phân lập và tinh chế hoạt chất kháng staphylococcus aureus atcc 43300 mrsa từ cao chiết sâm đại hành eleutherine subaphylla gagnep

Merr đối với vi khuẩn gây bệnh, kết quả từ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ n - hexane, ethyl acetate và ethanol 96% có khả năng ức chế sự tăng trưởng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT KHÁNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 43300 (MRSA) TỪ CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep.)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

GVHD: ThS DƯƠNG NHẬT LINH TS NGUYỄN TẤN PHÁT SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH MSSV: 1553010167

NIÊN KHÓA: 2015 – 2019

Bình Dương, tháng 06 năm 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT KHÁNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 43300 (MRSA) TỪ CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep.)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

GVHD: ThS DƯƠNG NHẬT LINH TS NGUYỄN TẤN PHÁT SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH MSSV: 1553010167

NIÊN KHÓA: 2015 – 2019 GVHD 1 ký tên: GVHD 2 ký tên:

Bình Dương, tháng 06 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Khoảng thời gian hơn 2 năm gắn bó với phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh - Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh là khoảng thời gian vui vẻ và ý nghĩa nhất đối với tôi Nó đã để lại trong tôi rất nhiều những kỉ niệm và nhiều cảm xúc khác nhau buồn vui đều có và cũng chính tại nơi đây đã cho tôi những bài học kinh nghiệm quý báu Để hoàn thành đề tài này tôi xin cảm ơn thầy cô, anh chị, bạn bè và cả gia đình

Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy ThS Nguyễn Văn

Minh, cô ThS Dương Nhật Linh Thầy cô là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và

chia sẽ cho em những kiến thức bổ ích, không chỉ riêng những bài học kiến thức mà còn có những bài học kinh nghiệm trong cuộc sống qua những bài học đó đã giúp em trưởng thành và tự tin hơn Thầy cô là người đã động viên, giúp đỡ em trong những lúc em gặp khó khăn để em có thể hoàn thành tốt đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Tấn Phát đang

công tác tại Viện Công nghệ Hóa học, thầy là người đồng hướng dẫn và là người đã giúp đỡ em rất nhiều về mặt trang thiết bị, cũng như chỉ dạy cho em hiểu rõ các phương pháp có trong đề tài của em Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy Minh và các anh chị đang làm việc ở phòng 47 tại viện, thầy và các anh chị đã giúp đỡ em rất nhiều về cách vận hành thiết bị, cung cấp cho em một vài dung môi, hóa chất và trao đổi với em rất nhiều kiến thức quý báu để em có thể thực hiện các thí nghiệm của đề tài theo một cách tốt nhất

Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Quý thầy cô đã hết lòng giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng vững chắc để em có thể hoàn thành tốt công việc của mình

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni, chị đã nhiệt tình ủng hộ và hết lòng giúp đỡ

em giải quyết các vấn đề gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài

Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn tất cả các bạn cùng làm đề tài chung với tôi ở phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã bên cạnh

giúp đỡ tạo điều kiện để mình hoàn thành tốt đề tài Cũng xin cảm ơn các em Nguyễn Thị Trúc Ly, Nguyễn Châu Khoa đã hỗ trợ và phụ giúp tôi trong thời gian qua để có thể hoàn thành tốt đề tài

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba Mẹ những người đã sinh thành, nuôi nấng, chăm sóc và dạy dỗ con khôn lớn đến ngày hôm nay Ba Mẹ cũng là người đã

động viên, ủng hộ và tạo cho con những điều kiện tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình

Kính chúc tất cả quý thầy cô, anh chị, bạn bè, các em, cả gia đình dồi dào sức khỏe, luôn luôn hạnh phúc và gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống Xin chân thành cảm ơn!

Bình Dương, ngày tháng 06 năm 2019

Nguyễn Xuân Sanh

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) 5

1.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) 5

1.1.2 Tình hình MRSA trên thế giới và Việt Nam 8

1.2 Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) 10

1.2.1 Phân loại khoa học 10

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 16

1.4 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu 19

2.2 Vật liệu nghiên cứu 25

2.3 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết 26

2.4 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 28

2.5 Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) của các loại cao chiết 29

2.5.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 29

2.5.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) 29

2.6 Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột 29

2.7 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 31

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả giám định tên khoa học của cây 33

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết 33

3.3 Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 36

3.4 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết 37

3.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn MRSA 39 3.6 Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột 42

3.7 Xác định cấu trúc của hợp chất ES02 49

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

4.1 KẾT LUẬN 53

4.2 ĐỀ NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

1 Tài liệu tiếng Việt 55

2 Tài liệu tiếng Anh 56

3 Tài liệu Internet 59

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 3.1 Khối lượng và hiệu suất thu hồi các cao phân đoạn 33 Bảng 3.2 Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn sống có trong cao chiết 36 Bảng 3.3 Kết quả thử khả năng kháng MRSA của các cao chiết từ sâm đại hành 37 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với vi khuẩn MRSA từ cao chiết sâm đại hành 39

Bảng 3.5 Hàm lượng thu nhận các cao tiểu phân đoạn từ cao phân đoạn n-hexane 42

Bảng 3.6 Kết quả thử khả năng kháng MRSA của các cao phân đoạn 45 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 1H (500 Hz) và 13C (125 Hz) của ES02 và chất eleutherol đo

trong DMSO-d6 50 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết 34 Biểu đồ 3.2 So sánh kết quả kháng MRSA của các loại cao chiết từ củ sâm đại hành 38

Biểu đồ 3.3 So sánh kết quả kháng MRSA của các phân đoạn của cao n-hexane 46

DANH MỤC VIẾT TẮT

Acinetobacter baumannii: A.baumannii Aeromonas hydrophila: A hydrophila Bacillus cereus: B cereus

Cộng sự: cs

Dimethyl sulfoxide: DMSO

Escherichia coli: E coli

Ethyl acetate: EtOAc

Klebsiella pneumoniae: K pneumoniae

Minimum Inhibitory Concentration: MIC Mueller Hinton Agar: MHA

Streptococcus faecalis: S faecalis

Tiểu phân đoạn 1 cao n-hexane của sâm đại hành: ES-H1 Tiểu phân đoạn 2 cao n-hexane của sâm đại hành: ES-H2 Tiểu phân đoạn 3 cao n-hexane của sâm đại hành: ES-H3 Tiểu phân đoạn 4 cao n-hexane của sâm đại hành: ES-H4 Tiểu phân đoạn 5 cao n-hexane của sâm đại hành: ES-H5

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình vi thể của MRSA 5

Hình 1.2 Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) 11

Hình 1.3 Công thức hóa học của eleutherin và isoeleutherin 12

Hình 1.4 Công thức hóa học của eleutherol và methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester 13

anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-Hình 1.5 Công thức hóa học của mangiferin và isomangiferin 13

Hình 1.6 Công thức hóa học của eleutherinone 13

Hình 1.7 Công thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, O-D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B, eleuthoside C, elecanacin và hongconin 14

eleutherinol-8-Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 25

Hình 2.2 Sơ đồ chiết cao sâm đại hành 27

Hình 3.1 Thu cao n-hexane bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng 35

Hình 3.2 Thiết bị máy cô quay thu cao 35

Hình 3.3 Cao n-hexane thu nhận được sau khi chiết lỏng – lỏng 36

Hình 3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết từ củ sâm đại hành 37

Hình 3.5 MIC kháng MRSA của cao nước ở nồng độ 1/32 và 1/64 41

Hình 3.6 MIC kháng MRSA của cao ethyl acetate ở nồng độ 1/32 và 1/64 41

Hình 3.7 MIC kháng MRSA của cao n-hexane ở nồng độ 1/32 và 1/64 42

Hình 3.8 Cao n-hexane được trộn đều với silica gel để chuẩn bị cho quá trình chạy cột 43

Hình 3.9 Ổn định silica gel trong cột sắc ký 43

Hình 3.10 Cột sắc ký thu phân đoạn 1 44

Hình 3.11 Cột sắc ký thu phân đoạn 2 44

Hình 3.12 Cột sắc ký thu phân đoạn 3 44

Hình 3.13 Cột sắc ký thu phân đoạn 4 44

Hình 3.14 Cột sắc ký thu phân đoạn 5 45

Hình 3.15 Phân đoạn 2 chạy cột sắc ký để thu nhận chất 45

Hình 3.16 Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA của các phân đoạn cao n-hexane 46

Hình 3.17 Sắc ký lớp mỏng ES-H1 47

Hình 3.18 Sắc ký lớp mỏng ES-H2 47

Hình 3.19 Chất ES02 thu được trong quá trình chạy cột từ bình 16-19 48

Hình 3.20 Tinh thể của chất thu được ES02 48

Hình 3.21 SKLM ES02 từ 16-19 ở UV 254 48

Hình 3.22 SKLM ES02 từ 16-19 ở UV 365 48

Hình 3.23 SKLM ES02 từ 16-19 sau khi tác dụng với acid và nhiệt 48

Hình 3.24 Cấu trúc hoá học của ES02 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng sinh là chất do vi sinh vật tiết ra, tổng hợp hoặc bán tổng hợp mà ở nồng độ thấp nhất có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn (Nguyễn Văn Kính, 2010) Trên thế giới, vấn đề vi khuẩn kháng thuốc ngày càng phát triển và giới hạn sự lựa chọn trong việc sử dụng thuốc để chữa bệnh, đặc biệt đối với sự xâm nhiễm của vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+) Trong đó có các chủng kháng kháng sinh phổ

biến như E coli, MRSA là nguyên nhân chính trong sự bùng nổ nhiễm khuẩn ở bệnh viện và ở cộng đồng trên toàn thế giới Vi khuẩn tụ cầu vàng S aureus được xếp vào vi khuẩn kháng thuốc ở mức độ báo động cao Trong tổng số 110 chủng S aureus phân

lập từ bệnh phẩm máu, dịch vô trùng, dịch vết thương tại bệnh viện, có 70 vi khuẩn MRSA chiếm 64% và 40 chủng MSSA chiếm 36% (Phan Nữ Đài Trang và cs., 2016) Do đó, việc tìm nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng ngày càng trở nên cấp thiết

Hiện nay, cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật được sử dụng để chữa bệnh ngày càng nhiều Thực vật được xem như là một trong những nguồn thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, không hoặc ít phản ứng phụ và có nhiều đích tác động khác nhau lên tế bào vi khuẩn nên ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs., 2002) Các loài thực vật này có trong tự nhiên, dễ kiếm, lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Đỗ Tất Lợi, 2006) Sâm đại

hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một loại cỏ sống lâu năm, cao từ 30 - 60 cm,

dò (củ) hình trứng dài 4 - 5 cm, đường kính 2 - 3 cm giống như củ hành nhưng dài hơn, bên ngoài phủ vảy màu đỏ nâu, phía trong màu nâu hồng đến đỏ nâu Sâm đại hành có tác dụng kháng sinh, chống viêm,… (Đỗ Tất Lợi, 2006) và đã được sử dụng phổ biến trong dân gian

Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu đã nghiên cứu về sự thuần chủng và tính kháng khuẩn của sâm đại hành Kết quả cho thấy sâm đại hành không thuần chủng, được chia làm 11 dòng, tính kháng khuẩn của các dòng trên vi khuẩn được thử nghiệm có hoạt

tính khác nhau, nhưng tất cả đều tác động rất tốt trên S aureus (MIC = 256-512

µg/ml), kế đến S faecalis (MIC = 512-1024 µg/ml), yếu hơn trên P aeruginosa và A hydrophila (MIC = 2048-4096 µg/ml), kháng khuẩn yếu nhất trên E coli và Salmonella spp (MIC = 4096 µg/ml) (Huỳnh Kim Diệu, 2011) Năm 2018, Harlita và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của Eleutherine palmifolia L (Merr) đối

với vi khuẩn gây bệnh, kết quả từ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ ra rằng các

chất chiết xuất từ n - hexane, ethyl acetate và ethanol 96% có khả năng ức chế sự tăng trưởng của MRSA, B cereus, Shigella spp., và P aeruginosa (Harlita và cs., 2018)

Năm 1951, lần đầu tiên cây sâm đại hành được nghiên cứu bởi Schmid và cộng sự, hai hợp chất là eleutherin và isoeleutherin đã được phân lập (Schmid và cs., 1951) Ở Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học của loài sâm đại hành, ngoài công bố phân lập được 4 hợp chất là eleutherin C16H16O4 độ chảy 175o, izoeleutherin C16H16O4 độ chảy 177o, eleutherol C14H12O4 độ chảy 202-203o

và một chất chưa xác định được đặt tên là Ex của Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn Cả 3

hoạt chất đều có tác dụng kháng sinh đối với chủng S aureus (Lê Văn Hồng và

Nguyễn Văn Đàn, 1978) Như vậy, trên thế giới đã có các nghiên cứu về cây sâm đại hành từ rất sớm Các nghiên cứu cho thấy thành phần hoá học chủ yếu của sâm đại hành là các hợp chất quinone và dẫn xuất

Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về các hợp chất và khả năng kháng khuẩn, kháng nấm từ cao chiết sâm đại hành Tuy nhiên, hướng nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc của cao chiết sâm đại hành vẫn chưa được quan tâm nhiều, cũng như khả năng kháng khuẩn kháng thuốc của cao chiết dược liệu Nhằm tìm ra giải pháp để giải quyết những vấn đề trên chúng

tôi tiến hành thực nghiên cứu “Phân lập và tinh chế hoạt chất kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết sâm đại hành (Eleutherine subaphylla

Gagnep.)”

Mục tiêu:

- Khảo sát khả năng kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 (MRSA) của cao

chiết từ sâm đại hành

- Chiết xuất và phân lập hợp chất kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300

(MRSA) của cao chiết từ sâm đại hành

Nội dung:

− Khảo sát hệ dung môi ngâm chiết của sâm đại hành

− Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn cao chiết của sâm đại hành theo tiêu chuẩn dược điển Việt Nam IV

− Khảo sát khả năng kháng MRSA của các cao chiết phân đoạn từ củ sâm đại hành

− Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết sâm đại hành đối với MRSA

− Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột

− Xác định cấu trúc các hợp chất thu được trong cao chiết sâm đại hành

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300

(MRSA)

1.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)

Staphylococcus aureus kháng methicillin (methicillin resistant S aureus hay viết tắt MRSA) là các loại S aureus đã trở nên có khả năng kháng một số thuốc kháng sinh được dùng để điều trị nhiễm trùng S aureus Các loại vi khuẩn được gọi là MRSA khi

mà một số loại kháng sinh khi được dùng không có hiệu quả để chống lại chúng Các vi khuẩn này có thể sống cộng sinh ở vùng da hoặc vùng tai - mũi - họng mà không hề gây ra bệnh Những người bị nhiễm MRSA được gọi là vật chủ Chính vì vậy phát hiện

kháng methicillin trên S aureus có thể được xem như phát hiện một thông số chỉ điểm được vi khuẩn S aureus kháng đa kháng sinh (CLSI, 2004) MRSA là các chủng S aureus biểu hiện cơ chế kháng qua mecA hoặc qua cơ chế kháng methicillin khác, ví

dụ thay đổi ái lực của protein gắn penicillin với oxacillin (CLSI, 2011)

Phân loại khoa học Giới: Eubacteria Ngành: Firmicutes Lớp : Bacilli

Bộ : Bacillales

Họ: Staphylococcaceae

Chi: Staphylococcus

Loài: Staphylococcus aureus

MRSA là một vấn đề y tế toàn cầu và là một thách thức trong điều trị MRSA thường gây nhiễm trùng bệnh viện nặng Sự lây nhiễm MRSA dẫn đến tử vong ở các bệnh viện tại Việt Nam cũng như các nước trên Thế giới như Singapore, Anh, Đức, Thụy Sĩ, đang khiến giới y học đặc biệt quan tâm Đây là một loại bệnh gây suy yếu hệ miễn dịch và làm cho bệnh nhân kháng lại các loại thuốc kháng sinh thông dụng Con đường lây truyền bao gồm: máu, phổi, da (khi phẫu thuật) và nước tiểu, vì vậy vi khuẩn này xuất hiện nhiều ở các bệnh viện, đặc biệt lây lan trong quá trình phẫu thuật hay lây qua các ống dẫn tiểu, ống truyền nước biển nếu các thiết bị này không được vô

Hình 1 1 Hình vi thể của MRSA

trùng hiệu quả Một cuộc nghiên cứu ở Thụy Sĩ cho thấy con số các ca nhiễm MRSA trong nước đã tăng gấp đôi trong năm 2003 so với năm trước đó.Trong số các bệnh viện được khảo sát, MRSA được tìm thấy ở 176 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 45%, trong đó 7,7% bị lây khi đang nằm viện Tại Đức, các bệnh viện được yêu cầu phải theo dõi sát số ca nhiễm MRSA ( Hidron AI và cs, 2008)

Trước mắt, các Hiệp hội y trên Thế giới đều kêu gọi các bệnh viện quản lý tốt hơn tình hình vệ sinh trong bệnh viện để ngăn chặn các tác nhân lây bệnh MRSA

thường kéo theo sự đề kháng các kháng sinh khác là vì cơ chế đề kháng của S aureus

đối với methicillin là biến đổi protein bám penicillin (PBP) chỉ do một gen quy định (mecA) và kháng thuốc kiểu này là kháng thuốc một cấp, nghĩa là một khi đã đề kháng được methicillin thì vi khuẩn đề kháng được tất cả các kháng sinh -lactam và có thể kháng các kháng sinh khác nữa (Phạm Hùng Vân và cs., 2005) Hầu hết các chủng tụ cầu ban đầu nhạy cảm với kháng sinh nhóm -lactam như penicillin, methicillin Tuy nhiên, song hành cùng với việc sử dụng kháng sinh là sự phát triển các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh dưới áp lực chọn lọc tự nhiên Việc sử dụng tràn lan và lạm dụng các loại thuốc kháng sinh, nhất là ở các nước đang phát triển như Việt Nam càng đẩy nhanh tốc độ chọn lọc và xuất hiện của các chủng kháng thuốc Tình trạng kiểm soát nhiễm trùng chưa đạt tiêu chuẩn, điều kiện vệ sinh và các phương pháp xử lý thực phẩm không phù hợp càng tạo điều kiện phát tán các chủng vi khuẩn đề kháng này Hiện nay, các chủng đề kháng methicillin một kháng sinh được coi là mạnh nhất trong nhóm -lactam đã phát triển một cách đáng lo ngại, nhất là trong các trường hợp

nhiễm trùng tại bệnh viện Hầu hết các dòng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh

khác nhau Một vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những dòng này ngày càng tăng Những dòng MRSA rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm

thấy plasmid kháng vancomycin ở E faecalis có thể chuyển sang S aureus và người ta

nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng

hạn Ngoài ra, S aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế (Todar K., 2005)

Ngày càng xuất hiện nhiều chủng đa kháng kháng sinh hơn Điều này cho thấy tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp và một hệ thống

giám sát quốc gia về kháng sinh của vi khuẩn nói chung, của S aureus nói riêng là cần

thiết, đặc biệt là đối với các chủng MRSA hay MSSA tại Việt Nam (Nguyễn Hữu An

và cs., 2013) Ngày nay, vi khuẩn MRSA đã hiện diện từ 3-5% trên tất cả các chủng S aureus (Hemamalini và cs., 2015) Trong những năm gần đây, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh

viện toàn cầu đã chứng kiến một sự gia tăng đáng kể Tại Ấn Độ, tình trạng MRSA gia tăng đáng kể từ 29% - 47% trong năm 2014 (CDDEP, 2015)

MRSA được chia ra làm hai loại: MRSA bệnh viện và MRSA cộng đồng

MRSA bệnh viện (MRSA-N): do mắc phải gene gây biến đổi PBP-2a Protein này được mã hóa bởi gene mecA định vị trên yếu tố di truyền di động Chúng tác động giống như transpeptidase, liên kết với peptidoglycan chủ yếu ở cấu trúc màng tế bào vi khuẩn PBP-2a khác với PBP bình thường ở chỗ chúng có ái lực rất yếu với kháng sinh nhóm - lactam, do vậy các kháng sinh nhóm Penicillin, Cephalosporin và các - lactam khác không có tác dụng chống MRSA-N Gần đây, một số thuốc mới đắt tiền và độc hơn đã xuất hiện để giúp chúng ta chống lại MRSA như: Linezolide, Tigecycline, Daptomycin, Ceftobprole và Dalbavancine (Jettes L và cs, 2009)

MRSA cộng đồng (MRSSA-C): Từ sau thập niên 1990, đã xuất hiện các trường hợp nhiễm cộng đồng MRSA hoàn toàn không có yếu tố nhiễm khuẩn bệnh viện và ngày nay đang có nhiều nhận biết mới về chủng kháng thuốc cộng đồng này (Steafani S và cs, 2009), (Hidron AI và cs, 2009) Trái với MRSA-N, các chủng MRSA-C phát tán trong quần thể khỏe mạnh, nơi các cá thể tiếp xúc với nhau rất gần gũi như các vận động viên thể thảo, các em nhỏ ở nhà trẻ, các phạm nhân trong nhà tù, các quân dân và các người dân địa phương Trường hợp đầu tiên được phát hiện ở Mỹ năm 1982, với một chủng ít lan tràn, đề kháng với các kháng sinh khác như: Doxycycline và clindamycine Kể từ đó số ca mắc và độ nặng tăng dần lên (Rybak MJ và cs, 2005)

Hiện nay, nhiễm trùng bệnh viện làm gia tăng đáng kể chi phí điều trị và tỉ lệ tử

vong ở bệnh nhân nằm viện Các chủng Staphyloccoci, đặc biệt vi khuẩn MRSA là một

trong những chủng gây ra các nhiễm trùng khó điều trị và phổ biến ở bệnh viện Một nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và cộng sự tại 7 phòng thí nghiệm vi sinh cho thấy:

Trên 235 chủng S aureus phân lập được, trong đó có 110 chủng MRSA và 125 chủng MSSA Như vậy, tỷ lệ MRSA trong các chủng vi khuẩn S aureus nghiên cứu là 47%

(Vân PH và cs, 2005) Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại TP Hồ Chí Minh

năm 2005 cho thấy các chủng S.aureus phân lập từ bệnh phẩm có đến 94,1% chủng

kháng penicillin, 52,9% kháng ciprofloxacin, 52% kháng amoxillin và 12,5% kháng getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006)

1.1.2 Tình hình MRSA trên thế giới và Việt Nam

Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi và không có sự kiểm soạt chặt chẻ như ngày

nay đã dẫn đến hiện tượng kháng thuốc ở nhiều loại vi khuẩn không ngừng gia tăng, điều này làm cho một số loại thuốc kháng sinh mất tác dụng chữa trị và kho tàng thuốc kháng sinh trở nên hạn hẹp và khan hiếm Tại các bệnh viện Nhiệt đới Trung ương, Bạch Mai, Nhi Trung ương, Phổi Trung ương…đã phát hiện những siêu vi khuẩn kháng tất cả các loại kháng sinh và đã có những bệnh nhân tử vong vì không còn thuốc chữa trị Tuy nhiên, việc người dân tự mua thuốc điều trị cũng bắt nguồn từ những bất cập của hệ thống y tế Theo nghiên cứu tại nhiều bệnh viện cho thấy, có tới 90% đơn thuốc hiện nay có sai sót, trong đó những đơn được bác sĩ kê với nhiều loại thuốc cùng một công dụng, cùng một biệt dược, chỉ khác tên gọi Điều này khiến vi khuẩn càng thêm nhờn thuốc, nhất là khi không tiến hành làm kháng sinh đồ…Tại bệnh viện Bạch Mai từ ngày 1/1/2013 – 31/1/2017 tại khoa vi sinh đã nghiên cứu tiến hành trên 487 bệnh nhân đái tháo đường có bệnh phẩm nhiễm trùng da và mô mềm dương tính với vi khuẩn Tỉ lệ vi khuẩn gram âm chiếm 55,7% Tỉ lệ phân lập được đa tác nhân là 14,7%

Tác nhân hàng đầu phân lập được là S aureus (34,2%) Tỉ lệ MRSA là 53,7% và tất cả các chủng S aureus còn nhạy vancomycin (Vũ Ngọc Hiếu và cs., 2017) Tại các khoa

hồi sức tích cực, vấn đề này còn nan giải hơn, do nơi đây tập trung những bệnh nhân

nặng nhất, qua nhiều khoa điều trị Tại các tỉnh phía Nam, tỉ lệ E coli (vi khuẩn đường ruột) kháng kháng sinh lên tới 74,6%, tỉ lệ kháng của vi khuẩn gây nhiễm trùng K pneumoniae lên tới gần 60%, vi khuẩn A baumannii (gây nhiễm khuẩn bệnh viện) có tỉ

lệ kháng với hầu hết các loại kháng sinh ở mức trên 90% Với nhóm kháng sinh carbapenem, nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay cũng có tỉ lệ lên tới 50%, đặc biệt là

các vi khuẩn gram âm mang gen kháng thuốc như β-lactam (Lương Ngọc Khuê, 2017)

Trong khi đó, tốc độ tìm ra kháng sinh mới trên thế giới không kịp so với mức độ gia tăng của các vi khuẩn kháng kháng sinh (Nguyễn Thị Kim Tiến, 2017)

Hiện nay, MRSA kháng giống nhau đối với tất cả các penicillin hiện hành và các

β-lactam khác Nhiễm trùng do vi khuẩn này đang có khuynh hướng xảy ra phổ biến

hơn ở người trẻ, khỏe mạnh và gây bệnh chủ yếu ở da Trong đó, tỷ lệ kháng với nhóm carbapenem với 2 đại diện imipenem và meropenem lần lượt là: 76,5% và 81,3% Nhóm cephalosporin kháng trên 80%, trong đó kháng 83,9% với cefepim, 86,7% với ceftazidin, 88% với cefotaxim, 93,1% với ceftriaxone (Berven S H., 2013)

Vancomycin là thuốc được đưa vào điều trị MRSA tại ICU Dữ liệu gần đây cho thấy sự gia tăng kháng thuốc vancomycin về lâm sàng khi dùng vancomycin đã

khiến cho vai trò của nó không còn nữa (Tervdek, 2016) Đứng trước tình hình S aureus kháng với penicillin do gần 100% có khả năng tiết được enzyme penicillinase

phá hủy được penicillin, các nhà lâm sàng phải chỉ định penicillin M để điều trị các

nhiễm khuẩn do S aureus Tuy nhiên, hiện nay các bác sĩ điều trị phải đối phó với thách thức là tác nhân S aureus kháng được penicillin M (MRSA) với tỷ lệ ngày càng

tăng cao (Tervdek, 2016)

Tổng kết của GRAP-VN cho thấy tỷ lệ MRSA ghi nhận từ 15 bệnh viện tại Việt Nam vào năm 2008 là từ 30% đến 64% Bệnh viện Thống Nhất tại TP Hồ Chí Minh từ

năm 2005 đến 2007 đã ghi nhận có đến 40% Staphlylococcus aureus phân lập từ

nhiễm đường tiết niệu kháng methicillin ( Bộ y tế và GRAP- VS, 2009) Tình hình này cho thấy chúng ta đang phải đối diện với một thử thách mới, không phải do xuất hiện

đề kháng Vancomycin mà là do MIC của vancomycin đối với Staphlylococcus aureus

bị tăng vượt quá 1.5 / gây thất bại điều trị vancomycin trên lâm sàng Thách thức này hiện nay đã được ghi nhận tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viên Chợ Rẫy với ghi nhận 46% các chủng MRSA có MIC của vancomycin ≥ 2 / và 93% có MIC ≥ 1.5 / Sự kháng thuốc đối với các loại thuốc đầu tiên để điều trị các nhiễm trùng

gây ra bởi Staphlylococcus aureus - một nguyên nhân phổ biến gây nhiễm trùng nặng ở

các cơ sở y tế và cộng đồng - rất phổ biến Những người bị nhiễm MRSA

(Staphylococcus aureus kháng Methicillin ) được ước tính là có khả năng chết hơn

64% so với những người có biểu hiện nhiễm trùng không kháng thuốc (WHO, 2017) Tại một hội nghị của Bộ Y tế về kháng thuốc cuối tháng 9/2017, tình trạng kháng thuốc ngày càng trầm trọng và là mối nguy đe doạ sức khoẻ toàn cầu Tình trạng kháng thuốc kháng sinh gây tác động lớn đến nền kinh tế, sự phát triển chung của xã hội Không chỉ riêng đối với Việt Nam nó còn tác động đến tất cả các nước trên thế giới, đặc biệt là trong thời đại toàn cầu hoá hiện nay (Thùy Linh, 2017)

Tỉ lệ kháng kháng sinh của S aureus khác nhau giữa các bệnh viện: có tới 68,8%

các chủng phân lập tại bệnh viện Chợ Rẫy kháng với Gentamicin Tỉ lệ kháng Oxacillin cao nhất tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế với 63,8% Theo báo cáo

của Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2008, có 8% số chủng S aureus phân lập được đề kháng

với vancomycin Tuy nhiên, đến năm 2009, phần lớn các bệnh viện kể cả Chợ Rẫy

không có chủng S aureus nào đề kháng với vancomycin trừ một số bệnh viện tỉnh và

bệnh viện trực thuộc Sở y tế cho kết quả đáng nghi ngờ về tỉ lệ kháng vancomycin của

tụ cầu vàng, ví dụ như 60,9% S aureus kháng vancomycin tại bệnh viện Uông Bí,

24,1% tại bệnh viện Bình Định và 15,6% tại bệnh viện Xanh Pôn (Tverdek và cs, 2008)

1.2 Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)

1.2.1 Phân loại khoa học

Giới Plantae

Ngành: Angiospermae

Lớp: Monocots

Bộ: Asparagales

Họ: Iridaceae (họ La dơn)

Chi: Eleutherine

Loài: Eleutherine subaphylla Gagnep

Tên khoa học: Eleutherine subaphylla Gagnep

Tên đồng nghĩa: Eleutherine bulbosa (Mill.) Urban, E longifolia Gagnep

Còn gọi là: tỏi lào, sâm cau, sâm đại hành, hành lào (Hòa Bình), tỏi mọi, kiệu đỏ, co nhọt (Lào), phong nhan, hom búa lượt (Thái)

Người ta dùng củ tươi hay phơi hoặc sấy khô của cây sâm đại hành làm thuốc

với tên khoa học Bul-bus Eleutherinis subaphyllae (Đỗ Tất Lợi, 2006)

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Sâm đại hành là một loại cỏ sống lâu năm, cao từ 30-60 cm, dò (củ) hình trứng

dài 4-5 cm, đường kính 2-3 cm giống như củ hành nhưng dài hơn, ngoài phủ vảy màu đỏ nâu, phía trong màu nâu hồng đến đỏ nâu Lá hình mác, gân lá song song, chạy dọc, trông giống như lá cau non, củ lại có tác dụng bổ cho nên gọi là Sâm cau (lá như lá cau, bổ như sâm), lá có thể dài 40-50 cm, rộng 3-5 cm Từ củ mọc lên một cán mang

Hình 1.2 Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)

hoa dài 30-40 cm, trên cán có một lá đài 15-25 cm, hoa mọc thành chùm 3 lá đài, 3 cánh tràng màu trắng hay vàng nhạt, 3 nhị màu vàng Bầu hình trứng, 3 cạnh 3 ngăn dài 1 mm, vòi dài 2,5 mm trên xẻ thành 3 trông như 3 mũi dùi (Đỗ Tất Lợi, 2006)

1.2.3 Phân bố, thu hái và chế biến

Ở Việt Nam, sâm đại hành mọc hoang và được trồng lấy củ làm thuốc tại nhiều

nơi như Hà Tây cũ, Hòa Bình, Nghĩa Lộ, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Đà Nẵng, Hà Nội Trồng sâm đại hành rất đơn giản: chỉ việc dùng củ vùi xuống đất như trồng hành, tỏi Khi thu hoạch, đào lấy củ về, rửa sạch, bóc lớp vỏ bên ngoài, thái mỏng, dùng tươi hoặc phơi hay sấy khô, rồi để nguyên hay tán bột mà dùng Bên cạnh đó sâm đại hành cũng được sử dụng trong dân gian để trị thiếu máu, vàng da, hoa mắt, choáng váng, nhức đầu, mệt mỏi, băng huyết, ho ra máu Nấu thành cao rồi luyện viên uống sát trùng, chữa chàm, chốc và bệnh ngoài da Sâm đại hành đã phơi khô, sao qua, hãm uống làm thuốc an thần gây ngủ, bột dùng để cầm máu, dùng uống trị ho, ho lao, thường phối hợp với Rẻ quạt làm thuốc trị ho, viêm họng

Mùa hoa: tháng 4 - 6 Quả ít gặp

Khi thu hoạch, đào lấy củ về, rửa sạch, bóc lớp vỏ bên ngoài, thái mỏng dùng tươi hoặc phơi hay sấy khô, rồi để nguyên hay tán bột mà dùng Nó có vị đắng, mùi hơi hắc (Đỗ Tất Lợi, 2006)

Năm 1975, Bianchi và cs đã phân lập từ củ của cây sâm đại hành hai hợp chất là eleutherin và eleutherol (Bianchi và cs., 1975)

Năm 1982, từ củ Sâm đại hành người ta đã phân lập được một anthraquinon mới là anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester (Weniger B và cs., 1982)

Hình 1.4 Công thức hóa học của eleutherol và diol-4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester

anthracene-9,10-dione-1,5-Năm 1985, nghiên cứu của William và Harborne đã phân lập được xanthone mangiferin và isomangiferin từ lá của sâm đại hành (William và Harborne, 1985)

Hình 1.5 Công thức hóa học của mangiferin và isomangiferin

Năm 2003, Helmut Kloos và cs đã công bố kết quả phân lập được hợp chất eleutherinone cũng từ thân rễ của cây sâm đại hành (Helmut Kloos và cs., 2003)

Theo một công bố mới và đầy đủ nhất năm 2010 về thành phần hóa học của cây sâm đại hành, 4 hợp chất polyketit mới được phân lập gồm (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside và isoeleuthoside C (dihydroisoeleutherin-5-O-D-gentiobioside) cùng với các chất đã được phân lập trước đó gồm eleutherin, isoeleutherin, eleutherinol, eleutherol, eleuthoside B (eleutherol-4-O-D-gentiobioside), eleuthoside C (dihydroeleutherin-5-O-Dgentiobioside), elecanacin và hongconin (4-oxodihydroisoeleutherin) (Francesca và cs., 2010)

Hình 1.7 Công thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B,

eleuthoside C, elecanacin và hongconin

Ở Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học của loài sâm đại hành, ngoài công bố phân lập được 4 hợp chất là eleutherin C16H16O4 độ chảy 175o,

izoeleutherin C16H16O4 độ chảy 177o, eleutherola C14H12O4 độ chảy 202-203o và một chất chưa xác định được đặt tên là Ex của Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn Sắc ký lớp mỏng của dịch chiết còn cho biết có 16 vết trong đó 9 vết màu vàng đậm nhạt khác nhau, 6 vết phát quang lơ và một vết màu hồng nhạt Cả 3 hoạt chất đều có tác dụng

kháng sinh đối với chủng S aureus (Lê Văn Hồng và NguyễnVăn Đàn, 1978)

Như vậy, trên thế giới đã có các nghiên cứu về cây sâm đại hành từ rất sớm Các nghiên cứu cho thấy thành phần hoá học chủ yếu của sâm đại hành là các hợp chất quinone và dẫn xuất

1.2.5 Tác dụng dược lý

Tác dụng kháng sinh: dịch chiết sâm đại hành tẩm giấy có đường kính 10 mm đặt

trên thạch có cấy vi trùng có tác dụng hạn chế sinh sản của vi trùng Diplococcus pneumoniae, Strepcoccus hemolyticus, S aureus Tác dụng yếu hơn đối với Shigella flexneri, Shiga, Bacillus mycoides, B anthracis Không có tác dụng đối với E coli, Bacillus pyocyaneus, Bacillus diphteriae Tác dụng chống viêm: làm giảm phản ứng

phù thực nghiệm trên chuột (thí nghiệm so sánh với hydrococtison thấy gần như tương tự) Trên lâm sàng thấy có tác dụng tốt đối với chốc đầu trẻ em, nhọt đầu đinh, viêm da mủ, viêm họng cấp và mãn tính, chàm nhiễm trùng, tổ đỉa, vẩy nến…

Độc tính: chuột nhắt uống với liều 169 g/kg (1 lần), thỏ uống 26 g/kg/ngày (uống liền 3 ngày) không biểu hiện nhiễm độc, động vật sống bình thường Cho thỏ uống với liều 10 g/kg/ngày, liền trong 30 ngày, con vật khỏe mạnh bình thường, giải phẫu không thấy tổn thương gan hay thận (Đỗ Tất Lợi, 2006) Sâm đại hành còn được một số nước trên thế giới sử dụng làm thuốc diệt giun sán, thuốc chữa các bệnh về kinh nguyệt, các bệnh rối loạn hay nhiễm khuẩn đường ruột và làm thuốc chống sinh sản quá nhanh và đẻ non (Sompol Paramapojna và cs., 2008) Ở một số nơi tại Brazin, lá và củ của sâm đại hành được dùng làm thuốc xổ và điều trị ung thư

1.2.6 Công dụng

Sâm đại hành được dùng làm: thuốc bổ máu chữa thiếu máu, vàng da, xanh xao, hoa mắt, choáng váng, nhức đầu, mệt mỏi

Thuốc cầm máu dùng trong băng huyết, ho ra máu, bị thương chảy máu (dùng củ tươi, giã đắp) Còn dùng chữa ho gà, viêm họng, mụn nhọt, chốc lở

Ở Indonesia, rễ sâm đại hành được dùng theo kinh nghiệm dân gian làm thuốc lợi tiểu, trị lỵ, viêm và sa trực tràng Ở Philippines, người dân dùng rễ củ giã nát đắp lên vết cắn của cá độc, để nhổ gai ở chân, và đắp vào vết đốt của sâu bọ, vết thương, nhọt Rễ củ nướng, giã nát, xát vào bụng chữa đau bụng Ở Peru, thổ dân vùng Amazon dùng sâm đại hành trị rối loạn tiêu hóa và bệnh ngoài da Ở vùng trung Haiti, rễ sâm đại hành trị vô kinh dưới dạng thuốc sắc hoặc ngâm rượu uống

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

Các chiết xuất dichloromethane từ sâm đại hành: eleutherinone, eleutherin,

isoeleutherin, và eleutherol cũng đã được chứng minh chống lại Cladosporium sphaerospermum Tất cả các hợp chất cô lập được đều cho thấy các hoạt tính kháng

nấm mạnh mẽ trừ eleutherol (Alves và cs., 2003)

Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy khả năng kháng của cao chiết thô từ sâm

đại hành đối với Streptococcus pyogenes (Limsuwan và cs., 2008) Ngoài ra, chiết xuất thô từ sâm đại hành còn có hoạt tính ức chế đối với enzym lipase và protease in vitro, hoạt tính chống enterotoxin cả in vitro và in vivo (Ifesan và Voravuthikunchai, 2009)

Một số phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết sâm đại hành đã được chứng minh ức chế

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus thu được từ thực phẩm (Voravuthikunchai

và cs., 2008; Ifesan và cs., 2009) Các hợp chất có hoạt tính: eleutherol, eleutherin, và isoeleutherin từ sâm đại hành cho thấy các hoạt tính sinh học kháng nấm và tăng cường tuần hoàn máu ở động mạch vành (Zhengxiong và cs., 1986)

Dựa theo báo cáo năm 2009 của Ifesan thì đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến sâm đại hành: sâm đại hành là một cây thảo dược được sử dụng trong ẩm thực châu Á như một phụ gia thực phẩm trong chế biến dầu trộn salad (Ifesan và cs., 2009) Sâm đại hành có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Mỹ, củ màu đỏ thuôn dài đã được người dân địa phương sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị bệnh tim mạch, đặc biệt là rối loạn mạch vành (Ding và Huang, 1983) Ngoài ra, sâm đại hành còn được sử dụng như

một thuốc truyền thống để tống hơi trong ruột ra Củ sâm đại hành kết hợp với riềng để điều trị tình trạng cảm lạnh và tắc nghẽn mũi ở trẻ em (Saralamp và cs., 1996)

Sirirak và cộng sự (2011) đã báo cáo sâm đại hành là một ứng cử viên cho việc

kiểm soát loài Campylobacter Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol của cây sâm đại hành chống lại Campylobacter spp đã được nghiên cứu Sáu mươi lăm chủng Campylobacter, bao gồm 39 chủng phân lập từ người và 26 chủng phân lập từ gà đã

được thử nghiệm Các chiết xuất ethanol của củ sâm đại hành chứng minh hoạt tính kháng khuẩn chống lại tất cả các chủng thử nghiệm Các vùng ức chế dao động trong khoảng 10-37 mm (Sirirak và cs, 2011)

Subramaniam và cộng sự (2012) tiến hành xác định thành phần hóa học của củ sâm đại hành đã tìm thấy sự hiện diện của phenol, sterol, phlobatannins, protein, steroids, tannin và đường Chiết xuất ethanol của củ sâm đại hành đã được thử nghiệm chống lại mầm bệnh kháng đa thuốc và cho thấy đó là một nguồn tiềm năng của tác

nhân kháng khuẩn chống lại Methicillin resistant Staphylococcus aureus và Acinetobacter baumannii, với hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với thuốc kháng sinh

tiêu chuẩn (Subramaniam và cs, 2012)

Fitri và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng ức chế chu kỳ tế bào và thúc đẩy sự chết theo chương trình của chiết xuất sâm đại hành trên tế bào ung thư vú Kết quả kiểm tra gây độc tế bào trong điều trị với tế bào T47D (tế bào T47D là một dạng của các tế bào ung thư vú đã bị đột biến p53 có khả năng kháng với cơ chế chết theo chương trình−cơ chế sinh lý của tế bào cắt giảm để sửa chữa các mô và để xử lý các tế bào bị hư hỏng mà có thể nguy hiểm cho cơ thể) Các chiết xuất n-hexane, ethyl acetat và chiết xuất ethanol của sâm đại hành cho các giá trị IC50 (nồng độ gây chết 50 % tế bào) tương ứng là 265,023 µg/ mL, 147,124 µg/ mL và 3782,29 µg/ mL Đối với chu kỳ tế bào, kết quả là ức chế chu kỳ tế bào trên phase G0-G1 với một tỷ lệ 40,88 % (Fitri và cs, 2014)

Năm 2018, Harlita và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của

Eleutherine palmifolia L (Merr) đối với vi khuẩn gây bệnh kết quả từ thử nghiệm hoạt

tính kháng khuẩn chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ n - hexane, ethyl acetate và ethanol 96% ức chế tích cực sự tăng trưởng của MRSA , B cereus, Shigella spp., và P aeruginosa Các loại chiết xuất và nồng độ khác nhau có các hoạt động ức chế khác

nhau Do đó, nồng độ của chiết xuất được sử dụng càng cao thì hoạt tính ức chế càng cao (Harlita và cs, 2018)

Tại Việt Nam theo Đỗ Tất Lợi (2006), sâm đại hành (Eleutherine subaphylla

Gagnep.) có tác dụng kháng sinh, chống viêm,…đã được sử dụng phổ biến trong dân gian.

Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu đã nghiên cứu về sự thuần chủng và tính kháng khuẩn của sâm đại hành kết quả cho thấy sâm đại hành không thuần chủng, được chia làm 11 dòng, tính kháng khuẩn của các dòng trên vi khuẩn được thử nghiệm có sự khác

nhau, nhưng tất cả đều tác động rất tốt trên S aureus (MIC = 256-512 µg/ml), kế đến S faecalis (MIC = 512-1024 µg/ml), yếu hơn trên P aeruginosa và Aeromonas hydrophila (MIC = 2048-4096 µg/ml), kháng khuẩn yếu nhất trên E coli và Salmonella spp (MIC = 4096 µg/ml)

Nghiên cứu về hợp chất eleutherine trong sâm đại hành Việt Nam (Eleutherine supbaphylla Gagnep.) của tác giả Trương Minh Lương và Trần Văn Huy (2012) đã xác

định cấu trúc, mô tả tính chất vật lý và tổng hợp các dẫn xuất của eleutherine Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự (2013) đã nghiên cứu quy trình tách chiết hợp chất

eleutherin và isoeleutherin từ củ sâm đại hành (Eleutherine bulbosa), đánh giá tác dụng

kháng sinh của chúng trên động vật thực nghiệm Kết quả đã phân lập được 10 hợp chất sạch và xây dựng được quy trình phân lập hỗn hợp eleutherin và isoeleutherin quy mô pilot, đồng thời đánh giá được chế phẩm từ củ có tác dụng kháng khuẩn mạnh ở các

mức nồng độ thấp trên những chủng vi khuẩn đã thử là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), Bacillus subtilis, Shigella flexneri DT 112, Proteus mirabilis BV 108 và Bacillus pumilus

1.4 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu 1.4.1 Khái niệm

Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được tinh chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ cao dược liệu thực vật hay động vật với dung môi thực vật Các dược liệu khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp)

Cao dược liệu được chia thành ba loại:

Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trò dung môi chính Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 mL cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế

Cao đặc: là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi còn lại trong cao không quá 20%

Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng Trong thực nghiệm việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn - lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method),… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)

Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép không rỉ có nắp đậy Rót dung môi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp tục rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý tránh nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Phương pháp làm ở nhiệt độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung môi và thời gian chiết (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.3 Phương pháp chiết lỏng - lỏng

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung

môi phân cực thí dụ như: ester dầu hỏa và n-hexane, ether ethyl, chloroform, ethyl

acetate, butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction) Cao alcol thô ban đầu (ví dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu

được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (ví dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (ví dụ ester dầu hỏa ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (ví dụ các alcol béo, ester béo ), dung môi phân cực trung bình ( ví dụ dietyl ester, chlorofrom ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp chất có chứa nhóm chức ester –O–, aldehyd –CH=O, ceton –CO–, ester –COO– ) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ methanol ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH ) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.4.4 Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao dược liệu, thường phải tiến hành bốc hơi dung môi Có thể dùng nhiều thiết bị cô, sấy khác nhau, nhưng tốt nhất là tiến hành ở áp suất giảm và ở nhiệt độ cao cho sự phân hủy hoạt chất là tối thiểu (thường không quá 600

C) Tránh cô hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ cao (Từ Minh Koóng, 2007)

Cao dược liệu phải đạt các chỉ tiêu chất lượng cao thuốc được quy định trong dược điển Việt Nam IV năm 2009:

- Cảm quan: cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định; có mùi, vị của dược liệu tương ứng,

- Độ tan: cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao - Mất khối lượng do làm khô: thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%

- Các chỉ tiêu khác: độ nhiễm khuẩn, giới hạn thuốc bảo vệ thực vật, kim loại nặng, chất bảo quản, định tính, định lượng

- Các chế phẩm có chứa các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật, động vật không thể xử lý theo quy trình làm giảm lượng vi khuẩn: tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được

không quá 5 x 104 CFU/ g (CFU/mL), nấm và mốc không quá 500 trong 1 g (mL),

không được có Salmonella trong 10g (mL), mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus trong 1 g (mL), tổng số

enterobacteria không quá 500 trong 1 g (mL)

1.4.5 Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 – 0,063 mm (240-430 mesh) Silica gel pha đảo RP-18 F254 (Merck 5559; 0,2 mm) hoặc YMC có cỡ hạt là 30-50 µm (Fujisilisa Chemical Ltd.)

Từ cao chiết có hoạt tính mạnh nhất tiến hành sắc ký cột pha thường, kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để chia ra nhiều phân đoạn nhỏ có hệ dung môi rửa giải khác nhau

- Chuẩn bị cột

• Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô cột

• Cho một ít bông gòn ở đáy cột (ngay phía dưới vòi nhỏ giọt) để silica gel không chảy ra ngoài

• Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung môi ít phân cực và trộn đều

• Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung môi, mở cột cho dung môi nhỏ giọt để ổn định cột

− Điểm nóng chảy: Điểm nóng chảy được đo trên máy BOTIUS (Heiztisch

Mikroskop) của Đức

− Phổ khối lượng:

+ Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT

1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

+ Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Agilent 6530

Accurate-Mass Q-TOF LC/MS của Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc − Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo

trên máy Avance 500, 1H- (500 MHz)và 13C- (125 MHz) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu củ cây sâm đại hành được thu mua ở Đồng Tháp được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Chủng S aureus ATCC 43300 (MRSA) được cung cấp bởi công ty Nam Khoa

tán giếng thạch

Xác định nồng độ ức chế tối

thiểu MIC Cô thành cao dược

liệu

Định danh tên khoa học

Chạy cột sắc ký thu phân đoạn

Xác định cấu trúc của các hợp chất thu được Khảo sát khả năng kháng MRSA của các

phân đoạn bằng phương pháp khuếch

tán giếng thạch

Chọn phân đoạn kháng MRSA tốt nhất

tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận chất

2.3 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết

Mục đích: xác định loại dung môi thích hợp cho hiệu suất cao

Yếu tố khảo sát bao gồm: dung môi trích ly gồm n-hexane, ethanol 96o, ethyl acetate và nước

Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:5, nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 72 giờ

chiết lỏng - lỏng qua các hệ dung môi n-hexane, ethyl acetate và nước Sau khi chiết

lỏng - lỏng dịch chiết được cô đặc thành cao bằng phương pháp tương tự như trên Đem cân các cao phân đoạn này bằng cân phân tích (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức: H (%) = A/B x 100