nghiên cứu khảo sát các hợp chất alkaloid có trong lá trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l có hoạt tính sinh học ứng dụng trong y học

^0^---PHÙNG VÃN BẢONGHIÊN CỨU KHẢO SÁT CÁC HỢP CHẤT ALKALOID CÓ TRONG LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG CRINUM LATIFOLIUM L.. Nguyễn Minh Hoàng Học viên thực hiện: Phùng Văn Bảo Lớp: DH16YD01 Ngày

Ị NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT CÁC HỢP CHAT

ALKALOID CÓ TRONG LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(CRINUM LATIFOLIUM L.) CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

^0^ -PHÙNG VÃN BẢO

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT CÁC HỢP CHẤT

ALKALOID CÓ TRONG LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG (CRINUM LATIFOLIUM L.) CÓ HOẠT TÍNH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Phùng Văn Bảo

Ngày sinh: 26 – 01 - 1998 Nơi sinh: Phú Yên

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã sinh viên: 1653010025

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

(Ghi rõ họ và tên)

Phùng Văn Bảo

CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Minh Hoàng

Học viên thực hiện: Phùng Văn Bảo Lớp: DH16YD01

Ngày sinh: 26 – 01 - 1998 Nơi sinh: Phú Yên

Tên đề tài: Nghiên cứu khảo sát các hợp chất alkaloid có trong lá Trinh nữ hoàng

cung (Crinum latifolium L.) có hoạt tính sinh học ứng dụng trong y học.

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước

LỜI CẢM ƠN

Trên con đường đời của mỗi chúng ta, để đến được với thành công không chỉ ngoài sự cố gắng của bản thân mà sự thành công nào cũng đều có sự hỗ trợ, giúp đỡ của những người xung quanh cho dù sự giúp đỡ hay hỗ trợ đó là ít hay nhiều, gián hay trực tiếp Trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo, giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè xung quanh

Em xin cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức vô cùng quý giá trong suốt 4 năm em học tập tại đây Với kiến thức được tiếp thu trong quá trình học tập không chỉ là nền tảng cho quá trình thực hiện đề tài báo cáo khóa luận mà còn là hành trang để em bước vào đời một cách vững chắc và đầy tự tin

Em xin chân thành cảm ơn đến Th.S Nguyễn Minh Hoàng đã tận tâm, chỉ bảo, hướng dẫn em qua từng buổi nói chuyện, thảo luận về đề tài nghiên cứu Nhờ có những lời hướng dẫn, dạy bảo đó, mà em đã hoàn thành đề tài một cách tốt nhất Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn đến thầy

Em cũng xin cảm ơn các bạn và các em thực tập tại phòng thí nghiệm Hóa - Môi trường trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn đến bố mẹ và anh chị trong gia đình đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài để em có thể hoàn thành tốt nhất

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực hiện

Phùng Văn Bảo

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 8

1.3 Phương pháp chiết xuất hợp chất tự nhiên 9

2.1.2 Dung môi và hóa chất 12

2.2 Trang thiết bị nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Phương pháp chiết xuất 13

2.3.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng 22

2.3.3 Phương pháp sắc ký cột 23

2.3.4 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát quy trình chiết xuất cao cồn bằng phương pháp ngâm 26

3.1.1 Kết quả khảo sát nồng độ ngâm chiết 26

3.1.2 Kết quả khảo sát thời gian ngâm chiết 27

3.1.3 Kết quả khảo sát tỉ lệ ngâm chiết 28

3.2 Kết quả khảo sát quy trình chiết xuất cao cồn bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 29

3.2.1 Kết quả khảo sát nồng độ đun khuấy từ hồi lưu 29

3.2.2 Kết quả khảo sát thời gian đun khuấy từ hồi lưu 31

3.2.3 Kết quả khảo sát tỉ lệ đun khuấy từ hồi lưu 32

3.3 Kết quả so sánh 2 phương pháp ngâm và đun khuấy từ hồi lưu 33

3.4 Kết quả sắc ký bản mỏng 34

3.5 Kết quả sắc ký cột 36

3.6 Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 39

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU KHAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Trinh nữ hoàng cung 3

Hình 1.2 Công thức hóa học của các hợp chất alkaloid từ lá Trinh nữ hoàng cung 6

Hình 1.3 Công thức hóa học của các hợp chất flavonoid từ lá Trinh nữ hoàng cung 7

Hình 2.1 Cân kỹ thuật Ohaus PA1402 (trái) và cân phân tích Shimadzu ATX 224 (phải) 13

Hình 2.2 Quy trình chiết hoạt chất từ lá Trinh nữ hoàng cung 14

Hình 2.3 Bộ thu hồi dung môi 15

Hình 2.4 Sơ đồ khảo sát nồng độ, thời gian và tỉ lệ ngâm chiết 17

Hình 2.5 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 18

Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát nồng độ, thời gian và tỉ lệ đun khuấy từ hồi lưu 20

Hình 2.7 Chiết lỏng – lỏng giữa dịch acid và ethyl axetate 21

Hình 2.8 Chiết lỏng – lỏng giữa dịch acid đã kiềm hóa và chloroform 22

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát nồng độ ethanol ngâm chiết 26

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian ngâm chiết 27

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tỉ lệ dược liệu : ethanol ngâm chiết 28

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát nồng độ ethanol đun khuấy từ hồi lưu 30

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát thời gian đun khuấy từ hồi lưu 31

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ dược liệu : ethanol đun khuấy từ hồi lưu 32

Bảng 3.7 Kết quả các phân đoạn sắc ký cột từ cao alkaloid có trong lá Trinh nữ hoàng cung 37

Bảng 3.8 Kết quả các phân đoạn sắc ký cột từ cao alkaloid TNHC 3 38

Bảng 3.9 Kết quả số liệu phổ 1H và 13C 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, ung thư đã trở thành một trong các nhân tố chính đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe con người Theo thống kê của WHO, số ca bị ung thư tại Việt Nam không ngừng tăng lên Năm 2018, số ca bị bệnh tăng lên gần 165.000 ca/96,5 triệu dân, trong đó gần 70% trường hợp tử vong, tương đương 115.000 ca (Nguyễn Thủy, 2018)

Nhiều hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng kháng ung thư đã được ghi nhận Tuy nhiên, việc xác định và nghiên cứu các hoạt chất từ các nguồn tự nhiên khác nhau nhằm khai thác tiềm năng hiện có, tăng tính hiệu quả, an toàn vẫn đang là định hướng được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm Một trong những nguồn dược liệu được chú ý gần đây cho vai trò hỗ trợ điều trị ung thư là Trinh nữ hoàng cung

Theo y học cổ truyền, Trinh nữ hoàng cung được sử dụng điều trị một số bệnh như ho, dị ứng, đau khớp, viêm da, mụn nhọt, rắn cắn (Đỗ Tất Lợi, 2007)

Theo y học hiện đại, các hợp chất alkaloid và flavonoid tinh khiết được phân lập từ Trinh nữ hoàng cung như crinamine và haemanthamine có hiệu quả trong thử nghiệm gây chết tế bào ung thư (McNulty et al, 2007); Đại diện là lycorine như lycorine hydrochloride ngăn chặn một cách chọn lọc và đồng thời sự phát triển của tế bào ung thư buồng trứng dòng Hey1B (Cao et al, 2013); Astragalin thể hiện hoạt tính kháng viêm gây ra bởi lipopolysaccharid trên phổi chuột Ngoài ra, astragalin còn có tác động chống lại gốc tự do gây tán huyết trên tế bào hồng cầu người (Soromou et al, 2012); Kaempferol giúp cơ thể chống lại gốc tự do liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư và ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư (Allen et al, 2013)

Dược điển Việt Nam IV chưa có chuyên luận cây Trinh nữ hoàng cung Do đó, vấn đề quản lý và đảm bảo chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có thành phần Trinh nữ hoàng cung vẫn chưa được thực hiện một cách chặt chẽ Nguyên nhân chủ yếu là do thành phần hóa học của thân hành, lá và hoa từ dược liệu vẫn chưa được nghiên cứu toàn diện (Nguyễn Hữu Lạc Thủy, 2014)

Với mong muốn góp phần giải quyết các bất cập hiện tại, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu khảo sát các hợp chất alkaloid có trong lá Trinh nữ hoàng cung

(Crinum latifolium L.) có hoạt tính sinh học ứng dụng trong y học”

❖ Mục tiêu, đối tượng, phạm vi nghiên cứu

⮚ Mục tiêu nghiên cứu

✔ Chiết xuất alkaloid toàn phần, từ đó cô lập các hợp chất alkaloid tinh khiết ✔ Xác định cấu trúc các alkaloid cô lập được nhờ vào các phương pháp phổ NMR ⮚ Đối tượng – phạm vi nghiên cứu

✔ Nghiên cứu được thực hiện trên lá Trinh nữ hoàng cung

✔ Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa – Môi trường thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

✔ Thời gian thực hiện: (tháng 09 – 12 năm 2019) và (tháng 05 – 07 năm 2020)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về thực vật học

Trinh nữ hoàng cung hay còn gọi là náng lá rộng, tỏi lơi lá rộng, tây nam văn châu lan, tỏi Thái Lan, vạn châu lan, thập bát học sỹ hay hoàng cung trinh nữ

Trinh nữ hoàng cung có tên khoa học là Crinum latifolium L., là một loài thực

vật có hoa trong họ Amaryllidales

1.1.1 Vị trí phân loại

⮚ Giới: Plantae ⮚ Bộ: Asparagales ⮚ Họ: Amaryllidaceae

⮚ Trinh nữ hoàng cung là một loại cỏ, thân hành như củ hành tây to, đường kính 10 - 15 cm, bẹ lá úp nhau thành một thân giả dài khoảng 10 - 15 cm, có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80 - 100 cm, hai bên mép lá lượn sóng

⮚ Gân lá song song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím

⮚ Hoa mọc thành tán gồm 6 - 18 hoa, trên một cánh hoa dài 30 - 60 cm Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ, từ thân hành mọc rất nhiều củ con có thể tách ra để trồng riêng dễ dàng

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

⮚ Cây Trinh nữ hoàng cung được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào

⮚ Ở Việt Nam, cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh Miền Trung và Nam Trung Bộ ⮚ Là loại cây ưa ẩm, sáng hoặc một phần bóng mát Sinh trưởng và phát triển ở khí

hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới Mỗi năm cây cho 6 8 lá mới và đẻ thêm 3 5 hành con

-⮚ Cây ra hoa hàng năm vào khoảng tháng 6 - 8 Bộ phận dùng chủ yếu là lá và thân hành

1.1.4 Tác dụng dược lý

⮚ Theo y học dân gian: thân hành hoặc lá Trinh nữ hoàng cung được xào nóng hoặc giã đắp bên ngoài trong điều trị đau khớp, viêm da, mụn nhọt, rắn cắn, , dịch ép lá trị đau tai

⮚ Theo y học hiện đại: Trinh nữ hoàng cung còn có một số hoạt chất sinh học để làm thuốc trong điều trị một số bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư hầu họng, (Đỗ Tất Lợi, 2007; Cao et al, 2013; McNulty et al, 2007; Soromou et al, 2012)

Powelline

Hình 1.2 Công thức hóa học của các hợp chất alkaloid từ lá Trinh nữ hoàng cung

⮚ Các hợp chất flavonoid:

Astragalin

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

⮚ Vào năm 2000, nhóm tác giả Tôn Nữ Quỳnh Như và Võ Thị Bạch Huệ đã khảo sát sự biến đổi alkaloid trong lá thay đổi theo tháng, theo mùa, sự tập trung alkaloid trong các bộ phận khi cây chưa nở hoa cũng như lúc đã nở hoa Đặc biệt, nhóm tác giả đã xác định hàm lượng alkaloid toàn phần trong 100g cao cồn

Crinum latifolium L thu được 6–hydroxy crinamidin với hiệu suất 15 – 21% (Tôn

Nữ Quỳnh Như và Võ Thị Bạch Huệ, 2000)

⮚ Năm 2004, nhóm tác giả Mai Đình Trị và Nguyễn Công Hào đã cô lập được 4 hợp chất từ lá tươi cây Trinh nữ hoàng cung: E-p-hydroxycinnamat metyl, E-3,4-dihidro-xycinnamat etyl, kaempferol-3-O-β-D-gluco-pyranosit và kaemperol-3-4’-di-O-β-D-glyco-pyranosit và các cấu trúc hợp chất được xác định bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như: phổ MS, NMR 1H, 13C, IR (Mai Đình Trị và Nguyễn Công Hào, 2004)

⮚ Năm 2010, Nguyễn Nhật Thành và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học của Trinh nữ hoàng cung có các nhóm chất: triterpenoid, flavonoid, alkaloid, tannin, saponin, chất khử, acid hữu cơ và hợp chất polyuronid, trong đó các hợp chất ở nhóm triterpenoid và flavonoid tồn tại cả ở dạng tự do và dạng glycosid Kết quả

phân tích định tính, định lượng hai nhóm chất chính của hoa Trinh nữ hoàng cung bằng các kỹ thuật sắc ký nhóm flavonoid và alkaloid cho thấy thành phần hoạt chất trong mỗi nhóm cũng rất phong phú và khác nhau cả về thành phần và tỉ lệ hoạt chất trong từng bộ phận của cành hoa (Nguyễn Nhật Thành và cộng sự, 2010)

⮚ Năm 2014, Nguyễn Hữu Lạc Thủy đã cô lập một hợp chất tinh khiết mới (6 – ethoxyundulatin) từ cao phân đoạn alkaloid trong lá Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp SFE (chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn) Cấu trúc hợp chất được xác định bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như: phổ MS, NMR, IR (Nguyễn Hữu Lạc Thủy, 2014)

⮚ Năm 2018, Trần Thị Hồng Hạnh và cộng sự đã cô lập được 3 loại alkaloid mới thuộc khung crinane: 6-methoxyundulatine, 6-methoxycrinamidine và undulatine N-oxide Cấu trúc hợp chất được xác định bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như: phổ NMR, MS,…(Trần Thị Hồng Hạnh và cộng sự, 2018)

1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước ngoài

⮚ Năm 1983, Kobayashi và cộng sự đã xác định cấu trúc của các hợp chất từ Crinum

latifolium L như: lycorine, 1-O-acetyllycorine, crinine, powelline và crinamine

bằng phổ 1H-NMR, IR, MS (Kobayash et al, 1983)

⮚ Năm 2001, Zvetkova E và cộng sự đã khảo sát cao chiết Crinum latifolium L

bằng nước nóng có tác dụng kích thích sự sinh sản của tế bào lympho T trong thử nghiệm invitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi người Trong thử nghiệm invivo, tác dụng cũng tương tự: kích thích sự sinh sản hoạt hóa tế bào lympho T trong máu ngoại vi chuột (Zvetkova et al, 2001)

⮚ Năm 2018, Ming – Xin Chen và cộng sự đã cô lập 4 hợp chất mới, 1 alkaloid cũ: 4,8-dimethoxy-cripowellin C; 4,8-dimethoxy-cripowellin D; 9-methoxy-cripowellin B; 4-methoxy-8hydroxy-cripowellin B; cripowellin C từ cao ethanol

95% của Crinum latifolium L và cấu trúc các hợp chất được xác định bằng các

phương pháp hóa lý hiện đại như: phổ MS, NMR 1H, 13C, IR Các hợp chất cô lập được có khả năng chống lại tế bào ung thư phổi, kháng khuẩn và chống viêm (Chen et al, 2018)

1.3 Phương pháp chiết xuất hợp chất tự nhiên

1.3.1 Phương pháp ngâm

⮚ Phương pháp ngâm là phương pháp đơn giản và được sử dụng phổ biến để tách chiết hợp chất tự nhiên Đây là phương pháp chiết xuất rắn – lỏng bằng cách cho dung môi (pha lỏng) xuyên thấu vào cấu trúc tế bào thực vật (pha rắn) và hòa tan các hợp chất tự nhiên

⮚ Sau khi chuẩn bị dược liệu, người ta đổ dung môi cho ngập dược liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (quy định riêng cho từng dược liệu), rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi)

❖ Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền (Từ Minh Koong, 2007)

1.3.2 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu là một biến thể của phương pháp ngâm chiết Hiệu quả của phương pháp này được tăng cao nhờ có sự khuấy trộn thường xuyên kết hợp với gia nhiệt trên máy khuấy Bên cạnh đó ống sinh hàn được lắp thêm để ngăn dung môi bay hơi Nên chiết theo kiểu chiết phân đoạn, chia lượng dung môi ra nhiều lần để chiết kiệt chất trong mẫu cây (Từ Minh Koong, 2007)

1.4 Phương pháp sắc ký bản mỏng

⮚ Phương pháp sắc ký bản mỏng chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên một nền phẳng

như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau, tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau

⮚ Ưu điểm của phương pháp này là sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích, quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau, ngoài ra còn có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.5 Phương pháp sắc ký cột

⮚ Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)

⮚ Trong sắc ký cột, pha tĩnh thường được nạp trong một cột làm bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có môt lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem đi đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly Pha tĩnh trong sắc ký cột là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

⮚ Dựa vào việc sử dụng kích thước hạt silica gel khác nhau làm pha tĩnh và áp suất người ta chia làm 3 loại sắc ký cột:

✔ Sắc ký cột thường: dùng cột thủy tinh chứa hạt silica gel kích cỡ 60 – 200 µm, áp suất khí quyển

✔ Sắc ký trung áp: kích cỡ hạt 40 – 63 µm, áp suất 75 – 600 psi

✔ Sắc ký cao áp: cột bằng thép không rỉ chứa hạt silica gel 3 – 10 µm, áp suất 500 – 3000 psi

⮚ Với những hỗn hợp cao chiết có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực hiện nhiều lần sắc ký cột

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Lá Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L được thu mua tại các tiệm thuốc Đông y

ở Hải Thượng Lãn Ông,Phường 10, Quận 5, Thành Phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Dung môi và hóa chất

⮚ Ethanol 96% (VN-Chemsol Co., Việt Nam) ⮚ Methanol (VN-Chemsol Co., Việt Nam)

⮚ Acid acetic (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc) ⮚ HCl (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc)

⮚ Chloroform (VN-Chemsol Co., Việt Nam) ⮚ Ethyl acetate (VN-Chemsol Co., Việt Nam) ⮚ NH3 (VN-Chemsol Co., Việt Nam)

⮚ Acetone (VN-Chemsol Co., Việt Nam) ⮚ Silica gel 60 F254 (Merck)

2.2 Trang thiết bị nghiên cứu

⮚ Bộ đun khuấy từ hồi lưu Isolab (bình cầu đáy bằng 1000 ml nhám 29/32, ống sinh hàn nhám 29/32, bếp khuấy từ)

⮚ Bộ thu hồi dung môi (bình cầu đáy tròn 1000 ml, ống sinh hàn thẳng, nhiệt kế, đầu chưng cất, nhánh thu dung môi và bếp đun bình cầu 1000 ml)

⮚ Bản nhôm 20 * 10 cm tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck) ⮚ Bình lóng 250 ml Isolab

Hình 2.1 Cân kỹ thuật Ohaus PA1402 (trái) và cân phân tích Shimadzu ATX 224 (phải)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất

Hình 2.2 Quy trình chiết hoạt chất từ lá Trinh nữ hoàng cung

Bột lá Trinh nữ hoàng cung

Lá Trinh nữ hoàng cung

Cao ethanol

Dịch chiết acid

Dịch acid

Dịch chloroform

Cao chloroform

Phân đoạn alkaloid

- Ngâm hoặc đun khuấy từ hồi lưu - Thu hồi dung môi

- Hòa tan với dung dịch HCl 1% - Lọc

Chiết ethyl acetate

- Kiềm hóa bằng NH3 (pH=9-10) - Chiết chloroform

Thu hồi dung môi

Dịch ethyl acetate

Cao ethyl acetate

Thu hồi dung môi

Phơi khô và xay nhỏ

Phân đoạn flavonoid

2.3.1.1 Chiết cao cồn bằng phương pháp ngâm

Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình thủy tinh Sau đó, cho ethanol ngập dược liệu khoảng 1 – 2 cm để khảo sát nồng độ ethanol, thời gian và tỉ lệ ngâm chiết (dược liệu : ethanol) tối ưu Sau quá trình chiết thô, gạn lấy phần trong, lọc; phần bã đem chiết thêm 2 lần Dịch chiết được thu hồi dung môi và thu nhận cao ethanol

Hình 2.3 Bộ thu hồi dung môi a Khảo sát nồng độ ngâm chiết

Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình thủy tinh Sau đó, cho ethanol (500, 700, 960) ngập dược liệu khoảng 1 - 2 cm và ngâm trong 24 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng Nồng độ tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo

b Khảo sát thời gian ngâm chiết

Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình thủy tinh Sau đó, cho ethanol 700 ngập dược liệu khoảng 1 - 2 cm và ngâm trong các thời gian là 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong

cao thô bằng sắc ký lớp mỏng Thời gian tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo

c Khảo sát tỉ lệ ngâm chiết

Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình thủy tinh Sau đó, cho ethanol 700 ngập dược liệu theo các thể tích khác nhau là 180 ml, 240 ml, 300 ml tương ứng với tỉ lệ dược liệu : ethanol 700 là 1 : 6, 1 : 8, 1 : 10 và tiến hành ngâm trong khoảng thời gian tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng

Hình 2.4 Sơ đồ khảo sát nồng độ, thời gian và tỉ lệ ngâm chiết

Bột lá Trinh nữ hoàng cung

Phơi khô và xay nhỏ

500 700 960 12 giờ 24 giờ 36 giờ 1 : 6 1 : 8 1 : 10 Lá Trinh nữ

hoàng cung

Dịch lọc

Cao ethanol

Thu hồi dung môi

Khảo sát các yếu tố ngâm chiết

2.3.1.2 Chiết cao cồn bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình cầu đáy bằng Sau đó, cho ethanol ngập dược liệu khoảng 1 - 2 cm và tiến hành đun khuấy từ hồi lưu để khảo sát nồng độ ethanol, thời gian và tỉ lệ chiết (dược liệu : ethanol) tối ưu Sau quá trình chiết thô, gạn lấy phần trong, lọc, bỏ bã Dịch chiết được thu hồi dung môi và thu nhận cao ethanol

Hình 2.5 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

a Khảo sát nồng độ đun khuấy từ hồi lưu

Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình cầu 1000 ml Sau đó, cho ethanol (500, 700, 960) ngập dược liệu khoảng 1 – 2 cm và tiến hành đun khuấy từ hồi lưu trong thời gian 4 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng Nồng độ tốt nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo

b Khảo sát thời gian đun khuấy từ hồi lưu

Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình cầu 1000 ml Sau đó, cho ethanol 700 ngập dược liệu khoảng 1 – 2 cm và tiến hành đun khuấy từ hồi lưu trong các thời gian là 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng Thời gian tốt nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo

c Khảo sát tỉ lệ đun khuấy từ hồi lưu

Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình cầu 1000 ml Sau đó, cho ethanol 700 ngập dược liệu theo các thể tích khác nhau là 180 ml, 240 ml, 300 ml tương ứng với tỉ lệ dược liệu : ethanol 700 là 1 : 6, 1 : 8, 1 : 10 và tiến hành đun khuấy từ hồi lưu trong khoảng thời gian phù hợp đã được khảo sát ở thí nghiệm trên Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng

Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát nồng độ, thời gian và tỉ lệ đun khuấy từ hồi lưu

2.3.1.3 Chiết phân đoạn flavonoid và alkaloid

a Chiết phân đoạn flavonoid

Cân chính xác 50 gam cao ethanol hòa tan với dung dịch acid hydrochloric 1% Tỷ lệ cao ethanol 700 : acid hydrochloric 1% (1 : 30), lọc lấy phần dịch Tiếp theo, cho dịch chiết vào bình lóng và chiết với dung môi ethyl acetate cho đến khi chiết kiệt hợp chất flavonoid, tỷ lệ dịch acid : ethyl acetate (1 : 5), thực hiện chiết 5 lần Gộp các dịch chiết ethyl acetate lại với nhau và thu hồi dung môi, thu được phân đoạn flavonoid thô

Bột lá Trinh nữ hoàng cung

Phơi khô và xay nhỏ

500 700 960 2 giờ 4 giờ 6 giờ 8 giờ 1 : 6 1 : 8 1 : 10 Lá Trinh nữ

hoàng cung

Dịch lọc

Cao ethanol

Thu hồi dung môi

Khảo sát các yếu tố đun khuấy từ hồi lưu

Hình 2.7 Chiết lỏng – lỏng giữa dịch acid và ethyl axetate b Chiết phân đoạn alkaloid

Lớp dịch acid sau khi chiết flavonoid được đem đi kiềm hóa bằng NH3 cho đến khi đạt độ pH = 9 – 10 Tiếp theo, cho dịch acid sau khi kiềm hóa vào bình lóng và chiết với dung môi chloroform theo tỉ lệ dịch acid đã kiềm hóa : chloroform (1 : 3) Thực hiện chiết 3 lần Gộp các dịch chiết chloroform lại với nhau và thu hồi dung môi, thu được phân đoạn alkaloid thô

Hình 2.8 Chiết lỏng – lỏng giữa dịch acid đã kiềm hóa và chloroform

⮚ Chuẩn bị mẫu: Hòa tan một lượng nhỏ cao phân đoạn alkaloid trong methanol ⮚ Khảo sát các hệ dung môi chạy sắc ký:

✔ Hệ 1: Chloroform : acetone tỉ lệ 9,5 : 0,5 (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) ✔ Hệ 2: Chloroform : acetone tỉ lệ 5 : 5

✔ Hệ 3: Chloroform : ethyl acetate tỉ lệ 8 : 2 ✔ Hệ 4: Chloroform : ethyl acetate tỉ lệ 7 : 3 ✔ Hệ 5: Chloroform : ethyl acetate tỉ lệ 6 : 4 ✔ Hệ 6: Chloroform : ethyl acetate tỉ lệ 5 : 5

✔ Hệ 7: Chloroform : ethyl acetate : methanol tỉ lệ 4,5 : 4,5 : 1 ✔ Hệ 8: Chloroform : ethyl acetate : methanol tỉ lệ 2 : 2 : 1

⮚ Mẫu sản phẩm alkaloid thu được được hòa tan trong methanol Chấm mẫu sản phẩm bằng ống vi quản lên trên bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254 Chiều dài chạy mẫu là 4 cm hoặc 8 cm tương ứng với chiều dài bản nhôm là 5 cm hoặc 10 cm Khai triển bằng hệ dung môi khảo sát Hiện hình bằng đèn UV tại bước sóng 254 nm và ghi nhận Rf hiện trên bản

Giá trị Rf = Khoảng di chuyển của chất (cm) Khoảng di chuyển của dung môi (cm)

✔ Pha tĩnh : Silica gel cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm, Merck

✔ Cột thủy tinh được rửa sạch, sấy khô, dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá đỡ ✔ Khối lượng mẫu nạp: 1,8 g cao phân đoạn alkaloid và khối lượng silica gel: 25g 2 Nhồi cột

✔ Chất hấp thu silica gel được nạp vào cột và nén chặt, chiều cao hấp thu là 28 cm ✔ Tiến hành ổn định cột bằng cách cho dung môi chảy qua cột cho đến khi thấy chất

hấp thu đồng nhất, vận tốc giải ly cột là 1 giọt/giây 3 Nạp mẫu

Nghiền mịn mẫu rồi trộn đều với silica gel theo tỉ lệ 1 : 1 về khối lượng Nạp hỗn hợp mẫu và silica gel vào cột Cho một lượng nhỏ dung môi giải ly lên đầu cột để rửa sạch thành cột do dung dịch mẫu bị dính lên Cho một lớp bông gòn đặt nhẹ lên mặt thoáng đầu trên của cột để bảo vệ mặt cột không bị xáo trộn

6 Thu hồi, kiểm tra và định lượng các phân đoạn

Thu các đoạn giải ly cột Sau đó, các phân đoạn được sắc ký bản mỏng để gom lại thành những phân đoạn lớn có thành phần giống nhau Từng phân đoạn lớn được tiến hành thu hồi dung môi để tách hợp chất tinh khiết có trong lá Trinh nữ hoàng cung