nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học của các chủng vi khuẩn tiềm năng đối với vi nấm gây bệnh thán thư trên cây nho vitis vinifera l

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN TIỀM NĂNG ĐỐI VỚI VI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY NHO Vitis vinifera L.. BÁO CÁO

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN TIỀM NĂNG ĐỐI VỚI VI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ

TRÊN CÂY NHO (Vitis vinifera L.)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP - MÔI TRƯỜNG

CBHD: ThS Nguyễn Văn Minh SVTH: Vũ Thị Thùy Linh MSSV: 1553010093

Khóa: 2015 - 2019

Bình Dương, tháng 5 năm 2019

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN TIỀM NĂNG ĐỐI VỚI VI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ

TRÊN CÂY NHO (Vitis vinifera L.)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP - MÔI TRƯỜNG

SVTH: Vũ Thị Thùy Linh

Khóa: 2015 - 2019

Bình Dương, tháng 5 năm 2019

Đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến gia đình đã luôn ở phía sau ủng hộ, động viên và yêu thương em để em có thêm động lực đối mặt với những khó khăn

Tiếp theo, em xin gửi lời cám ơn đến thầy Nguyễn Văn Minh và cô Dương

Nhật Linh đã luôn sẵn sàng giúp đỡ em, đưa ra những lời khuyên hữu ích để em có

thể hoàn thành đề tài một cách tốt nhất Không chỉ vậy, thầy cô đã luôn tạo cho em cơ hội tốt để có thể học hỏi, mở mang kiến thức và giúp em có thêm những kinh nghiệm đáng quý cho cuộc sống sau này

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Trường Đại học Mở TP.HCM đã hết lòng giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu làm tiền đề cho em thực hiện đề tài thành công

Ngoài ra, em xin cảm ơn anh Nguyễn Thương Toàn, em Nguyễn Thị Lan

Phương, em Phạm Thị Phương Thảo cùng tập thể các bạn sinh viên thực hiện đề

tài khóa luận tốt nghiệp, các bạn sinh viên học việc ở phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh 1 và 2 đã hết lòng động viên, giúp đỡ em những lúc khó khăn để em có thể hoàn thành đề tài một cách tốt nhất

Cuối cùng, em xin gửi đến gia đình, tập thể quý thầy cô, cán bộ công nhân viên trường Đại học Mở TP.HCM, các anh chị, bạn bè lời chúc sức khỏe, may mắn và thành công

Bình Dương, Tháng 5, năm 2019 Vũ Thị Thùy Linh

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

ii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Các triệu chứng của bệnh thán thư trên lá, quả, cành………….……… 13

Hình 1.2: Hình thái khuẩn lạc nấm Colletotrichum……… 16

Hình 1.3: Hình thái bào tử nấm Colletotrichum………… ……….…… 16

Hình 1.4: Vị trí vùng gen ITS1 – ITS4 rDNA của nấm……… …18

Hình 3.1: Hình thái đại thể mặt trước và sau đĩa của các chủng nấm……… 28

Hình 3.8: Kết quả gây nhiễm nhân tạo trên lá của các chủng nấm… ….…… ……37

Hình 3.9: Kết quả quan sát đại thể của nấm NT1 sau khi tái phân lập từ lá nho bị gây nhiễm……… ……….38

Hình 3.10: Kết quả quan sát vi thể của chủng nấm NT1 sau khi tái phân lập từ lá nho bị gây nhiễm……… ………… ……… 39

Hình 3.11: Kết quả giải trình tự mẫu nấm NT1 … 40

Hình 3.12: Kết quả BLAST trình tự NT1 trên NCBI …… 41

Hình 3.13: Kết quả dựng cây phả hệ bằng phương pháp Maximum likelihood ……… ……… 42

Hình 3.14: Kết quả quan sát đại thể các chủng vi khuẩn……… 55

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

iii

Hình 3.15: Kết quả quan sát vi thể các chủng vi khuẩn……….…… ……… 56 Hình 3.16: Kết quả định tính khả năng đối kháng nấm bệnh của một số chủng vi khuẩn……… … 58 Hình 3.17: Kết quả định lượng khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn tiềm năng……… ………59 Hình 3.18: Kết quả khảo sát khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn……… …61 Hình 3.19: Kết quả quan sát cây con sau 10 ngày của mỗi nghiệm thức……… …………64

Bảng 1.3: Bảng thống kê sản lượng nho của các nước trên thế giới năm 2016…… …9

Bảng 1.4: Diện tích và sản lượng nho cả nước từ năm 2005 đến năm 2016….……… ……… … ……… 10

Bảng 3.1: Kết quả thu nhận mẫu và phân lập các chủng nấm……… ……… …… ……… 11

Bảng 3.2: Kết quả quan sát đại thể của 6 chủng nấm……….12

Bảng 3.3: Kết quả quan sát vi thể của 6 chủng nấm……… ……… 13

Bảng 3.4: Kết quả quan sát đại thể của các chủng vi khuẩn……….54

Bảng 3.5: Kết quả quan sát vi thể của các chủng vi khuẩn………55

Bảng 3.6: Kết quả định tính khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn………….57

Bảng 3.7: Kết quả định lượng khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn tiềm năng sau 7 ngày quan sát……… 60

Bảng 3.8: Kết quả cây nho bị bệnh sau 10 ngày gây nhiễm……….62

Bảng 3.9: Kết quả cây nho bị bệnh sau 15 ngày gây nhiễm……… … …64

Bảng 3.10: Kết quả cây nho bị bệnh sau 15 ngày gây nhiễm……… 65

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm… ………… ……….19

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

PDA cm ha cs

C.gloesporioides E ampelina G ampelophagum C.acutatum

CFU PCR

Potato Dextrose Agar Centimet

hecta Cộng sự

Colletotrichum gloesporioides Elsinoe ampelina

Gloeosporium ampelophagum Colletotrichum acutatum

Colony Forming Unit Polymerase Chain Reaction

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 6

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 10

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1 TỔNG QUAN VỀ CÂY NHO 12

3 MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP TRÊN CÂY NHO 18

4 BỆNH THÁN THƯ GÂY HẠI TRÊN NHO 19

4.1 Tổng quan về bệnh thán thư 19

4.2 Tác nhân gây bệnh 21

5 GIỚI THIỆU VỀ BACILLUS……… 25

5.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus……… … ……25

5.2 Vai trò của Bacillus trong phòng trừ nấm bệnh…… …….….26

6 KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ (PCR)……… ………27

6.1 Định nghĩa……… ………27

6.2 Nguyên tắc……… ……… 27

6.3 Vùng ITS rDNA……… ……… 28

Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

1 ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CỨU 30

2 VẬT LIỆU 30

3 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 30

4.2.4 Gây nhiễm nhân tạo 35

4.2.5 Tái phân lập vi nấm từ lá bệnh đã được gây nhiễm 35

4.2.6 Định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử 35

4.3 Tái phân lập các chủng vi khuẩn tiềm năng 36

4.3.1 Quan sát đại thể 36

4.3.2 Quan sát vi thể ……….……….…………36

4.4 Sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năng……….37

4.4.1 Thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm soát nấm bệnh……….……….……….…… 38

4.4.2 Thử nghiệm ảnh hưởng của dịch lọc nuôi cấy các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm soát nấm bệnh……….……….……… 38

4.4.3 Khảo sát khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn tiềm năng ………….……….……….………… 39

4.5 Đánh giá hiệu quả kiểm soát nấm bệnh của các chủng vi sinh vật tiềm năng trên mô hình nhà lưới……….……… ………… 39

Phần III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY NHO 42

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 8

1.1 Kết quả quan sát đại thể 42

1.2 Kết quả quan sát vi thể 47

1.4 Kết quả tái phân lập vi nấm gây bệnh trên lá nho 54

1.5 Kết quả định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử 56

2 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP VI KHUẨN……… …58

2.1 Kết quả quan sát đại thế….……… ……… 58

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây nho (Vitis vinifera L.) thuộc họ nho (Ampelidaeae) có nguồn gốc ở các

miền ôn đới Âu – Á và là một trong những cây có từ lâu đời nhất trên trái đất (90 - 95 triệu năm) Nho đem lại nguồn lợi lớn về dinh dưỡng và kinh tế Theo FAO, sản lượng nho trên thế giới năm 2016 đạt 93 triệu tấn với tổng diện tích trồng trên toàn

chủ lực nên luôn được chú trọng phát triển ở những nơi có điều kiện thời tiết khí hậu khô ráo quanh năm, điều kiện thổ nhưỡng đặc thù thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nho như tỉnh Bình Thuận, Ninh Thuận Theo thống kê của ngành Nông nghiệp cả nước năm 2005 diện tích nho là 1900 ha Đến năm 2017, diện tích trồng nho giảm xuống còn khoảng 1400 ha (Tổng cục thống kê, 2017) Một số nguyên nhân dẫn đến tình trạng diện tích trồng nho giảm như: giá cả, bất lợi thời tiết… đặc biệt là các loại bệnh do nấm bệnh, sâu hại và côn trùng Trong số các bệnh gây ảnh hưởng

nghiêm trọng đến cây nho thì bệnh thán thư (Anthracnose) hay còn gọi là bệnh ung thư ở nho, thẹo quả, bệnh đốm mắt chim do vi nấm Elsinoe ampeline, Colletotrichum gloeosprioider, Sphaceloma ampelium gây ra (Jamadar, 2007) Ngoài việc làm giảm

năng suất, bệnh còn làm giảm đáng kể chất lượng thương phẩm dẫn tới làm giảm giá trị hàng hóa, gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế của bà con nông dân Hiện nay, để khắc phục tình trạng bệnh thán thư, đa số người dân sử dụng các loại thuốc hóa học gốc đồng như Kocie 61,4 DF, Champoin 77WP, (Sở NN & PTNT Ninh Thuận, 2011) Tuy nhiên, thuốc hóa học cần thời gian cách ly dài ngày sau khi phun, bón và có ảnh hưởng lớn đến môi trường sinh thái xung quanh cũng như sức khỏe người tiêu dùng Do đó các nhà khoa học đang tìm kiếm những phương pháp sinh học để đem lại những biện pháp tối ưu hơn cho người sử dụng

Nhằm phục vụ nhu cầu thiết yếu đó, đã có những nghiên cứu trong và ngoài nước được thực hiện nhằm tìm ra các biện pháp phòng trừ và kiểm soát nấm bệnh có thể kể đến như nghiên cứu của Phạm Đình Dũng và cs năm 2017 về khả năng kháng

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 10

nấm Colletotrichum gloeosporioides của chế phẩm Oligochitosan – Nano Silica

để kiểm soát bệnh thán thư trên cây nho nho (Vitis vinifera L.),…

Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu được công bố về các biện pháp sinh học sử dụng các chủng vi sinh vật để phòng trừ nấm gây bệnh thán thư trên nho Đứng trước tình hình đó, cần đưa ra các biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hại phù hợp, hiệu quả, ít tốn kém, không gây ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe người sử dụng Vì vậy,

chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học của các chủng

vi sinh vật tiềm năng đối với nấm gây bệnh thán thư trên cây nho (Vitis vinifera L.)” với mục tiêu tìm ra các chủng vi sinh tiềm năng có khả năng kiểm soát sinh học

vi nấm gây bệnh thán thư trên cây nho, hướng đến nền nông nghiệp hữu cơ an toàn cho người dân và là tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn

Nội dung nghiên cứu

⮚ Phân lập và định danh vi nấm gây bệnh thán thư trên nho bằng phương pháp sinh học phân tử

⮚ Sàng lọc các chủng vi sinh vật tiềm năng có khả năng kiểm soát vi nấm gây bệnh thán thư trên nho

⮚ Đánh giá khả năng kiểm soát nấm bệnh của các chủng vi khuẩn

⮚ Khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn được lựa chọn

⮚ Đánh giá hiệu quả kiểm soát nấm bệnh của các chủng vi sinh vật tiềm năng trên cây nho ở quy mô nhà lưới

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 11

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 12

1 TỔNG QUAN VỀ CÂY NHO 1.1 Giới thiệu

Cây nho (Vitis vinifera L) thuộc chi Vitis, họ Vitaceae có nguồn gốc ở các

miền ôn đới Âu – Á (Acmênia – Iran) và là một trong những cây có từ lâu đời nhất trên trái đất (90 - 95 triệu năm) Nho được trồng đầu tiên ở gần biển Caspian của Liên Xô cũ sau phát triển theo hướng phía tây của châu Âu và lục địa châu Mỹ và hướng về phía đông đối với Iran và Afghanistan (Jamadar, 2007)

Nho là cây dây leo thân gỗ, lá hình tim, quả tròn, nhỏ, mọc thành chùm từ 6 - 300 trái một chùm, có màu đen, vàng, đỏ tía, xanh lục Khi chín quả dùng để ăn tươi, làm nho khô, rượu vang nho hoặc các loại nước quả (Vũ Công Hậu, 2001) Nho là cây ăn quả có giá trị, được trồng tập trung ở vùng có khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới Tuy được trồng ở phổ rộng về khí hậu nhưng đặc điểm đáng chú ý nhất của nho là yêu cầu có một mùa khô đủ dài để tích lũy đường, đây cũng chính là yếu tố quan trọng nhất để tạo nên chất lượng nho Nhiệt độ là một trong các yếu tố quan trọng giúp cây nho phát triển sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực, nhiệt độ phù

đều gây ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nho Đồng thời nho cũng là cây ưa sáng, thiếu ánh sáng trong thời gian dài sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp hydrat carbon gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nho Nếu thiếu ánh sáng trong thời kỳ ra hoa và đậu quả sẽ dễ dẫn đến tình trạng rụng hoa và rụng quả non Ẩm độ không khí đóng vai trò quyết định lớn đến năng suất và phẩm chất nho, vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng phát triển của cây nho, ẩm độ không khí phù hợp với nho từ 70 - 75%, ẩm độ không khí cao nho dễ bị nhiễm các loại nấm bệnh Lượng mưa phù hợp cho nho từ 700 - 850 mm/năm, lượng mưa cao trên 1.200 mm/năm dễ gây nên hiện tượng úng nước của bộ rễ, mưa lớn vào thời kỳ ra hoa đậu quả gây nên hiện tượng rụng hoa, rụng quả Nho thích hợp trên nhiều loại đất, từ cát thô, lẫn sỏi đá đến đất thịt nặng Các đất có thành phần cơ giới sét

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 13

nặng, tầng canh tác nông, tiêu thoát nước kém không phù hợp cho nho Khoảng giá trị pH phù hợp cho nho từ 5,5 - 7,5, nếu pH thấp dưới 4,5 hoặc cao trên 8,5 có ảnh hưởng không tốt đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây nho Yêu cầu đất trồng nho có độ phì cao, thành phần cơ giới nhẹ đến trung bình, tầng đất dày, khả năng thoát nước tốt (Sở NN & PTNT Ninh Thuận, 2011)

Với diện tích trồng nho trên toàn thế giới năm 2017 là hơn 7,5 triệu ha và đem lại sản lượng nho hàng năm trên toàn thế giới đạt trên 90 triệu tấn, tập trung ở các nước như Mỹ, Brazil, Italy, Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Thổ Nhĩ Kỳ và Ấn Độ… nho hiện đang là loại trái cây đem lại giá trị kinh tế khá lớn ở nhiều quốc gia (OIV, 2018) Năm 2000, nho chỉ được trồng chủ yếu ở các nước như Tây Ban Nha, Pháp, Ý, Thổ Nhĩ Kì, Trung Quốc nhưng đến năm 2017, nho đã được trồng nhiều ở các nước khác như Ấn Độ, Đức, Iran… Ở vùng nhiệt đới Châu Á, nho phát triển mạnh ở các nước như Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Trung Quốc chiếm 26% diện tích trồng và 34% sản lượng nho trên toàn thế giới (Jean-Marie Aurand, 2018)

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 14

Hiện có rất nhiều loài nho đa dạng như: Vitis vinifera, Vitis labrusca, Vitis riparia, Vitis lincecumii, Vitis riparia, Vitis aestivalis… nhưng Vitis vinifera là phổ

biến nhất Hơn 90% tổng sản lượng nho thu hoạch hàng năm trên thế giới thuộc loài

Vitis vinifera Ngoài ra còn một số loài nho lai ghép, chủ yếu là lai ghép giữa V vinifera và một trong các thứ (biến chủng) của V labrusca, V riparia hay V aestivalis Các giống lai ghép có xu hướng ít nhạy cảm với sương muối và dịch bệnh

(Vũ Công Hậu, 2001)

Ở nước ta, giống nho đỏ Cardinal được trồng nhiều vì đây là giống nho quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn ở các nước khác như Thái Lan, Philippines,… vì có nhiều ưu điểm như mẫu mã đẹp, dễ vận chuyển, sinh trưởng nhanh, chất lượng sản phẩm khá tốt Ngoài ra, còn một số giống nho khác được trồng ở Việt Nam như NH01-48, NH01-93,… nhờ những đặc điểm vượt trội như bộ rễ khỏe mạnh, vỏ dày, độ đường cao, thích nghi với nhiều loại đất, có khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt của môi trường, khả năng nhân giống cao (Vũ Công Hậu, 2001)

1.3 Giá trị dinh dưỡng

Nho là một loại quả chứa nhiều đường, độ ngọt tương đương với các loại trái cây nhiệt đới như nhãn, vải, hồng Đường trong nho ngọt ở dạng dễ tiêu như Glucose, Fructose… Ngoài ra, trong nho còn chứa nhiều loại muối khoáng và vitamin khác nhau, đem lại những lợi ích về sức khỏe và sắc đẹp Không chỉ vậy, quả nho chứa một hàm lượng lớn polyphenol Đây là chất làm hạn chế quá trình đông của tiểu cầu, giảm bệnh nhồi máu cơ tim, chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, chữa cao huyết áp, chống lão hóa… (Vũ Công Hậu, 2001) Bên cạnh đó một số lợi ích từ các sản phẩm làm từ nho có thể kể đến như như rượu vang nho có tác dụng chữa trị các bệnh liên quan đến tim mạch, tiểu đường, béo phì, cao huyết áp, hoặc làm tăng cholesterol tốt và giảm cholesterol xấu, tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể (Lysa và cs., 2010) Đặc biệt, chiết xuất hạt nho đã được chứng minh có tác dụng dược lý và trị liệu như chống oxy hóa, chống viêm và kháng khuẩn, cũng như có tác dụng bảo vệ

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 15

tim mạch, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh (Marjan và cs., 2016) Theo kết quả nghiên cứu của Bộ Y tế năm 2007 về thành phần các dưỡng chất có trong nho được thống kê qua bảng sau:

Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng của nho có trong 100g phần ăn được

(Nguồn: Bộ Y tế - Viện Dinh dưỡng)

Thành phần dinh dưỡng

Hàm lượng

Đơn vị

Thành phần dinh dưỡng

Hàm lượng

Đơn vị

Theo thống kê của FAO năm 2017, diện tích trồng nho trên toàn thế giới khoảng 8 triệu ha, đem lại sản lượng lên đến 93 triệu tấn (FAO, 2017) Trong số đó, 2/3 sản lượng nho là để sản xuất rượu, khoảng 30 triệu tấn còn lại là để ăn tươi hoặc làm nho khô (OIV, 2018) Châu Âu là khu vực có diện tích trồng nho nhiều nhất trên thế giới, tập trung ở một số quốc gia như Tây Ban Nha, Italy, Pháp,… (FAO, 2017) Tình hình phân bố và trồng trọt nho ở một số châu lục và các nước trên thế giới được thể hiện qua bảng 1.2 và 1.3 như sau:

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 16

Bảng 1.2 Bảng thống kê tình hình phân bố và trồng trọt nho một số khu vực

trên thế giới năm 2016 (Nguồn: FAO, 2017)

Stt Khu vực Diện tích (ha) Sản lượng (tấn)

Bảng 1.3 Bảng thống kê sản lượng nho của các nước trên thế giới năm 2016

Qua bảng 1.2 và 1.3 nhận thấy Châu Á là châu lục có sản lượng nho hàng năm cao nhất thế giới và Trung Quốc chính là quốc gia có sản lượng nho sản xuất cao nhất thế giới

2.2 Ở Việt Nam

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 17

Ở Việt Nam, cây nho được xác định là cây trồng chủ lực nên được tập trung phát triển ở những khu vực không bị ngập úng, có điều kiện khí hậu thời tiết, đất đai phù hợp Diện tích trồng nho của cả nước năm 2016 khoảng 1400 ha, trong đó tỉnh Ninh Thuận chiếm khoảng 90% diện tích trồng và đạt 95 - 98% năng suất nho hàng năm, chủ yếu ở các xã như Phước Hậu, Phước Sơn, Phước Nam, Phước Thuận và Phước Dân, Tân Giang, Bầu Zôn và Lanh Ra (huyện Ninh Phước), Thành Hải và Ðô Vinh (Phan Rang – Tháp Chàm) (Cục thống kê tỉnh Ninh Thuận, 2017) Diện tích và sản lượng nho cả nước qua các năm được thể hiện trong bảng 1.4 như sau:

Bảng 1.4 Diện tích và sản lượng nho cả nước từ năm 2005 đến năm 2016

(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017)

Năm Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn)

Năm Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn)

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 18

trọng gây ảnh hưởng đến năng suất cũng như diện tích trồng nho nước ta và trên thế giới

3 MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP TRÊN CÂY NHO

Hiện nay, có rất nhiều bệnh gây hại cho nho trên thế giới Trong số đó có những bệnh khá phổ biến và gây ảnh hưởng khá lớn đến việc trồng trọt nho Một số bệnh thường gặp trên cây nho và để lại hậu quả nghiêm trọng theo mô tả của Vũ Công

Hậu (2001) như sau:

Bệnh mốc sương (Downy mildew)

Bệnh xuất hiện vào thời kỳ nho sinh trưởng mạnh về thân lá ở những vùng có khí hậu ấm và ẩm Trong điều kiện thiếu mưa vào mùa xuân hoặc mùa hè ở những vùng nho ôn đới như Afganistan, California, Chilê bệnh ít phát triển Bệnh này do

nấm Plasmopara viticola gây ra Nấm chủ yếu tấn công trên lá non và lá bánh tẻ

Triệu chứng đầu tiên là xuất hiện các vết màu vàng với kích thước và hình dáng không đồng đều, sau đó mọc lên các bào tử nấm màu trắng

Bệnh phấn trắng (Powdery mildew)

Bệnh nấm trắng được người trồng nho ở Ninh Thuận gọi là bệnh nấm xám

hay bột xám do nấm Uncinula necator gây ra Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Mỹ sau đó

được phát hiện ở Anh Ngày nay, người ta thấy bệnh nấm trắng gây hại trên tất cả các vùng nho trên thế giới, bao gồm cả các nước có khí hậu nhiệt đới

Bệnh rỉ sắt

Đây là bệnh nguy hiểm trên nho, chúng xuất hiện đầu tiên ở vùng nhiệt đới, sau đó lan sang các vùng nho ôn đới của châu Á từ Srilanca, Ấn Độ và Bắc Java tới Triều Tiên và Nhật Bản Ở các nước châu Mỹ thì từ Colombia, Venezuela và Trung Mỹ tới miền Nam Florida và các bang khác của Mỹ Bệnh hại nặng đặc biệt ở vùng châu Á và Trung Mỹ, nếu không được phòng trừ thì cây nho bị tàn lụi Tác nhân gây

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 19

bệnh do nhiều loài nấm, nhưng ở Việt Nam tác nhân gây bệnh được xác định là nấm

Kuehneola vitis gây ra Nấm chủ yếu gây hại trên lá bánh tẻ và lá già, chính vì thế mà

thường thấy nấm xuất hiện vào cuối vụ

Bệnh thán thư (Anthracnose)

Bệnh thán thư nói chung là bệnh gây hại nguy hiểm đối với tất cả các loài cây trồng, tập trung trên các cây: bông, bầu bí, cà chua, chuối, đậu, ngũ cốc, xoài, củ hành, cây tiêu Nấm gây hại ở tất cả các bộ phân của cây trên mặt đất (White và cs,

1990) Ở Việt Nam, bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp là bệnh hại rất phổ

biến trên nhiều cây ăn quả (xoài, chôm chôm, đu đủ ), cây công nghiệp dài ngày (cà phê, ca cao, điều…), cây công nghiệp ngắn ngày mức độ gây hại rất lớn, những cây bị bệnh gây hại nặng ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của cây, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm Đây cũng chính là bệnh gây hại đặc biệt nghiêm trọng

trên cây nho và vẫn chưa có phương pháp phòng trừ hiệu quả

4 BỆNH THÁN THƯ GÂY HẠI TRÊN NHO 4.1 Tổng quan về bệnh thán thư

Bệnh thán thư gây hại nho trên thế giới được Pliny phát hiện lần đầu tiên ở Italia vào năm 1886, bệnh lan truyền và phát triển rất mạnh ở Châu Âu trong nhiều thế kỷ qua Bệnh gây tổn thất rất lớn tại Nam Phi, Nam Mỹ và Chilê trong giai đoạn 1950 - 1951, 90% diện tích trồng nho bị bệnh thán thư gây hại, thiệt hại năng suất và sản lượng 83 - 100% (Jamadar, 2007) Ở Việt Nam, bệnh thán thư gây hại nho từ năm 1999 ở Ninh Thuận và sau đó lan sang các vùng trồng nho của cả nước Bệnh gây hại trên tất cả các bộ phận của cây trên mặt đất, đặc biệt tập trung vào các chồi, quả non… Nghiêm trọng nhất quả bắt đầu bước vào giai đoạn chuẩn bị thu hoạch và làm giảm năng suất có thể tới 70 - 80% Ngoài việc làm giảm năng suất, bệnh còn làm giảm đáng kể chất lượng thương phẩm dẫn tới làm giảm giá trị hàng hóa (Sở NN & PTNT Ninh Thuận, 2011) Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu về đối tượng nấm gây bệnh

- Trên lá: xuất hiện các đốm hình tròn, màu nâu hoặc đỏ sậm (đường kính từ 1 - 5 mm) Dần dần, các đốm bệnh lan rộng ra, có thể kết hợp với nhau tạo thành đốm bệnh lớn, vết bệnh sau đó bị hổng thành lỗ Các tổn thương dọc theo gân lá có thể gây quăn và biến dạng lá khi chúng nở ra

- Trên chồi: các đốm có hình bầu dục, màu nâu sẫm và tím tía với, trung tâm vết bệnh có màu xám và các cạnh được nâng lên Trên những chồi bị bệnh lâu ngày, các tổn thương có thể mở rộng vào sâu bên trong chồi và có các cạnh dày lên

- Trên quả: xuất hiện những đốm có đường kính từ 2 - 7 mm, màu nâu tía, hơi hõm sâu vào trong quả Khi bệnh nặng hơn, vết thương trên quả sẽ chuyển sang màu xám trắng bên trong, xung quanh có vòng tối hẹp Bệnh gây ra trên qủa có triệu chứng trông như mắt chim nên bệnh còn được gọi là “bệnh đốm mắt chim” (Annemiekr Schilder, 2011) Những vết thương trên quả có thể gây nứt vỏ, quả nhăn nhúm, thối rữa và nho không thể bán được

- Trên ngọn: Vết bệnh ban đầu là những chấm nhỏ màu nâu xám sau phát triển bao quanh ngọn và lan dần xuống dưới làm đọt chết khô

- Trên thân, cành và cuống quả vết bệnh có dạng lõm xuống có gờ và xây thành xung quanh hình ô van, hoặc hơi dài nằm dọc theo thân cành hoặc cuống

trưởng thành, lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1891 và đã được tìm thấy trong hầu hết các khu vực trồng nho, đặc biệt ở các khu vực ấm áp, ẩm như Đông

Nam Hoa Kỳ (Pearson,1988) Cả hai loài nấm C acutatum và C gloeosporioides đều gây bệnh thán thư (thối quả) trên cây nho (V rotundifolia) tại Hoa Kỳ (Daykin và cs.,1984) Theo Yamamoto, nấm C.acutatum gây bệnh thán thư (thối quả) đã được phát hiện ở Nhật Bản và đồng thời 2 loài này gây thối quả trên loài nho (V vinifera)

tại các khu vực cận nhiệt đới của Úc như: Thung lũng Shoalhaven, Hunter, Hastings Valley và Kingaroy (Yamamoto J và cs.,1999) Bệnh thán thư xuất hiện ở các vườn nho đang thu hoạch ở Úc trong điều kiện thời tiết thuận lợi cho nấm bệnh phát triển

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 22

như: ấm áp, ẩm ướt, bệnh phát triển gây thiệt hại lớn (Malksham và cs., 2002) Qua

những nghiên cứu trên có thể thấy chủng nấm Colletotrichum sp có mức độ gây bệnh

phổ biến và nghiêm trọng nhất trong 3 chủng nấm kể trên Đồng thời, đây cũng là chủng nấm gây bệnh thán thư đặc biệt nghiêm trọng ở các loài cây khác nhau nên cần

có biện pháp sinh học xử lý sớm và hiệu quả

4.2.2 Nấm Colletotrichum gây bệnh trên nho

Colletotrichum là một trong những nấm bệnh thực vật quan trọng nhất về kinh tế, chúng là nguyên nhân gây bệnh thán thư trên trái và lá của một loạt các

cây trồng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Hyde,

2009) Phân loại khoa học của nấm Colletotrichum theo khóa phân loại của Sutton

(1980) như sau:

Ngành: Deuteromycotina Lớp: Hypomycetes Bộ: Moniliales

Họ: Tuberculariaceae Chi: Colletotrichum

Đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước được thực hiện nhằm mô tả

hình thái đại thể và vi thể của nấm Colletotrichum Theo khóa phân loại của Sutton

(1980), bổ sung đặc điểm màu sắc khuẩn lạc của Simmonds (1965) và CABI

(2018), khuẩn lạc của nấm Colletotrichum khá đa dạng về màu sắc như trắng,

xám, xanh đen, hồng, đỏ, cam, tím nhạt, vàng nhạt, vàng nghệ Một số loài nấm khuẩn lạc còn xuất hiện các chấm xanh hoặc đen ở phía sau đĩa cấy Riêng loài

C.gloeossorioides, khuẩn lạc thường có màu trắng hoặc hơi xám, đặc trưng trên

khuẩn lạc có dịch nhũ hồng hoặc màu cam đó là dịch bào tử Nghiên cứu của

Ashokas (2005) cho thấy, trung bình đường kính khuẩn lạc Colletotrichum gloeosprioides trên các môi trường sau 9 ngày khá khác biệt Trên môi trường

PDA đường kính khuẩn lạc phát triển đạt 90mm, trong khi đó môi trường CMA

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 23

là 53 mm, Czapek là 67 mm, PCA là 62.83 mm Qua đó có thể nhận thấy PDA là

môi trường tốt để nấm Colletotrichum gloeosprioides phát triển

Theo mô tả của Cao Ngọc Điệp (2014), nấm Colletotrichum có hệ khuẩn

ty thật, gồm có sự phát triển sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu và sợi nấm có vách ngăn Hệ sợi nấm có gian bào và nội bào Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm, khi chín sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại (Cao Ngọc Điệp, 2014)

Nấm Colletotrichum nội sinh trên cây chủ, chỉ sinh sản vô tính bằng bào

tử đính Theo Agrios (2005), ở giai đoạn vô tính chúng cho ra các bào tử đính đơn bào, có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ không màu và đôi khi có giọt dịch

trong bên trong bào tử Riêng ở loài Colletotrichum gloeosporioides, bào tử đính

có dạng thuôn dài, hình trụ, tròn 2 đầu Một số lượng nhỏ bào tử của

Colletotrichum gloeosporioides có bào tử chỉ tròn 1 đầu, đầu còn lại hơi nhọn và

thuôn dài (Pamela và cs., 1992) Theo mô tả của Mai Văn Hào và cs (2005), kích

thước bào tử chiều dài/chiều rộng là 16,613 x 6,563 µm Theo Jamadar (2007) mô

tả bào tử của Colletotrichum gloeosporioides là bào tử trong suốt không có vách

ngăn chiều dài/chiều rộng 10,3 - 37,6 x 4,6 - 6,7 µm Còn theo Shanmughvelu và

cs (1989), bào tử Colletotrichum gloeosprioides có hình cầu hoặc hình trụ tròn 2

đầu, kích thước trung bình là 14 - 18 x 4.5 - 6.5 µm Bào tử đính phát triển trên

cuống mang bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử

5 GIỚI THIỆU VỀ BACILLUS

5.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus

Theo khóa phân loại của Holt và cs năm 1990, Bacillus được phân loại như

sau:

Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus

Chi Bacillus là một chi lớn (51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài khác chưa được phân loại rõ ràng) và đa dạng, thuộc họ Bacillaceae Họ này chia làm

Desulfotomaculum Đặc trưng của họ này là sự hình thành nội bào tử, một cấu trúc

không sinh trưởng được tạo ra bên trong tế bào vi khuẩn và là chiến lược để sống sót trong môi trường đất

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 25

Đặc điểm cụ thể về chi này được mô tả như sau: tế bào hình que thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 – 2,2 x 1,2 – 7,0 µm Thường di động, roi điển hình nằm hai bên Hình thành bào tử chịu nhiệt, chỉ có một bào tử trong một tế bào Sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi tiếp xúc với không khí Gram dương hoặc chỉ cho Gram dương ở giai đoạn đầu của sự phát triển Trao đổi chất kiểu hô hấp nghiêm ngặt hoặc cả hô hấp và lên men đồng thời, đòi hỏi nhiều thành phần Chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển hoá hô hấp là oxi phân tử Hầu hết cho catalase dương tính

Việc phân loại Bacillus ban đầu dựa trên hai đặc điểm là sự phát triển trong

điều kiện hiếu khí và sự hình thành nội bào tử, kết quả là đã xếp nhiều vi khuẩn có những đặc điểm sinh lý và đặc tính khác nhau Do đó, tính không đồng nhất về sinh

lý học, sinh thái học, di truyền học làm cho việc phân loại chi Bacillus khó khăn Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong một thời gian dài trong điều

kiện bất lợi, nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều

nguồn.Trong đất, Bacillus chủ động trao đổi chất khi có sẵn các cơ chất thích hợp cho

sự tăng trưởng của nó có sẵn, và nó tạo bào tử khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt Đây cũng là chiến lược sinh tồn của vi sinh vật sống trong môi trường đất Vì đa số các

loài Bacillus có thể phân giải hiệu quả các loại cao phân tử sinh học (proteins, tinh

bột, pectin ), nên chúng đóng một vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn sinh học của cacbon và nitơ (Holt và cs., 1994; Harwood và cs., 1990)

5.2 Vai trò của Bacillus trong phòng trừ nấm bệnh

Bacillus là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh

hại cây trồng Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác

động rộng, không gây hại cho con người và cây trồng Mặt khác, Bacillus còn tham

gia vào quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khó phân hủy thành những chất hữu cơ đơn giản cho cây trồng dễ sử dụng, giúp cải tạo đất, khống chế và tiêu diệt một số loại vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng bởi các chức năng sinh học chuyên biệt của

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 26

chúng Vi khuẩn Bacillus subtilis nằm trong nhóm vi khuẩn có khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cho cây Trong các vi sinh vật đối kháng, vi khuẩn Bacillus được chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại nấm như: Rhizoctonia, Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytopthora và một số vi khuẩn khác nhờ vào khả

năng sinh ra các loại enzyme kháng nấm (Nguyễn Xuân Thành và cs., 2003)

6 KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ (PCR)

6.1 Định nghĩa PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR dùng trong phòng thí nghiệm để khuếch đại các đoạn DNA đặc biệt lên hàng triệu lần trong vòng vài giờ qua 20 - 30 chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ bao gồm

tổng hợp mạch mới nhờ DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) ở 70 -

học, chọn giống và trong nhiều lĩnh vực khác (Nguyễn Hoàng Lộc và cs., 2007)

6.2 Nguyên tắc

PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu trong điều kiện

in vitro dưới xúc tác của enzyme DNA polymerase PCR cho phép khuếch đại theo

cấp số nhân các đoạn DNA khuôn mẫu Đoạn DNA khuôn mẫu đã khuếch đại được nhận diện bằng cặp mồi đặc hiệu: mồi xuôi và mồi ngược có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu kì nhiệt lặp lại Mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: biến tính (denaturation), bắt cặp (annealing), kéo dài (extension) được lặp lại khoảng 20 - 35 chu kì:

phút Ở nhiệt độ này các liên kết hydro của phân tử DNA bị đứt làm tất cả các mạch

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 27

xoắn kép của DNA đề được tách ra tạo thành các sợi đơn dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và DNA polymerase

mồi) cho phép các mồi bắt cặp với DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung Trong

trình tự mồi và mức độ đặc hiệu cần thiết cho từng phản ứng PCR cụ thể

polymerase hoạt động tốt nhất kéo dài các mạch DNA Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài khoảng 0 giây đến vài phút Mỗi phản ứng PCR gồm nhiều chu kì liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kì trước là khuôn cho chu kì tiếp theo, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân

Nếu một phản ứng PCR được thực hiện trong 30 chu kì thì số bản sao DNA

6.3 Vùng ITS rDNA

Theo Fajarningsih năm 2016 một trong những phương pháp được coi là một khái niệm mới để xác định nhanh chóng và chính xác mẫu nấm chưa biết là mã vạch DNA Mã vạch DNA là một vùng DNA ngắn, biến đổi cao và tiêu chuẩn hóa với chiều dài khoảng 700 nucleotide, được sử dụng như một mô hình độc đáo để xác định các sinh vật sống Vùng DNA được sao chép nội bộ (ITS) của DNA nhân (rDNA) đã trở thành vùng sử dụng giải trình tự nhiều nhất để xác định phân loại nấm ở cấp loài và thậm chí trong loài Vùng ITS là vùng không mã hóa đa hình cao với đủ đơn vị phân loại Do đó, nó có thể tách các trình tự thành cấp loài Mặc dù ITS ribosome như một điểm đánh dấu mã vạch phổ quát cho nấm vẫn bị cản trở bởi một vài hạn

chế, ITS sẽ vẫn là lựa chọn chính để xác định nấm

Theo Schol và cs., năm 2000, vùng liên gen ITS (Internal transcribed spacer) là một trong những vùng gen phổ biến để để nghiên cứu đa dạng và phân loại nấm Do đó, vùng gen này đã từng sử dụng để định danh các loài nấm thuộc chi

Colletotrichum (Martinez và cs., 2000)

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 28

Theo Abang và cs năm 2002, từ chủng nấm đã phân lập được từ lá bệnh ở

Colletotrichum gloeosporioides Trong một nghiên cứu khác của M Kamle và cs

năm 2013, từ chủng nấm phân lập được từ lá cây xoài bị nhiễm bệnh thán thư qua sàng lọc bằng cách kiểm tra hình thái và định danh ở vùng ITS1 - ITS4, kết quả độ

tương đồng 99% - 100% so với loài Colletotrichum gloeosporioides Từ những dữ

liệu nghiên cứu đã thu thập được, nhận thấy rằng, vùng gen ITS1 - ITS4 có mức độ

bảo tồn cao và có thể phân biệt được đến mức độ loài của chi nấm Colletotrichum gloeosporioides

Theo Beeck và cs., năm 2014, trong số các mồi ITS, ITS1 và ITS4 là các mồi chuẩn được sử dụng thường xuyên nhất trong nhiều phòng thí nghiệm Vùng ITS kéo dài từ ITS1 qua 5.8S, ITS2, đến ITS4 đủ dài, chứa đủ các vị trí biến động

để xác định mức độ loài Colletotrichum gloeosporioides

Hình 1.4: Vị trí cấu trúc vùng gen ITS1 – ITS4 rDNA của nấm

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 29

Phần II:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 30

1 ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2019 đến tháng 5/2019 tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh

2 VẬT LIỆU

Thu nhận 5 mẫu lá, quả nho bị bệnh thán thư được lấy trực tiếp từ vườn nho có cây bị bệnh ở ấp Phước Tân, xã Phan, huyện Dương Minh Châu, tỉnh Tây Ninh và xã Phước Thuận, huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận Cây bệnh được xác định dựa trên các dấu hiệu ở phần II, mục 4 Mẫu bệnh sau khi thu thập phải được bảo quản ở môi trường khô ráo, tránh ẩm thấp Tiến hành phân lập nấm bệnh từ mẫu thu thập được trong vòng 8 giờ để tránh tình trạng mẫu bị héo, khô, gây ảnh hưởng đến quá trình phân lập

3 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 3.1 Thiết bị và dụng cụ

- Cân kĩ thuật - Bếp điện - Lò vi sóng - Nồi hấp - Kính hiển vi - Tủ sấy - Tủ ấm - Ống nghiệm - Đĩa petri

- Erlen - Ống đong - Bình serum - Đũa thủy tinh - Màng lọc 0,45 µm - Bộ lọc

- Máy lắc - Kẹp gắp

- Pipet (thủy tinh và micropipet)

- Becher - Que cấy - Đèn cồn - Bình scott

- Lam - Lamen

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 31

3.2 Hóa chất và môi trường

Môi trường: PDA (Potato Dextrose Agar), NA (Nutrient Agrar), NB (Nutrient Broth)

- Hóa chất:

4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 4.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, thí nghiệm được bố trí ở sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ thí nghiệm

4.2 Phân lập và định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử

Thu nhận mẫu nho bị bệnh Tái phân lập vi khuẩn

Xử lý mẫu và phân lập nấm bệnh

Định tính khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn phân lập được Nhuộm Gram, quan sát hình thái

Nhuộm lactophenol và quan sát hình thái

Xác định phần trăm kháng nấm bệnh của vi khuẩn

Thử nghiệm khả năng gây bệnh nhân tạo trên lá nho ở mô hình

phòng thí nghiệm

Khảo sát khả năng tương thích

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 32

4.2.1 Thu nhận mẫu

Dựa vào các triệu chứng bệnh được mô tả ở phần I mục 4.1, thu nhận mẫu nho và đem về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập mẫu Sử dụng túi giấy để lấy giữ mẫu bệnh Mẫu bệnh phải được bảo quản trong điều kiện mát mẻ, khô ráo và không bị tạp nhiễm Đóng gói mẫu cẩn thận để tránh va đập và hơi nước ngưng tụ (Roger và cs., 2005)

4.2.2 Phân lập nấm bệnh

Tiến hành phân lập nấm bệnh theo các bước sau:

1 Rửa sạch phần mẫu cây bệnh dưới vòi nước mạnh để trôi hết chất bẩn 2 Rửa mẫu bằng cồn ethanol 70%

3 Ngâm mẫu với NaOCl 1% trong 5-7 phút 4 Ngâm trong ethanol 70% trong 3-5 phút 5 Rửa mẫu với nước cất vô trùng 3 lần

6 Đặt trên giấy hấp vô trùng để thấm khô mẫu

7 Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe Đặt từ 3 - 4 miếng cấy lên môi trường PDA có chứa

hàng ngày Khi thấy xuất hiện sợi nấm, cấy chuyển ngay sang môi trường PDA mới, ủ tiếp tại nhiệt độ trên

8 Để đạt được mẫu nấm thuần, không lẫn tạp có thể dùng phương pháp cấy đơn bào tử hoặc cấy đỉnh sợi nấm từ các tản nấm mọc lên từ lần phân lập đầu tiên (Roger và cs., 2005)

4.2.3 Định danh sơ bộ

Quan sát đại thể:

Vi nấm được cấy trên đĩa PDA, ủ ở nhiệt độ phòng

Quan sát khóm nấm từ 3 – 10 ngày Đối với một số chủng phát triển chậm hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính, thời gian quan sát sẽ kéo dài hơn có thể đến 1 tháng

Tạo các giọt tiết trên bề mặt khóm nấm

Các đặc điểm khác (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Dựa vào mô tả hình thái đại thể của nấm theo khóa phân loại của Sutton (1980), Simmonds (1965) và CABI (2018) để so sánh, đối chiếu

Quan sát vi thể: tiến hành làm tiêu bản nấm mốc, rồi quan sát hình thái học dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X

Cách làm tiêu bản nấm mốc như sau:

Lấy một lam kính sạch, trong đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2 cm và có độ dày của cạnh khung là 0,3 cm Đặt khung giấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch môi trường PDA bán lỏng (khoảng 10µL) lên lam kính vào giữa khung giấy

Tiếp đến cấy nấm lên trên môi trường vừa mới bơm vào (cấy đơn bào tử hay cấy đỉnh sợi nấm) Đậy lame lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ẩm (ở đây sử dụng đĩa petri bên trong có chứa bông gòn ướt bên trên có đặt thanh chữ U bằng thủy tinh)

Để trong 2 ngày, lấy lam kính ra bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát dưới kính hiển vi (Nguyễn Đức Lượng, 2011)

Dựa vào mô tả hình thái vi thể của nấm Cao Ngọc Điệp (2014), Agrios (2005), Mai văn Hào và cs (2005), Jamadar (2007), Shanmughvelu và cs (1989), Barnett và Hunter (1998), Pamela và cs (1992), Padman và Janardhna (2011) để so sánh và đối chiếu với các chủng nấm đã phân lập được

⮚ Lưu ý:

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 34

4.2.4 Gây nhiễm nhân tạo

Với các chủng nấm thu được ở trên, tiến hành thử nghiệm gây bệnh nhân tạo trên cây nho ở phòng thí nghiệm Các nghiệm thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần

Bố trí thí nghiệm:

Nấm bệnh được đưa vào chậu theo các bước sau:

2 Cho vào ống nấm nước muối 0,85% có chứa 0,05% Tween 80, dùng que cấy cạo nhẹ trên mặt khóm nấm để lấy bào tử

4 Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

5 Dùng mũi mác gây tổn thương lên lá Sau đó tiêm dịch nấm đã thử nghiệm và

6 Lá đối chứng sẽ được nhỏ nước cất vô trùng (Lan và cs, 2012)

7 Sau 3-5 ngày, kiểm tra những mẫu nho thí nghiệm Lựa chọn những mẫu nho bị bệnh để tái phân lập

4.2.5 Tái phân lập vi nấm từ lá bệnh đã được gây nhiễm

Tiến hành tái phân lập lại nấm gây bệnh từ mẫu lá nho đã được gây nhiễm trước đó (có triệu chứng bệnh nặng nhất và tương tự với mô tả về bệnh thán thư) tương tự các bước như ở phần II mục 4.2

4.2.6 Định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 35

Vi nấm sau khi làm thuần được gửi đi định danh dịch vụ tại Công ty CP Công nghệ TBR Kết quả giải trình tự được BLAST trên phần mềm NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ) để so sánh với các trình tự của chi

Colletotrichum sp

Thu nhận trình tự nucleotide của vùng gen 28S rDNA của các vi nấm khác

thuộc chi Colletotrichum spp và các vi nấm thuộc nhóm ngoại từ Genbank trên NCBI

Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm Mega 6.0

4.3 Tái phân lập các chủng vi khuẩn tiềm năng

Sau khi nhận giống vi sinh vật từ phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh Trường Đại học Mở Tp.HCM tiến hành cấy phân lập trên đĩa môi trường NA

Cách tiến hành

Việc nhuộm Gram được thực hiện như sau:

Nhỏ dung dịch Lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước

O và để yên trong 1 phút Rửa với nước

Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X

Đọc kết quả

Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím Tế bào vi khuẩn Gram (–) bắt màu hồng Cách sắp xếp, hình thái

Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu

4.4 Sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năng

4.4.1 Thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm soát nấm bệnh

Chuẩn bị dịch thử nghiệm

Dịch nấm: ống nấm giống được pha với nước muối sinh lý 0,85% sau cho dịch

Dịch khuẩn: ống chủng vi khuẩn được pha với nước muối sinh lý 0,85%, so

Tiến hành: dùng tăm bông chấm dịch nấm và dịch vi khuẩn thử nghiệm vào 2

trong 6 ngày (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2011)

Từ những chủng vi khuẩn thử nghiệm đã sàng lọc trước đó tiến hành đọc kết quả sau 6 ngày nuôi cấy Nếu vi khuẩn thử nghiệm có có khả năng ức chế nấm bệnh sẽ thấy vùng xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn thử nghiệm, sợi nấm bệnh không sinh

Chuẩn bị dịch khuẩn: chọn ra các chủng vi khuẩn có vòng kháng vi nấm lớn

nhất từ những chủng vi khuẩn đã được sàng lọc ở thí nghiệm trước đó tiến hành nuôi

phút, thu dịch qua màng lọc 0.45 μm

Chuẩn bị dịch nấm: ống nấm giống được pha với nước muối sinh lý 0,85% sao

cầu)

Tiến hành:

+ Dịch khuẩn đã chuẩn bị được pha với môi trường PDA với tỷ lệ 1:1 (7 mL dịch lọc trộn đều với 7 mL PDA (2X)) Vortex đều hỗn hợp và rót lên đĩa petri (đường kính 90 mm)

+ Hút 20 μL dịch nấm bệnh vào giữa đĩa petri đã chuẩn bị ở trên Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 6 ngày

+ Thực hiện tương tự với đĩa đối chứng, thay dịch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2011)

Từ những chủng vi khuẩn thử nghiệm đã sàng lọc trước đó chúng tôi tiến hành xác định phần trăm kháng nấm bệnh qua công thức sau

I(%) = (C – E )/C x 100% Trong đó:

I: phần trăm ức chế

C: đường kính nấm mốc trên đĩa đối chứng

E: đường kính nấm mốc trên đĩa chứa dịch lọc vi khuẩn

SVTH: VŨ THỊ THÙY LINH 38

Vi khuẩn được xem như có khả năng ức chế nấm khi I > 20% Nếu I <20%, vi khuẩn không có giá trị trong khả năng kháng nấm mốc (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2011)

4.4.3 Khảo sát khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn tiềm năng

Nguyên tắc

Nhằm chuẩn bị cho sự kết hợp các vi khuẩn trong thí nghiệm khảo sát khả năng nảy mầm và khả năng kiểm soát nấm bệnh, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm khẳng định các vi khuẩn không đối kháng nhau

Nhiều vi khuẩn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn khác Nếu vi khuẩn thứ nhất không sinh chất ức chế vi khuẩn thứ hai thì vi khuẩn thứ hai vẫn phát triển bình thường ngay điểm giao nhau của hai vạch này (Shafiqur và cộng sự., 2009)

Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thử nghiệm là đĩa NA

Bước 1: Dùng tăm bông lấy vi khuẩn 1 từ ống đã tăng sinh, cấy 1 đường thẳng vi khuẩn ngay chính giữa đĩa, không chạm mép đĩa petri

Bước 2: Khi đường cấy vi khuẩn 1 đã khô, tiếp tục lấy tăm bông nhúng vào ống vi khuẩn 2 đã tăng sinh, thấm vừa ướt tăm bông, vạch một đường cấy vuông góc với đường cấy của vi khuẩn 1 (Purivirojkul và cs., 2007)