tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết vi khuẩn bacillus sp rd26 nội sinh cây diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus

Một số hợp chất được cô lập từ một số loài thuộc chi Bacillus và hoạt tính sinh học của chúng .... Trong những năm gần đây, các hợp chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng nhiều tron

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

NGUYỄN QUỐC KHANG

TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TỪ CAO CHIẾT VI KHUẨN BACILLUS SP RD26

NỘI SINH CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

(PHYLLANTHUS AMARUS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

NGUYỄN QUỐC KHANG

TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TỪ CAO CHIẾT VI KHUẨN BACILLUS SP RD26

NỘI SINH CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian làm khóa luận tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Tp HCM và Phòng Các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học em đã được sự hỗ trợ từ các thầy cô, anh chị, các bạn, các em và cả gia đình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô ThS Dương Nhật Linh và thầy

TS Nguyễn Tấn Phát đã luôn tận tình hướng dẫn, dạy cho em biết tinh thần trách

nhiệm và giải thích cho em những điều em chưa hiểu rõ trong quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin cảm ơn Quý Thầy Cô Trường Đại Học Mở Tp HCM nói chung và Khoa Công nghệ sinh học nói riêng nhiều sức khỏe và luôn đạt được nhiều thành công trong công việc giảng dạy và nghiên cứu

Em cảm ơn chị Trần Thị Á Ni đã chỉ dẫn và giúp đỡ để em có thể hoàn thành

đề tài khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn các bạn khóa 2016, các em khóa 2017 trong Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh đã giúp đỡ, hỗ trợ cùng mình trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba Mẹ đã cho con ăn học nuôi nấng và dạy dỗ con khôn lớn đến bây giờ Cảm ơn cả nhà đã dành cho con tình thương yêu, luôn an ủi, hỏi thăm, động viên con Luôn là niềm động lực to lớn, giúp con vượt qua mọi khó khăn và có được ngày hôm nay

Kính chúc quý Thầy Cô, gia đình, anh chị, các bạn và các em dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống!

Bình Dương, tháng 08 năm 2020

NGUYỄN QUỐC KHANG

1.2 NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC LÝ 16

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 16

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 26

1.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 26

1.4.2 Phương pháp sắc ký cột cổ điển (CC) 27

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC 27

1.5.1 Phương pháp tự sinh đồ 27

1.5.2 Phương pháp pha loãng 28

1.5.3 Phương pháp khuếch tán 28

1.5.4 Các phương pháp thử độc tính tế bào 28

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT 291.6.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 29

1.6.2 Phương pháp phân tích sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) 29

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 31

2.2 VẬT LIỆU 31

2.2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu 31

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 31

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32

2.3.2 Phương pháp nhuộm bào tử 33

2.3.3 Phương pháp phân lập hợp chất 34

2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 35

2.3.5 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 36

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CHẤT TINH 41

3.1.1 Phương pháp lên men thu nhận sinh khối 41

3.1.2 Phương pháp thu cao chiết methanol 43

3.1.3 Điều chế các phân đoạn từ cao methanol 45

3.2 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN MRSA CỦA CAO TỔNG VÀ CAO PHÂN ĐOẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐĨA GIẤY 50

3.2.1 Khảo sát khả năng kháng MRSA của cao tổng 50

3.2.2 Khảo sát khả năng kháng MRSA của các cao phân đoạn 51

3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT 52

3.3.1 Xác định cấu trúc hợp chất BR04 52

3.3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất BR04 54

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62

4.1 KẾT LUẬN 63

4.2 ĐỀ NGHỊ 65

PHỤ LỤC 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

Tài liệu tiếng Việt 73

Tài liệu tiếng Anh 73

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32

Sơ đồ 3.1 Quy trình lên men thu nhận sinh khối 42

Sơ đồ 3.2 Quy trình phá vỡ màng tế bào bằng tán siêu âm đầu dò 43

Sơ đồ 3.3 Quy trình điều chế các phân đoạn từ cao BRM 45

Sơ đồ 3.4 Quy trình phân lập hợp chất từ phân đoạn BRM4 49

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số hợp chất được cô lập từ một số loài thuộc chi Bacillus và hoạt tính

sinh học của chúng 17

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát cao BRM4 46

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát cao BRM41 47

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát cao BRM413 48

Bảng 3.4 Kết quả thử khả năng kháng MRSA của các cao phân đoạn 51

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ 1H (500 Hz) và 13C (125 Hz) của BR04 và chất Uracil đo trong DMSO-d6 53

Bảng 3.6 Kết quả MIC của hợp chất BR04 56

Bảng 3.7 Tỷ lệ (%) bắt gốc tự do DPPH ở các nồng độ khảo sát của chất BR04 58

Bảng 3.8 Kết quả ức chế dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hợp chất BR04 tại 48 giờ 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus 14

Hình 3.1 Hỗn dịch trước và sau ly tâm 44

Hình 3.2 Hình dạng vi thể của vi khuẩn Bacillus sp RD26 trước và sau khi siêu âm quan sát dưới vật kính dầu X100 44

Hình 3.3 Sắc ký lớp mỏng cao BRM 46

Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng phân đoạn BRM41 47

Hình 3.5 Sắc ký lớp mỏng hợp chất BR04 hệ dung môi giải ly 10C:1M 48

Hình 3.6 Kết quả cao chiết kháng vi khuẩn MRSA 50

Hình 3.7 Kết quả vòng kháng cao phân đoạn 90:10 và phân đoạn 80:20 51

Hình 3.8 Kết quả vòng kháng cao phân đoạn 70:30 và phân đoạn 60:40 51

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) của BR04 66

Phụ lục 2 Phổ 1H-NMR giãn rộng (DMSO, 500 MHz) của BR04 67

Phụ lục 3 Phổ 1H-NMR giãn rộng (DMSO, 500 MHz) của BR04 68

Phụ lục 4 Phổ 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) của BR04 69

Phụ lục 5 Phổ 13C-NMR giãn rộng (DMSO, 125 MHz) của BR04 70

Phụ lục 6 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn hợp chất BR04 bằng phương pháp MIC 71

Phụ lục 7 Kết quả thử hoạt tính kháng vi nấm hợp chất BR04 bằng phương pháp MIC 71

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

Concentration

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

spectroscopy

Quang phổ tử ngoại khả kiến

enterococcus

Enterococcus kháng vancomycin

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, các hợp chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng nhiều trong dược phẩm và bệnh lý tự nhiên, do lợi ích sức khỏe của chúng đối với con người và thực vật như chống ung thư, tim mạch, chống lipid máu, hạ huyết áp, chống đường huyết, chống huyết khối, chống xơ vữa và chống tiểu đường (Puri và cs., 2005; Chang và cs., 2013; Atanasov và cs., 2015; Villaescusa và cs., 2015)

Hiện nay, stress oxy hóa vẫn đang là mối quan tâm hàng đầu với các nhà khoa học Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa hoạt động của các chất kháng oxy hóa và việc sản xuất các gốc tự do Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó có ung thư các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hóa sớm (Lại Thị Ngọc Hà và cs., 2009) Trong đó các hợp chất chống oxy hóa tổng hợp như hydroxyanisole butylated (BHA), hydroxytoluene butylated (BHT) và tertiary hydroquinone (TBHQ) thường được sử dụng làm chất bảo quản bởi các công ty dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm Tuy nhiên các hợp chất này gây tổn thương gan, gây ung thư (Whysner và cs., 1994) và gây độc (Moure và cs., 2001) cho con người Do đó, ngày càng có nhiều nhu cầu thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp bằng các

hợp chất tự nhiên, an toàn hơn

Mặt khác, các trường hợp mắc bệnh ung thư mỗi năm diễn ra ngày càng cao là nguyên nhân chính dẫn đến tử vong, do đó chúng đặt ra vấn đề lớn trên toàn thế giới về sức khỏe cộng đồng Các hợp chất chống ung thư hiệu quả không được biết đến nhiều Tuy nhiên, các hợp chất dựa trên thực vật là các hợp chất chữa bệnh tốt hơn các hợp chất được tổng hợp Đặc biệt, vi sinh vật nội sinh ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm cung cấp các loại thuốc có hiệu quả cao, và cũng giúp bảo tồn đa dạng sinh học (Swarnalatha và cs., 2017) Hơn nữa, những biến chứng vốn có của hóa trị liệu trong điều trị ung thư, bao gồm cơ chế kháng thuốc của các tế bào gây ra bởi hóa trị đã khiến các nhà khoa học tập trung vào việc kiểm tra tiềm năng của việc sử dụng vi khuẩn và các hợp chất của chúng để điều trị chống ung thư Bởi vì vi khuẩn là chất gây ung thư và chất kích thích khối u, tạo ra độc tố phá vỡ tín hiệu tế bào do đó gây nhiễu sự điều hòa sự phát triển của tế bào, thúc đẩy khối u tiềm năng

thông qua việc gây viêm Ngoài ra, các enzyme do vi khuẩn sản xuất là các chất gây ung thư tiềm năng, chẳng hạn như enzyme peptidylarginine deaminase (PAD) được tìm thấy trong vi khuẩn miệng và liên quan đến ung thư tuyến tụy Do đó, vi khuẩn đã cho thấy tiềm năng lớn trong điều trị ung thư (Song và cs., 2018)

Vi sinh vật có thể tự tổng hợp các hợp chất tự nhiên hay một số enzyme hoặc cộng sinh với thực vật Các vi khuẩn cư trú bên trong các mô thực vật, được gọi là vi khuẩn nội sinh, cũng tạo ra một loạt các hợp chất này Theo nghiên cứu của Arasu và

cộng sự (2013) vi khuẩn thuộc chi Streptomyces và Bacillus có khả năng sinh các hợp

chất kháng khuẩn (Arasu và cs., 2013) Các chất chuyển hóa kháng khuẩn được tạo

ra giữa các vi khuẩn thuộc chi Streptomyces và Bacillus (Arasu và cs., 2013) Đặc biệt, các chủng Bacillus có mặt khắp nơi trong môi trường, chúng đã được phân lập trên toàn thế giới từ đất, đại dương và thực vật, Bacillus là nguồn hợp chất hoạt

tính sinh học tốt, đáng chú ý là kháng sinh, protein, thuốc ức chế enzyme và các hoạt chất dược lý (Huang và cs., 2009) Chúng tạo ra một số lượng lớn các chất chuyển hóa kháng khuẩn và peptide sinh học với các cấu trúc hóa học và sự đa dạng khác nhau Mặc dù hầu hết các chất này hoạt động chống lại vi khuẩn gram dương, một số có hoạt tính sinh học rộng đối với vi khuẩn gram âm và nấm sợi (Sirtori và cs., 2008) Trong số các hợp chất chống nấm, lipopeptide được xác định có vai trò chính trong việc ức chế (Romero và cs., 2007) Các loại lipopeptide khác nhau được tạo ra bởi

một số chủng B subtilis và B amyloliquefaciens Đặc biệt, một số lipopeptide như surfactin, iturin và fengycin đã được thu nhận từ các loài Bacillus và được xem đặc

trưng (Arebola và cs., 2010; Kim và cs., 2010)

Hiện nay con người có xu hướng chữa bệnh bằng cách sử dụng các bài thuốc từ tự nhiên hơn là thuốc có nguồn gốc từ hóa học Chúng có trong tự nhiên, dễ kiếm lại ít có những tác dụng phụ cho con người Với những công dụng và tiềm năng đã được đề cập ở trên, các cây dược liệu và đặc biệt là hệ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu nên được tập trung nghiên cứu nhằm đưa ra nhiều loại kháng sinh hơn, thân thiện hơn cho các vấn đề sức khoẻ của con người, động vật và có tiềm năng đối phó với các vi khuẩn kháng kháng sinh như MRSA là một trong các vấn đề rất cần được

nghiên cứu Chính vì sự cần thiết và ý nghĩa thực tiễn đã nêu ở trên, thừa kế từ công

trình nghiên cứu trước chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “TINH CHẾ HỢP

CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT VI KHUẨN Bacillus sp RD26 NỘI SINH CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)”

Nội dung thực hiện:

- Cô lập và tinh chế hợp chất từ phân đoạn có khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm gây bệnh

- Xác định cấu trúc hợp chất

- Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, gây độc tế bào của hợp chất phân lập

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VI KHUẨN BACILLUS 1.1.1 Phân loại khoa học

Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau:

Trừ B anthracis và B mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc

dù có sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong mỗi loài, roi điển hình nằm hai bên Hình thành nội bào tử chịu nhiệt, hầu hết cho catalase dương tính Tế bào hình que thẳng hoặc gần thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước 0,5 - 1,2 x 2,5 - 10 𝜇m Sự tạo thành nội bào tử sau đó được chấp nhận như là một đặc tính căn bản để phân

loại và xác định các loài của chi Bacillus (Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008)

Phần lớn các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt, có khả năng hô

hấp trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ) Trong một số trường hợp, chúng còn có thể lên men carbohydrate trong một phản ứng hỗn hợp tạo ra glycerol và butanediol Phần lớn chúng là ưa nhiệt trung bình, khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25 - 75ºC, nhiệt độ tối ưu là 30 - 45oC, khoảng pH rộng 2 - 11, nồng độ muối từ dưới 2 - 25% (Phạm Văn Ty và cs, 2006)

Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus

Trong môi trường nuôi cấy lỏng chúng tạo ván trên bề mặt Trên môi trường thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dạng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, bề mặt khóm sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch (Gibson và cs., 1975)

1.1.2 Ứng dụng của Bacillus

Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có

khả năng sinh các loại enzym như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextrin glucanotransferase, chitinase, glucanase, lipase, serine, protease,…

Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide

xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid,… Dưới điều kiện sống thiếu dinh

dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có

tính kháng khuẩn, vừa có tính kháng virus (Toure và cs., 2004; Hong và cs., 2005)

Một số chủng Bacillus như Bacillus laterosporus, Bacillus firmus và Bacillus cereus hiện nay đang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate) Bacillus pasteurii được đưa vào đất ướt đã tạo ra calcite - một

chất xi măng liên kết đất, chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các tòa nhà

và giúp chúng chịu được động đất Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được dùng làm thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis sp làm chế phẩm

Israelensis serotype H14 diệt lăng quăng Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh gây bệnh như

Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shigella, Vibrio spp.,… nên Bacillus spp được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng

và điều trị viêm tai mũi họng ở người (Berkeley và cs., 2002)

Bacillus còn dùng làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất các loại enzym, acid amin, vitamin và polysaccharide Các chủng Bacillus brevis có khả năng tiết nhiều

protein nhưng không tiết protease vào môi trường nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector chủ biểu hiện các protein tái tổ hợp của người, động vật hữu nhũ và các

sinh vật khác như nhân tố tăng trưởng biểu mô, insulin, interleukin 1-β của bò, kháng

nguyên virus viêm gan B, CGTase (Hong và cs., 2005; Nguyễn Đức Quỳnh Như và cs., 2009; Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009)

1.2 NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC LÝ

Hợp chất tự nhiên từ chi Bacillus tạo ra các sản phẩm có hoạt tính cao Trong đó các nghiên cứu gần đây tập trung ở các loài Bacillus được phân lập hầu hết ở biển

và đất nên ít có nghiên cứu chính thức nào về các hợp chất có đầy đủ hoạt tính sinh

học của loài Bacillus nội sinh Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự đa dạng và

phân bố của vi khuẩn nội sinh ở một số loài thực vật, chúng được phát hiện là các vi sinh vật nội sinh chủ yếu

Năm 2012, Bhoonobtong và cộng sự đã phân lập thành công chủng vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens từ cây dược liệu Memecylon edule Roxb và nghiên cứu

hoạt tính kháng khuẩn từ chủng vi khuẩn phân lập được (Bhoonobtong và cs., 2012)

Đồng thời, Chen và cộng sự cũng đã phân lập được chủng Bacillus amyloliquefaciens sp từ cây Ophiopogon japonicus sau đó khảo sát hoạt tính kháng ung thư (Chen và

cs., 2012)

Đến năm 2018, Ansary và cộng sự khi nghiên cứu về hệ vi sinh vật nội sinh ở

rễ, lá và hạt của một số cây dược liệu như: Duranta plumeri, Ocimum gratissimum L., Terminalia bohera và Manihot esculenta phân lập được một số chủng Bacillus

spp và khảo sát hoạt tính ức chế nấm mốc (Ansary và cs., 2018) Ngoài ra, trong cùng năm 2018, Tamošiune và cộng sự đã công bố vi sinh vật nội sinh có trong cây táo có vai trò quan trọng giảm sự xâm nhiễm và stress do môi trường đồng thời phân

lập được chủng Bacillus spp từ cây này (Tamošiune và cs., 2018)

Năm 2019, Hazarika và cộng sự đã phân lập được chủng Bacillus subtilis từ lá

cây mía và khảo sát hoạt tính kháng các loài nấm gây ảnh hưởng cho lá cho kết quả cao (Hazarika và cs., 2019)

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Thành phần hóa học của chi Bacillus nội sinh chưa được khảo sát nhiều nhưng một số loài cùng chi Bacillus được phân lập từ đất, nước biển đã được các nhà khoa

học quan tâm và công bố về một số hoạt tính sinh học của chúng Thành phần hóa học của một số loài cùng chi và các hoạt tính sinh học được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số hợp chất được cô lập từ một số loài thuộc chi Bacillus và hoạt

tính sinh học của chúng

Bacillus amyloliquefaciens

Kháng khuẩn S aureus và B subtilis có nồng độ

lần lượt là 5 và 20 µg/ đĩa

Bảo vệ tế bào bạch cầu chống lại HIV bằng ức chế quá trình sao chép virus tại nồng độ 10 µg/mL

Gustafson và cs., 1989; Lee

và cs., 2004

S aureus giá trị MIC lần

lượt là 0,3 và 0,1 µg/mL

Gao và cs., 2010

pneumonia giá trị ED50

tương ứng (4) và (5) là 1,31 và 15,6 mg/kg khi thử trên đối tượng chuột

Chen và cs., 2009

parapsilosis, C krusei và P candida, với giá trị

(MIC) là 0.81 µg/mL;

Ức chế nấm mốc A niger có giá trị MIC

1.63 µg/mL

Bacillus pumilus Surfactin (8)

Ức chế vi khuẩn S aureus, P vulgaris và E faecalis giá trị từ (6,5-

25 µg/mL)

Berrue và cs., 2009

Bacillus sp CND-914

Halobacillins 1 (9) Gây độc tế bào 116) với IC50 là 0,98 µg/mL

(HCT-Trischman và cs.,

1994 Halobacillins 2 (10)

Bacillus mojavensis

Ma và cs., 2012 Anteiso-C17

Bacillus marinus Marihysin A (14)

Ức chế xâm nhiễm vi khuẩn phổ rộng lên thực vật với giá trị MIC từ 100-200 µg/mL

Liu và cs., 2010

Bacillus laterosporus

Basiliskamide A (15) Ức chế nấm C albicans

và A fumigatus giá trị

MIC lần lượt là 1,0-3,1

µg/mL

Barsby và cs., 2002

Basiliskamide B (16)

Ức chế khuẩn gram dương và gram âm với giá trị (MIC từ 8–32 µg/mL) Ngoài ra, gây độc tế bào chống lại tế bào ung thư phổi và ung thư dạ dày với giá trị GI50 lần lượt 25,18 và 17,78 µg/mL

Cane và cs., 1999 Ieodoglucomide

Li và cs., 2012 Bacilosarcins B

(22)

Gây độc tế bào HeLa với giá trị IC50 là 33,60 µM

Amicoumacins

Gây độc tế bào HeLa với giá trị IC50 là 4,32 µM

Bacillistatins 1 (31) Ức chế sự tăng trưởng

của dòng tế bào ung thư với GI50 là 10-4-10-5

µg/mL Và kháng vi

khuẩn S pneumoniae

Pettit và cs., 2009 Bacillistatins 2 (32)

Bacillus

thuringiensis β-exotoxin (33)

và cs., 2002

Gerard và cs., 1996

Kháng MRSA (MIC 2 µg/mL), VRE (MIC 10

µg/mL) và E coli (MIC

35 µg/mL)

Li và cs., 2011

đại tràng (HCT-116) lần lượt có giá trị IC50 là 0,68; 1,6; 1,3 µg/mL

Zhang và cs., 2004

Bacillus atrophaeus

Neobacillamide

Yu và cs., 2009

polykrikoides (LC50 sau 6 giờ là 3,2 µg/mL)

(23) R3=NH2 (24) R3=OH

(25)

(26)

(27) R=H; n=1 (28) R=CH3; n=1 (29) R=H; n=2 (30) R=CH3; n=2

(31) (32)

(35)

(36) R= (37) R= (38) R=

(39) (40) R=O (41) R=OH (42) R=NHAc

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 1.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là silicagel, nhôm oxyd) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di

chuyển các cấu tử của mẫu thử theo vận tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau (Bendich và cs., 1989)

1.4.2 Phương pháp sắc ký cột cổ điển (CC)

Mẫu thử được nạp lên đầu cột chứa chất hấp phụ (thường là silicagel, nhôm oxyd) Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng sẽ bị dung môi giải hấp thụ và đẩy đi với các vận tốc khác nhau, tạo thành các băng có vị trí khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau (Bendich và cs., 1989)

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC 1.5.1 Phương pháp tự sinh đồ

Phương pháp tự sinh đồ là kĩ thuật hiện hình sinh học, đây là một kĩ thuật thường được áp dụng để xác định hoạt tính kháng sinh và nhóm chức hóa học có hoạt tính Kỹ thuật này đơn giản, tiện lợi để xác định tác dụng kháng sinh, khảo sát tính chất và các cấu thành của những dịch chiết, những hỗn hợp chưa xác định rõ thành phần hay những hợp chất tinh khiết Các hợp chất hiện diện trên tấm sắc ký sẽ được định danh trực tiếp bằng các phương pháp giải cấu trúc hợp chất như: GC-MS, NMR, MS,…Hiện nay có hai loại kỹ thuật hiện hình sinh học được sử dụng:

• Kỹ thuật hiện hình sinh học trực tiếp (TLC-DB)

Kỹ thuật này cho phép phát hiện hoạt tính sinh học trực tiếp ngay trên sắc ký đồ, có hiệu quả trong việc tìm các hợp chất kháng nấm Một số loài nấm đã được thử

nghiệm là: Cladosporium cucumerinum, Candida albicans, Aspergillus sp và Penicillium sp.….(Choma và cs., 2015)

• Kỹ thuật Thạch – phủ (Agar – Overlay)

Kỹ thuật này kết hợp bằng tiếp xúc trực tiếp của tấm sắc ký và môi trường, có ưu điểm hơn ở chỗ cho vùng ức chế rõ ràng và ít bị ngoại nhiễm Trong đó, hợp chất sau khi được tách ra trên bản mỏng sẽ di chuyển từ bản mỏng (pha tĩnh) ra lớp thạch đã cấy vi sinh vật thử nghiệm Người ta còn thêm một số chất chỉ thị màu như muối

tetrazolium, đỏ phenol, p-Iodonitrotetrazolium,… để giúp phát hiện vùng ức chế rõ hơn Kỹ thuật đã được áp dụng thành công với một số vi khuẩn như: Candida albican, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis

(Dewanjee và cs., 2015)

1.5.2 Phương pháp pha loãng

Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ từ cao đến thấp theo cấp số nhân trong môi trường đã có sẵn vi khuẩn thử nghiệm Ủ ở thời gian và nhiệt độ thích hợp Ở những nồng độ chất thử có tác dụng ức chế vi sinh vật thì các ống thử trong, khi chất thử không có hoạt tính ống trở nên đục nghĩa là vi sinh vật phát triển bình thường Độ đục của ống thử có thể quan sát trực tiếp hoặc bằng quan phổ kế Phương pháp này để định lượng tác động của chất thử trên vi khuẩn Mức độ ức chế của chất thử nghiệm được xác định qua nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của vi sinh vật của chất thử (MIC) Giá trị MIC càng thấp, chất thử có hoạt tính kháng vi sinh vật càng mạnh (Bendich và cs., 1989)

1.5.3 Phương pháp khuếch tán

Phương pháp này dựa vào khả năng khuếch tán của hoạt chất được thể hiện qua vòng ức chế xung quanh một đĩa giấy hay một lỗ đục trên mặt thạch Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, độ chính xác cao, tiết kiệm chi phí do đó thường được sử dụng để khảo sát tác động kháng khuẩn, kháng nấm của các chất từ đó đưa đến sơ bộ kết luận được chất thử kháng những vi khuẩn nào, tác dụng mạnh hay yếu Một số phương pháp khuếch tán qua: đĩa giấy, giếng và khoang thạch thử

1.5.4 Các phương pháp thử độc tính tế bào

1.5.4.1 Phương pháp xác định khả năng ức chế tế bào

Xác định độc tính của hợp chất ở nồng độ 100 µg/ mL, với dung môi hòa tan là DMSO trên các dòng tế bào ung thư người bằng phương pháp MTT đã được Viện ung thư Hoa Kỳ (NCI) sử dụng cho chương trình sàng lọc

Các dòng tế bào ung thư người được thực hiện: MCF-7 (ung thư vú), NCI-H460 (ung thư phổi), Hep G2 (ung thư gan),…

1.5.4.2 Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 dephenyl tetrazodium bromide)

Phương pháp MTT dựa trên hoạt động của enzyme dehydrogenase ty thể trong tế bào sống Sự thay đổi hoạt động của enzyme này tỉ lệ thuận với sự thay đổi hoạt động sống của tế bào Enzyme này chuyển đổi cơ chất màu vàng tan trong nước 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 dephenyl tetrazodium bromide (MTT) thành sản phẩm formazan không tan trong nước Lượng formazan phản ánh gián tiếp hoạt động sống của tế bào (Mundi và cs., 2017)

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT

Các chất thu được qua sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng chế hóa được đem xác định: Phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Xác định cấu trúc hợp chất phân lập dựa trên phương pháp phổ: Phổ khối phun mờ điện tử (ESI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

(Bendich và cs., 1989)

1.6.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Phương pháp phổ dao động và một trong những phương pháp hữu hiệu nhất để xác định các vấn đề về định tính cũng như định lượng Sau khi ghi phổ hồng ngoại, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu cơ thì trước tiên nghiên cứu vùng dao động co giãn của H để xác định xem mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hoặc cả hai Sau đó nghiên cứu các vùng tần số nhóm để xác định xem có hay không có nhóm chức Phương pháp xác định độ tinh khiết và phân tích định lượng (Bendich và cs., 1989)

1.6.2 Phương pháp phân tích sắc ký khí – khối phổ (GC-MS)

Bản chất của GC-MS là sự kết hợp của sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS) Sắc ký khí (GC): Phân tích hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo từng chất tinh khiết Khối phổ (MS): Xác định định tính và định lượng

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 12 năm 2019 đến tháng 07 năm 2020:

+ Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh 1, Cơ sở 3, Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh

+ Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 04 năm 2020: Phòng 19 – Phòng Các chất có hoạt tính Sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, Số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Tp Hồ Chí Minh

+ Từ tháng 04 năm 2020 đến tháng 07 năm 2020: Phòng 4.4 – Phòng Các chất có hoạt tính Sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, Đường TL29, Phường Thạnh Lộc, Quận 12, Tp Hồ Chí Minh

2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp RD26 phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum et Thonn) tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh,

Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Chủng vi khuẩn methicillin resistant Staphylococcus aureu (MRSA) ATCC 43300, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

Chủng nấm da Trichophyton mentagrophytes và Microsporum canis được cung

cấp bởi Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

2.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ

+ Cân kỹ thuật + Nồi hấp + Tủ cấy + Máy ly tâm + Tủ ấm + Tủ sấy + Kính hiển vi

+ Máy vortex + Máy lắc

+ Máy cô quay chân không

+ Máy soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm

+ Bản mỏng silica gel 60 F254 –Merck tráng sẵn

Một số dụng cụ khác: ống nghiệm, đèn cồn, tăm bông, đĩa petri, giá ống nghiệm, pipette, micropipette, bông gòn, bình scotte, erlen, que cấy vòng, que cấy trang, đũa khuấy, kéo, kẹp sắt, cột sắc ký, bình cầu, ống mao quản, hủ bi, ống nhỏ giọt…

2.2.2.2 Hóa chất và môi trường

Các dung môi: chloroform, ethyl acetate, methanol, ethanol và nước

Thuốc thử hiện hình vết trên bảng sắc ký lớp mỏng: dung dịch H2SO4

Khảo sát hoạt tính kháng MRSA ở 6

phân đoạn Cao chiết methanol

chủng Bacillus sp RD26

Sắc ký cột cao phân đoạn

Sắc ký cột cao tổng

Xác định cấu trúc hợp chất

Thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.3.2 Phương pháp nhuộm bào tử

Các bước tiến hành:

Bước 1: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính

Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1-2 giọt cồn 960 Đốt cháy và dập tắt ngay khoảng 10 giây

Đặt tiêu bản lên trên giá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc beaker có chứa một ít nước đang đun nóng 85-900C (không để cho sôi) trên bếp

Bước hai: Tiến hành nhuộm tiêu bản Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi

Nhỏ 2-3 giọt dung dịch lục malachite 5% lên vết bôi và tiến hành hơ hơi nước nóng trong 5-10 phút Nếu thấy thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sung

Rửa vết bôi bằng nước cất trong 30 giây (lúc đó các tế bào dinh dưỡng sẽ bị mất màu còn bào tử vẫn giữ lại màu)

Đặt tiêu bản lên giá đỡ, giá được đặt trên chậu rửa Đặt giấy lọc lên trên vết bôi

Nhỏ 2-3 giọt dung dịch safranin hay fuchsin lên trên miếng giấy lọc, để 30 giây Rửa nước rồi thấm khô hay để khô tự nhiên vết bôi

Bước ba: Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính dầu (x100)

Kết quả: Tiêu bản nhuộm đúng thì bào tử sẽ bắt màu xanh lục, tế bào chất bắt

Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô cột

Cho một ít bông gòn ở đáy cột (ngay phía dưới vòi nhỏ giọt) để silica gel không chảy ra ngoài

Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung môi ít phân cực trộn đều

Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung môi, mở cột xả để ổn định cột

Cao chiết thu được sẽ được hòa tan trong dung môi chiết - Các bước thực hiện:

Sử dụng ống mao dẫn, chấm một hàng các điểm của phần hoạt tính của cao chiết được chấm cao hơn 1,5 cm so với đáy của các tấm TLC và cách bề mặt dung môi từ