng con trưởng thành còn sống có mặt trên mỗi lá Biểu hiện của nhện còn sống là lúc dùng cọ nhỏ chạm vào, nhện có cử động hoặc di chuyển (Akyazı và cs, 2015)

Đồng thời, thực hiện phương pháp phun, sau khi nhện đỏ đã được đặt vào lá, dịch chiết thực vật được phun với khoảng cách 25 - 30 cm với một bình phun phun tay có dung tích 5 ml cho đến khi bề mặt lá được làm ướt bằng những giọt rất mịn Đối chứng sẽ được phun bằng nước cất (Aksoy và cs, 2008)

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 loại dịch chiết thực vật (thì là, ngải cứu, neem) được thực hiện với 4 nghiệm thức: ĐC, 3%, 6%, 12% với 3 lần lặp lại

NT1: dịch chiết thực vật được pha loãng ở nồng độ 3% NT2: dịch chiết thực vật được pha loãng ở nồng độ 6% NT3: dịch chiết thực vật được pha loãng ở nồng độ 12% NT - ĐC: nước cất

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 20 Sau khi tiến hành thử nghiệm sàng lọc các loại thực vật có khả năng tiêu diệt nhện đỏ, tiến hành thử nghiệm loại thực vật có khả năng tiêu diệt nhện đỏ tốt nhất ở các nồng độ (0,5 %, 1 %, 2 %)

2.8.2 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch lên men một số chủng vi khuẩn tiềm năng

Chuẩn bị dịch khuẩn: 9 chủng vi khuẩn (TD13, Q16, BT, TS3, KT2, LD5, LS6, PH3, P20) được nuôi lắc riêng trên môi trường NB ở 37oC, 24h Vi khuẩn sau nuôi cấy được pha loãng để có nồng độ 1 x 109 CFU/ml

Dịch thử nghiệm: hút 1 ml của 9 chủng vi khuẩn (1 x 109 CFU/ml) và tiến

CFU/ml Tương tự, tiến hành với liều 2 và 3 ml, để có nồng độ 2 x 106 CFU/ml và 3 x 106 CFU/ml (David Mendoza - Léon, 2018)

Cách tiến hành:

Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng lá đậu Lá được ngâm trong dịch của 9 vi khuẩn 20 giây ở các nồng độ (1 x 106 CFU/ml, 2 x 106 CFU/ml, 3 X

trong 20 giây trong nước cất Mỗi nồng độ được thực hiện với 3 lần lặp lại, mỗi lần với 10 con nhện trưởng thành

Các lá đã ngâm dịch 9 vi khuẩn được đặt phía trên bông thấm nước trong một đĩa petri Các bông ướt ngăn chặn nhện bò ra ngoài và duy trì độ tươi của lá Những con nhện trưởng thành được thả ra ở trung tâm của mỗi lá Kết quả được kiểm tra sau 6, 24, 48, 72 và 96 giờ bằng cách đếm số lượng con trưởng thành còn sống có mặt trên mỗi lá Biểu hiện của nhện còn sống là lúc dùng cọ nhỏ chạm vào, nhện có cử động hoặc di chuyển (Akyazı và cs, 2015)

Đồng thời, thực hiện phương pháp phun, sau khi nhện đỏ đã được đặt vào lá, các chủng vi khuẩn được phun với khoảng cách 25 - 30 cm với một bình phun phun tay có dung tích 5 ml cho đến khi bề mặt lá được làm ướt bằng những giọt rất mịn Đối chứng sẽ được phun bằng nước cất (Aksoy, H M và cs, 2008)

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 21 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 9 chủng vi khuẩn

, 2 x 106, 3 x 106 CFU/ml với 3 lần lặp lại

NT - ĐC: nước cất

Sau khi tiến hành thử nghiệm sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tiêu diệt nhện đỏ, tiến hành thử nghiệm 2 chủng vi khuẩn có khả năng tiêu diệt nhện đỏ tốt nhất ở các nồng độ (5 x 106, 107, 5 x 107, 108 CFU/ml)

2.8.3 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật

⮚ Mẫu thực vật đc tách chiết như phần 2.8.1.1 ⮚ Cách tiến hành:

Nhân giống vi sinh vật: 9 chủng vi khuẩn (TD13, Q16, BT1, TS3, KT2, LD5, LS6, PH3, P20) được nuôi cấy trong hỗn hợp môi trường bao gồm môi trường NB (Hasanain A M., 2017) và hỗn hợp 3 loại dịch chiết thực vật (tỷ lệ môi trường và dịch chiết thực vật là 1:1) Nuôi cấy vi khuẩn ở 37°C trong 48 giờ, sau đó được bảo quản ở 5°C (Schaffner D W và cs, 1986) Mỗi chủng vi khuẩn được nuôi cấy và duy trì riêng trong mỗi hỗn hợp môi trường

Lên men vi sinh vật: 100ml hỗn hợp dịch dịch chiết thực vật được tiệt trùng trong 10 phút ở 121°C và được làm nguội đến 37°C trước khi thêm vi khuẩn Bổ sung (1%) mỗi chủng vi khuẩn vào mỗi môi trường dịch chiết đã được tiệt trùng và nuôi cấy ở 37°C trong vòng 3 ngày, bắt đầu quá trình lên men (Schaffner D W và cs, 1986)

⮚ Phương pháp thử nghiệm:

Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng lá đậu Lá đậu được ngâm trong dịch vi khuẩn đã lên men trong dịch chiết thực vật trong 20 giây ở các nồng độ (3, 6, 12 %) với thể tích bằng nhau và để khô ở nhiệt độ phòng, đối chứng ngâm trong 20 giây trong nước cất Mỗi nồng độ được thực hiện với 3 lần lặp lại, mỗi lần

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 22 với 10 con nhện trưởng thành 9 chủng vi khuẩn được ngâm riêng trong 9 hỗn hợp môi trường

Các lá đã ngâm trong dịch lên men được đặt phía trên bông thấm nước trong một đĩa petri Các bông ướt ngăn chặn nhện bò ra ngoài và duy trì độ tươi của lá Những con nhện trưởng thành được thả ra ở trung tâm của mỗi lá Kết quả được kiểm tra sau 6, 24, 48, 72 và 96 giờ bằng cách đếm số lượng con trưởng thành còn sống có mặt trên mỗi lá Biểu hiện của nhện còn sống là lúc dùng cọ nhỏ chạm vào, nhện có cử động hoặc di chuyển (Akyazı và cs, 2015)

Đồng thời, thực hiện phương pháp phun, sau khi nhện đỏ đã được đặt vào lá, dịch vi khuẩn đã lên men trong dịch chiết thực vật của mỗi chủng vi khuẩn được phun với khoảng cách 25 - 30 cm với một bình phun phun tay có dung tích 5 ml cho đến khi bề mặt lá được làm ướt bằng những giọt rất mịn Đối chứng sẽ được phun bằng nước cất (Aksoy và cs, 2008)

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên: 9 chủng vi khuẩn được thực hiện với mỗi chủng có 4 nghiệm thức: ĐC, 3%, 6%, 12% với 3 lần lặp lại

NT1: dịch vi khuẩn lên men trong dịch chiết thực vật được pha loãng 3% NT2: dịch vi khuẩn lên men trong dịch chiết thực vật được pha loãng 6% NT3: dịch vi khuẩn lên men trong dịch chiết thực vật được pha loãng 12% NT - ĐC: nước cất

Sau khi tiến hành thử nghiệm sàng lọc các chủng vi khuẩn lên men trong dịch chiết thực vật có khả năng tiêu diệt nhện đỏ, tiến hành thử nghiệm chủng vi khuẩn lên men có khả năng tiêu diệt nhện đỏ tốt nhất ở các nồng độ (0,5 %, 1 %, 2 %) cùng với loại thực vật tốt nhất đã được khảo sát ở mục 2.8.1

2.8.4 Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật và vi khuẩn lên men

⮚ Mẫu thực vật đc tách chiết như phần 2.8.1.1 ⮚ Cách tiến hành:

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 23 Nhân giống vi sinh vật: 9 chủng vi khuẩn (TD13, Q16, BT, TS3, KT2, LD5, LS6, PH3, P20) được nuôi cấy trong mỗi môi trường NB (Hasanain, 2017) Nuôi cấy vi khuẩn ở 37°C trong 48 giờ (Schaffner và cs, 1986)

100ml hỗn hợp dịch chiết thực vật được tiệt trùng trong 10 phút ở 121°C và được làm nguội đến 37°C trước khi thêm vi khuẩn (Schaffner và cs., 1986)

Chủng vi khuẩn sau khi nuôi cấy được phối trộn với dịch chiết thực vật theo tỷ lệ 1:1

⮚ Phương pháp thử nghiệm:

Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng lá đậu Lá được ngâm trong dịch vi khuẩn tăng sinh kết hợp với dịch chiết thực vật 20 giây ở các nồng độ (3, 6, 12 %) và để khô ở nhiệt độ phòng, đối chứng ngâm trong 20 giây trong nước cất Mỗi nồng độ được thực hiện với 3 lần lặp lại, mỗi lần với 10 con nhện trưởng thành, 9 chủng vi khuẩn được ngâm riêng trong 9 hỗn hợp môi trường

Các lá đã ngâm trong dịch lên men được đặt phía trên bông thấm nước trong một đĩa petri Các bông ướt ngăn chặn nhện bò ra ngoài và duy trì độ tươi của lá Những con nhện trưởng thành được thả ra ở trung tâm của mỗi lá Kết quả được kiểm tra sau 6, 24, 48, 72 và 96 giờ bằng cách đếm số lượng con trưởng thành còn sống có mặt trên mỗi lá Biểu hiện của nhện còn sống là lúc dùng cọ nhỏ chạm vào, nhện có cử động hoặc di chuyển (Akyazı và cs, 2015)

Đồng thời, thực hiện phương pháp phun, sau khi nhện đỏ đã được đặt vào lá, dịch vi khuẩn tăng sinh kết hợp với dịch chiết thực được phun với khoảng cách 25 - 30 cm với một bình phun phun tay có dung tích 5 ml cho đến khi bề mặt lá được làm ướt bằng những giọt rất mịn Đối chứng sẽ được phun bằng nước cất (Aksoy và cs, 2008)

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 9 chủng vi khuẩn được thực hiện với mỗi chủng có 4 nghiệm thức: ĐC, 3%, 6%, 12% với 3 lần lặp lại NT1: dịch vi khuẩn tăng sinh kết hợp với dịch chiết thực vật, hỗn hợp được pha loãng 3%

NT2: dịch vi khuẩn tăng sinh kết hợp với dịch chiết thực vật, hỗn hợp được pha loãng 6%

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 24 NT3: dịch vi khuẩn tăng sinh kết hợp với dịch chiết thực vật, hỗn hợp được pha loãng 12%

NT - ĐC: nước cất

Sau khi tiến hành thử nghiệm sàng lọc các chủng vi khuẩn tăng sinh kết hợp với dịch chiết thực vật có khả năng diệt nhện đỏ, tiến hành thử nghiệm chủng vi khuẩn tăng sinh có khả năng diệt nhện đỏ tốt nhất ở các nồng độ (0,5 %, 1 %, 2 %) cùng với loại thực vật tốt nhất đã được khảo sát ở mục 2.8.1

2.9 Đánh giá hiệu quả diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật, vi khuẩn trên cây đậu ở quy mô nhà lưới

Dựa vào kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn, thực vật tiềm năng có khả năng diệt nhện đỏ, tiến hành thử nghiệm đánh giả hiệu quả diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn, thực vật tiềm năng ở mô hình nhà lưới

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Mỗi nghiệm thức được tiến hành như sau:

− Nghiệm thức (LM): thử nghiệm với đơn chủng vi khuẩn lên men trong dịch chiết thực vật

hợp với dịch chiết thực vật

Các cây đậu trên 2 tuần tuổi được sử dụng thử nghiệm với kích cỡ thương đồng nhau, không có dấu hiệu bị bệnh Được chuyển vào chậu nhựa chứa đất đã được hấp khử trùng

Mỗi lần lặp lại tiến hành phun 7 ml dịch thử nghiệm

Tiến hành phun dịch thử nghiệm lên cây đậu có chứa nhện với khoảng cách 20 - 30 cm đảm bảo dịch thử nghiệm được phân bố đều khắp thân cây

Tiến hành quan sát và ghi nhận số lượng nhện cây đậu sau 96h

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 25

2.10 Công thức tính hiệu lực tiêu diệt nhện qua các thí nghiệm

Hiệu lực tiêu diệt nhện từ các thí nghiệm vào các ngày được tính theo công thức Abbott (Abbott, 1925):

( C – T )

E (%) = x 100 C

Trong đó:

- E (%): hiệu lực tiêu diệt nhện - C: số nhện sống ở mẫu đối chứng - T: số nhện sống ở mẫu thí nghiệm

Để phân tích mức độ ảnh hưởng của các thí nghiệm, dữ liệu được phân tích phương sai (ANOVA) và đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0.05

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 26

PHẦN 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

So sánh với mô tả của CABI (2019) xác định bước đầu mẫu nhện đỏ thu nhận

là mẫu nhện đỏ hai đốm Tetranychus urticae Sau đó được nhân nuôi trên cây đậu (Vigna angularis) nhằm giữ nguồn nhện đỏ cung cấp cho những thí nghiệm sau này

Bảng 3.1 Đặc điểm quan sát đại thể vi khuẩn

cưa

Trắng ngà

Tâm nhăn, vòng

Trắng trong, tạo sắc tố xanh

môi trường

Nhỏ, lồi

A

B B

A

SVTH: PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 31

3.3.3 Kết quả thử nghiệm Catalase

Sau khi quan sát đặc điểm đại thể, vi thể tiến hành thử nghiệm catalase các chủng vi khuẩn bằng cách dùng que cấy vòng, lấy đầy 1 vòng cấy vi khuẩn hòa vào giọt H2O2 và quan sát Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.4 cho thấy hình ảnh thử nghiệm catalase của 9 chủng vi khuẩn

Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm catalase