khảo sát mối tương quan giữa tính chất biểu hiện của phân tử mirna 21 với một số gen đích trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại việt nam

Hồ Chí Minh Tên đề tài: Khảo sát mối tương quan giữa tính chất biểu hiện của phân tử miRNA-21 với một số gen đích trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam Ý kiến của giáo viên hướng

-KHẢO SÁT MÔI TƯƠNG QUAN GIỮA TÍNH CHAT BIỂU HIỆN CỦA PHÂN TỬ miRNA-21 VỚI

MỘT SÔ GEN ĐÍCH TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ

VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM

QUANG TRỌNGMINH

ồ KHẢO SÁT MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA TÍNH CHẤT I

Ị BIỂU HIỆN CỦA PHÂN TỬ míRNA-21 VỚI ị

MỘT SỐ GEN ĐÍCH TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM !

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Quang Trọng Minh

Ngày sinh: 28/11/1997 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y Dược Mã sinh viên: 1653010177

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

(Ghi rõ họ và tên)

Quang Trọng Minh

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: ThS Lao Đức Thuận

Học viên thực hiện: Quang Trọng Minh Lớp: DH16YD01

Ngày sinh: 28/11/1997 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh

Tên đề tài: Khảo sát mối tương quan giữa tính chất biểu hiện của phân tử miRNA-21

với một số gen đích trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên được bảo vệ khóa luận

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến hai Thầy Cô hướng dẫn:

PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy và ThS Lao Đức Thuận đã giúp đỡ em rất tận tình, hướng

dẫn, truyền đạt kiến thức, và kinh nghiệm trong suốt quá trình em thực hiện khóa luận tốt nghiệp Thêm vào đó, em cũng xin cảm ơn Thầy Cô đã tạo điều kiện cho em có cơ hội trải nghiệm và học hỏi ở các cuộc thi, hội nghị trong và ngoài nước trong suốt ba năm học tập, để từ đó mở ra cho em thêm nhiều kiến thức mới, tầm nhìn mới cũng như học hỏi được thêm các kiến thức chuyên ngành, nhìn ra được các điểm còn thiếu sót trong các công trình nghiên cứu

Tiếp đến, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc với PGS.TS.BS Châu Ngọc Hoa, người

Dì đã luôn yêu thương và truyền lửa cho em trên suốt con đường học tập, định hướng em bước theo con đường CNSH trong lĩnh vực Y Dược Thêm vào đó, em cũng xin biết ơn gia đình đã luôn là một chỗ dựa tinh thần vững chắc, quan tâm, động viên và hỗ trợ em về mọi mặt trong cuộc sống

Cuối cùng, em không thể không nhắc tới sự hướng dẫn, cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị em tại Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Đặc biệt là những lời quan tâm, động viên, khuyến khích của các anh chị em

Với tình cảm chân thành, cho phép em được bày tỏ sự biết ơn đến các Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học trong suốt quá trình học tập ở Trường Đại học Mở Tp.HCM

Đến nay, em đã có thể hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp, với tên đề tài:“ Khảo

sát mối tương quan giữa tính chất biểu hiện của phân tử miRNA-21 với một số gen đích trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam”

Với điều kiện thời gian, điều kiện cơ sở vật chất tại phòng thí nghiệm, cũng như kinh nghiệm bản thân còn hạn chế, em tin rằng báo cáo khóa luận của em không thể

tránh được những thiếu sót Em xin chân thành cảm ơn TS Trần Gia Bửu đã chỉ bảo,

đóng góp ý kiến, để em có thể bổ sung, nâng cao thêm kiến thức của mình

1.1.1 Định nghĩa, triệu chứng của ung thư vòm họng 4

1.1.2 Phân tích dịch tễ của ung thư vòm họng 4

1.1.3 Bệnh nguyên của UTVH 8

1.2 MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TIỀM NĂNG TRONG CHẨN ĐOÁN SỚM, TIÊN LƯỢNG VÀ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÒM HỌNG 17

1.2.1 Bcl-2 (B cell lymphoma 2) – nhân tố ức chế cơ chế tự thực bào và con đường tín hiệu apoptosis 19

1.2.2 PDCD4 (Programmed Cell Death 4) - nhân tố điều hòa chu trình tế bào, con đường tín hiệu PI3K/Akt và sự chết tế bào theo chương trình 27

1.2.3 PTEN (Phosphatase and Tensin homolog): nhân tố điều hòa âm tính con đường tín hiệu PI3K/Akt 32

1.3 microRNA – MỘT CƠ CHẾ CỦA EPIGENETIC 36

1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp miRNA 37

1.3.2 Cơ chế phân tử hoạt động của miRNA 38

1.3.3 Tính chất biểu hiện của các miRNAs trong ung thư vòm họng 41

1.3.4 Dự đoán gen đích của miRNA 42

1.3.5 Phân tử microRNA-21 46

PHẦN II - VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 55

2.1.1 Y Đức – Thu nhận mẫu nghiên cứu 55

2.1.2 Hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 56

2.2 CÁC CÔNG CỤ TIN SINH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 56

2.2 KHAI THÁC DỮ LIỆU VỀ TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA miRNA-21 VÀ CÁC GEN ĐÍCH 58

2.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ BỘ MỒI 58

2.4 PHƯƠNG PHÁP DỰ ĐOÁN CÁC GEN ĐÍCH CỦA miRNA-21 59

2.4.1 Dự đoán các mRNA mục tiêu của miR-21 59

2.4.2 Khảo sát chức năng của các gen đích dự đoán 60

2.4.3 Xây dựng mạng lưới gen (Gene Networks) 60

2.5 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ PHÁT HIỆN miRNA-21 60

2.6 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RNA GEN Bcl-2, PDCD4, PTEN 61

2.7 PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN Bcl-2, PDCD4, PTEN 62

2.8 THỐNG KÊ, PHÂN TÍCH SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM 63

PHẦN III - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU – KHẢO SÁT IN SLICO 66

3.1.1 Kết quả khai thác dữ liệu tính chất biểu hiện miRNA-21 trên UTVH 66

3.1.2 Kết quả khai thác dữ liệu tính chất biểu hiện các gen Bcl-2, PDCD4, PTEN trên

UTVH 70

3.1.3 Kết quả phân tích ảnh hưởng của miRNA-21 đến các con đường truyền tín hiệu của phân tử mục tiêu trong UTVH 74

3.1.4 Kết quả phân tích các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 77

3.2 KẾT QUẢ DỰ ĐOÁN GEN ĐÍCH 81

3.3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 97

3.3.1 Kết quả khảo sát đặc điểm lâm sàng của bộ mẫu nghiên cứu 97

3.3.2 Kết quả khảo sát tính chất biểu hiện của miRNA-21 trên bộ mẫu UTVH và mẫu dịch phết vòm họng người Việt Nam 100

3.3.3 Kết quả khảo sát tính chất biểu hiện các gen đích của phân tử miR-21 trên bộ mẫu UTVH và mẫu dịch phết vòm họng người Việt Nam 107

3.3.4 Kết quả khảo sát mối tương quan giữa tính chất biểu hiện của miRNA-21 với các gen đích Bcl-2, PDCD4 và PTEN trên bộ mẫu UTVH người Việt Nam 121

PHẦN IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 124

4.2 ĐỀ NGHỊ 125

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong do UTVH ở các nước Đông Nam Á được ghi nhận vào

năm 2018 7

Bảng 1.2 Sự phân bố các yếu tố nguy cơ của UTVH trong các khu vực 9

Bảng 1.3 Mức độ tương quan giữa các yếu tố nguy cơ với bệnh UTVH 16

Bảng 1.4 Chức năng cụ thể và con đường tín hiệu của ba gen mục tiêu 18

Bảng 1.5 Bộ cơ sở dữ liệu của các miRNAs biểu hiện bất thường trong UTVH 42

Bảng 1.6 Sự biểu hiện của phân tử miRNA-21 trong nhiều loại ung thư khác nhau 49

Bảng 2.1 Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng trong phản ứng Real-time PCR 58

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng trong định lượng miRNA-21 61

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time PCR trong định lượng miRNA-21 61

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng Reverse Transcriptase PCR, Real-time PCR các gen mục tiêu 62

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng Reverse Transcriptase PCR, Real-time PCR các gen mục tiêu 63

Bảng 2.6 Hệ thống điểm của giá trị kappa, OR và hệ số tương quan r sử dụng trong Y học (Medcalc® 2019) 64

Bảng 3.1 Các công trình nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của miRNA-21 66

Bảng 3.2 Thông tin các công trình nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của Bcl-2, PDCD4, PTEN 70

Bảng 3.3 Kết quả phân tích các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 78 Bảng 3.4 Kết quả phân tích vùng tương đồng giữa các cặp mồi với trình tự gen đích 79

Bảng 3.5 Tính chất biểu hiện các gen mục tiêu của hsa-miR-21-3p/5p trong UTVH 82 Bảng 3.6 Danh sách và chức năng gen mục tiêu của hsa-miR-21-3p trong UTVH 83 Bảng 3.7 Danh sách và chức năng các gen đích của hsa-miR-21-5p trong UTVH 85 Bảng 3.8 Vị trí bắt cặp của miRNA-21-5p trên vùng 3’UTR của các gen mục tiêu 89 Bảng 3.9 Tương tác giữa các gen mục tiêu của miR-21-3p/5p trong UTVH 90 Bảng 3.10 Bộ cơ sở dữ liệu các gen mục tiêu của miRNA-21 đã được thực nghiệm 96 Bảng 3.11 Đặc điểm lâm sàng của bộ mẫu sinh thiết sử dụng trong nghiên cứu 97 Bảng 3.12 Kết quả phân tích sự biểu hiện của miRNA-21 102 Bảng 3.13 Giá trị trung bình Ct của các mẫu thí nghiệm và giá trị 2-∆∆Ct trong phân tích sự biểu hiện của miR-21 104

Bảng 3.14 Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự biểu hiện của phân tử

miRNA-21 và các đặc điểm lâm sàng 105

Bảng 3.15 Kết quả kiểm tra sự tương đồng của sản phẩm khuếch đại 111

Bảng 3.16 Kết quả phân tích sự biểu hiện của Bcl-2, PDCD4, PTEN 111

Bảng 3.17 Giá trị trung bình Ct của các mẫu thí nghiệm và giá trị 2-∆∆Ct trong phân tích sự biểu hiện các gen mục tiêu 115

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát tính chất biểu hiện của các gen mục tiêu với các đặc điểm

lâm sàng 117

Bảng 3.19 Tính chất biểu hiện (Ct) của gen mục tiêu ở các giai đoạn bệnh UTVH 118 Bảng 3.20 Tính tương quan giữa tính chất biểu hiện của phân tử miRNA-21 và các

gen đích Bcl-2, PDCD4 và PTEN 121

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo của vòm họng và vị trí của ung thư vòm họng 4

Hình 1.2 Biểu đồ mô tả sự phân bố về tỷ lệ mắc (A) và tử vong (B) do UTVH ở các Châu lục trên thế giới ghi nhận vào năm 2018 6

Hình 1.3 Tỷ lệ các loại ung thư mắc phải phổ biến tại Việt Nam 8

Hình 1.4 Con đường tín hiệu trong UTVH cảm ứng bởi Nitrosamines và Nicotine 12

Hình 1.5 Cơ chế phân tử của Acetaldehyde trong UTVH 15

Hình 1.6 Cấu trúc protein của Bcl-2 19

Hình 1.7 Cấu trúc protein của các thành viên họ Bcl-2 21

Hình 1.8 Con đường tín hiệu Apoptosis và sự tự thực bào cảm ứng bởi Bcl-2 22

Hình 1.9 Sơ đồ mô tả bệnh sinh cơ bản của UTVH 26

Hình 1.10 Cấu trúc protein PDCD4 ở người 28

Hình 1.11 Con đường tín hiệu của PDCD4 trong UTVH 31

Hình 1.12 Cấu trúc protein PTEN 33

Hình 1.13 Con đường tín hiệu PTEN/PI3K/Akt trong UTVH 35

Hình 1.14 Con đường sinh tổng hợp miRNAs 38

Hình 1.15 Vai trò của miRNA 39

Hình 1.16 Các kiểu bắt cặp giữa miRNA và mạch mRNA mục tiêu 40

Hình 1.17 Vị trí của miRNA-21 47

Hình 1.18 Cấu trúc sơ cấp và thứ cấp của phân tử miRNA-21 47

Hình 1.19 Vùng trình tự bảo tồn cao của miRNA-21 được ghi nhận qua nhiều loài 48

Hình 3.1 Con đường tín hiệu của miRNA-21 trong bệnh sinh của UTVH 75

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu các cặp mồi khuếch đại gen mục tiêu Bcl-2,

PDCD4, PTEN và chứng nội GAPDH, U6snRNA 80

Hình 3.3 Mạng lưới phân tử các gen đích được dự đoán của hsa-miR-21-3p trong cơ

chế bệnh sinh của UTVH 91

Hình 3.4 Mạng lưới phân tử các gen đích được dự đoán của hsa-miR-21-5p trong cơ

chế bệnh sinh của UTVH 92

Hình 3.5 Sự tập hợp các phân tử đích của miR-21 trên con đường tín hiệu apoptosis 95

Hình 3.6 (A) Kết quả khuếch đại chứng nội U6snRNA trên các mẫu đại diện (B) Kết

quả chu kỳ ngưỡng của U6snRNA trên mẫu bệnh và lành 101

Hình 3.7 Kết quả khuếch đại phân tử miRNA-21 trên các mẫu đại diện 102 Hình 3.8 (A) Giá trị trung bình chu kì ngưỡng của miRNA-21; (B) Mức biểu hiện của

miRNA-21 trong mẫu bệnh và lành (phải) 104

Hình 3.9 (A) Kết quả khuếch đại GAPDH trên một số mẫu thực nghiệm (B) Giá trị

trung bình chu kỳ ngưỡng của GAPDH trên mẫu bệnh và lành 107

Hình 3.10 Kết quả khuếch đại gen Bcl-2 (A, B), PDCD4 (C, D), PTEN (E, F) ở các

mẫu thí nghiệm 109

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm Real-time PCR gen Bcl-2 trên một số mẫu sinh

thiết mô UTVH 109

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm Real-time PCR gen PDCD4 trên một số mẫu sinh

thiết mô UTVH 110

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm Real-time PCR gen PTEN trên một số mẫu sinh

thiết mô UTVH 110

Hình 3.14 Kết quả giải trình tự gen mục tiêu: (A) Bcl-2; (B) PDCD4; (C): PTEN 110 Hình 3.15 Giá trị trung bình chu kì ngưỡng (A) và sự biểu hiện của Bcl-2 (B) trên mẫu

GLOBOCAN: Global Cancer Observatory

HDI: Human Development Index Chỉ số phát triển con người IL: Interleukin

LMP-1: Latent Membrane Protein-1 miRNA/miR: microRNA

PDCD4: Programmed cell death 4 PI3K: Phosphoinositide 3-kinase PTEN: Phosphatase and tensin homolog qRT-PCR Real-time Reverse Transcription-PCR RT-PCR Reverse transcription-PCR

Se Sensitivity (Độ nhạy) Sp Specificity (Độ đặc hiệu)

STAT3 Signal Transducer And Activator Of Transcription 3

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vòm họng (UTVH) là một bệnh lý ác tính xuất phát từ vùng biểu mô vòm họng Theo thống kê của Globocan (2018), tại Việt Nam, có đến 6.212 trường hợp mắc và 4.232 trường hợp tử vong gây ra bởi UTVH được ghi nhận Bên cạnh đó, số liệu thống kê vào năm 2018 còn chỉ ra trên tổng số 129.079 số ca mắc UTVH trên thế giới thì Việt Nam là một trong các quốc gia hàng đầu với số ca mắc và tử vong do UTVH cao nhất khu vực Châu Á, chỉ sau Trung Quốc và Indonesia Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng: sự biểu hiện bất thường của các microRNA, chẳng hạn microRNA-21, có mối liên quan chặt chẽ đến con đường sinh ung và phát triển khối u vòm họng thông qua việc làm rối loạn các con đường tín hiệu tế bào bằng việc tương tác đến các gen đích khác nhau Do đó, các nghiên cứu trên thế giới đã và đang tập trung nghiên cứu sự biểu hiện các miRNA nói chung và miRNA-21 nói riêng và con đường tín hiệu của chúng để hướng tới phát triển dấu chứng sinh học tiềm năng cho việc sàng lọc, chẩn đoán sớm, điều trị bệnh UTVH Điều đáng nhấn mạnh rằng, tại Việt Nam, việc nghiên cứu về tính chất phân tử nói chung – cụ thể là xây dựng mối tương quan giữa sự biểu hiện của miRNA-21 với các gen mục tiêu trong các con đường truyền tín hiệu trên bệnh UTVH hầu như chưa được thực hiện Do đó, việc tìm hiểu tính chất biểu hiện của miRNA-21 với các gen mục tiêu trên bệnh UTVH là một điều cần thiết

Hơn nữa, để tiếp cận được xu hướng y học cá thể (personal medicine) – xu hướng hiện nay thế giới đang quan tâm và phát triễn, thì bên cạnh việc tích lũy các dữ liệu lớn (big data), thì việc tìm hiểu chức năng, ảnh hưởng của mỗi phân tử gen đến tính trạng con người, để rồi qua đó, việc chăm sóc sức khỏe cho mỗi cá nhân sẽ dần được thực hiện dựa trên chính thông tin của gen của cá nhân đó, là rất cần thiết Cho nên, những nghiên cứu về tính chất của mỗi gen cần phải được thực hiện trên mỗi quần thể, mỗi dân tộc đặc trưng để tìm ra những điểm riêng, phản ánh tính chất tương tác

của phân tử đó với điều kiện sinh môi mang tính chất đặc trưng của mỗi đất nước, mỗi vùng miền liên quan đến bệnh đang nghiên cứu

Do đó, nghiên cứu này với tên đề tài “Khảo sát mối tương quan giữa tính

chất biểu hiện của miRNA-21 với một số gen đích trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam” được đặt ra đi theo xu hướng đó, bố trí các thực nghiệm ca –

chứng (case – control study) trên chính người bệnh Việt Nam, tập trung vào yếu tố biểu hiện của miRNA-21 và các gen đích để từ đó góp phần làm sáng tỏ con đường tín hiệu liên quan đến sự hình thành, phát triển khối u vòm họng ở người Việt Nam Những dữ liệu khoa học này là rất quan trọng, phải tiếp tục được tích lũy nhằm hướng tới làm sáng tỏ cơ chế hình thành khối u và phát triển thành UTVH Đặc biệt, những dữ liệu khoa học này sẽ là tiền đề khoa học quan trọng mang tính chất tiên phong để hướng tới việc tiến hành các thử nghiệm lâm sàng hoặc tìm ra các phương thức chẩn đoán, sàng lọc bệnh hay điều trị mới, hoặc phòng ngừa bệnh theo hướng tiếp cận là vaccine cho UTVH trên người Việt Nam

PHẦN I

TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG

1.1.1 Định nghĩa, triệu chứng của ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng (UTVH) là khối u ác tính xuất phát từ biểu mô của vùng vòm họng Về vị trí sinh bệnh của khối u, đó là nơi tiếp giáp mũi, họng và chỗ đổ của ống vòi nhĩ (ống thông giữa tai và mũi họng) nên khi khối u vòm họng xâm lấn, di căn sẽ có triệu chứng liên quan đến các cơ quan này (Hình 1.1) Cụ thể, một số triệu chứng ở tai thường gặp như nghe kém, ù tai, viêm tai giữa tái phát, đặc biệt chỉ xảy ra một bên, triệu chứng ở mũi bao gồm chảy nước mũi có máu, ngạt mũi một bên, chảy mũi nhầy và triệu chứng họng được ghi nhận là ho dai dẳng, khàn tiếng, ho khạc ra đờm dính máu, đau họng Một số triệu chứng thần kinh như đau đầu, thường là đau nửa đầu hoặc đau sâu trong hốc mắt Ngoài ra,do vòm họng có cấu trúc mô bạch huyết phức tạp nên khi có sự xuất hiện của khối u ác tính thì chúng sẽ nhanh chóng lây lan khắp vùng cổ, dẫn đến các hạch cổ sưng lớn không đau (gặp ở 75% bệnh nhân, thường ở hai bên và về phía sau) Ngoài ra, có nhiều bệnh nhân nổi hạch góc hàm trước khi có các triệu chứng kể trêncũng được ghi nhận ở những bệnh nhân mắc UTVH [101]

Hình 1.1.Cấu tạo của vòm họng và vị trí của ung thư vòm họng [134]

1.1.2 Phân tích dịch tễ của ung thư vòm họng

Về sự phân bố dịch tễ của UTVH thì đây là loại ung thư xuất hiện nhiều ở các nước đang phát triển, đặc biệt là các quốc gia thuộc khu vực Châu Phi, Châu Á [66] Theo nghiên cứu của Salehiniya và cộng sự (2018), bệnh UTVH có sự phân hóa về địa

lý rất rõ rệt với 81% phân bố ở khu vực châu Á, 9% tập trung ở châu Phi và 10% còn lại phân bố rải rác khắp nơi trên thế giới [135] Nhìn chung, đây là loại ung thư đặc hữu chỉ có ở một số quốc gia, đặc biệt là ở khu vực Đông Nam Á, bao gồm Việt Nam Theo thống kê về dịch tễ học của UTVH được ghi nhận bởi Lao và cộng sự [66], cho thấy:

(1) Trong năm 2018, có đến 129.079 trường hợp mắc UTVH đã được ghi nhận trên thế giới, theo đó có 93.416 trường hợp (chiếm 72,37%) được chẩn đoán ở nam và 35.663 trường hợp (chiếm 27,63%) được chẩn đoán ở nữ Dữ liệu này cho thấy tỷ lệ mắc của nam gấp 2,62 lần so với nữ Về tỷ lệ tử vong, tổng cộng có 72.987 trường hợp tử vong gây ra bởi UTVH đã xảy ra, có đến 54.280 trường hợp đã tử vong (chiếm 74,37%) được ghi nhận ở nam, và 18.707 ca tử vong (chiếm 25,63%) được quan sát ở nữ (tỷ lệ theo giới: nam/nữ = 2,90)

(2) Trong tổng số 129.079 ca mắc UTVH trên thế giới, tỷ lệ mắc UTVH cao nhất được ghi nhận ở lần lượt năm quốc gia thuộc khu vực Châu Á, cụ thể là 33.198 trường hợp mắc UTVH ghi nhận ở Trung Quốc (chiếm 59%), Indonesia (17.992 ca, chiếm 18%), Việt Nam (6.212 ca, chiếm 6%), Ấn Độ (5086 ca mắc, chiếm 5%) và Philipines (2913 ca, chiếm 3%) Như đã đề cập, UTVH là loại ung thư có sự khác biệt rõ ràng về dịch tễ học, cụ thể có sự phân bố bệnh theo vùng địa lý, chủng tộc nghiêng hẳn về khu vực Châu Á, khi số ca tử vong ở các nước Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam, Ấn Độ, Philipines lần lượt lên tới 31.413 ca (chiếm 43,04%), 11.204 ca (chiếm 15,35%), 4232 ca (chiếm 5,80%), 3.715 ca (chiếm 5,09%) và 1.899 trường hợp (chiếm 2,60%) trên tổng số 72.987 trường hợp tử vong do UTVH được ghi nhận

(3) Một trong những lý do cho sự khác biệt về tỷ lệ mắc và tử vong do UTVH ở các quần thể khác nhau có thể đến từ sự khác biệt bởi chính các yếu tố ảnh hưởng như độ tuổi, giới tính, chủng tộc, tập quán sinh hoạt và một số yếu tố nguy cơ như hút thuốc, chịu tác động ô nhiễm, tác động của hóa chất, hay thói quen thường xuyên tiêu thụ cá muối ở các nước Đông Nam Á [52, 100, 171]

Hình 1.2 Biểu đồ mô tả sự phân bố về tỷ lệ mắc (A) và tử vong (B) do UTVH ở các

Châu lục trên thế giới ghi nhận vào năm 2018 [66]

Riêng tại khu vực Đông Nam Á, theo cơ sở trích xuất dữ liệu thống kê từ chương trình nghiên cứu ung thư trên thế giới (Global Cancer Observatory, Globocan) về mối tương quan giữa tỷ lệ mắc bệnh cũng như tỷ lệ tử vong UTVH theo độ tuổi (Incidence–ASR, Mortality-ASR, Age-Word-Standardized) với chỉ số phát triển con người (HDI: Human Development Incidence) cho thấy:

- Việt Nam là một trong năm quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á có tỷ lệ mắc UTVH theo phân bố chuẩn của độ tuổi đứng thứ năm (ASR = 5,9/100.000), chỉ sau Malaysia, Indonesia, Singapore và Brunei Tuy nhiên, tỷ lệ tử vong của UTVH ở Việt Nam theo chỉ số ASR lại đứng thứ tư trong năm quốc gia có tỷ lệ tử vong do UTVH cao nhất khu vực (ASR = 3,9/100.000)

- Trong số 34.681 ca mắc UTVH và 22.231 ca tử vong thuộc khu vực Đông Nam Á thì ba quốc gia có số ca mắc UTVH cao nhất lần lượt là (1), Indonesia: 17.992 ca; (2), Việt Nam: 6.212 ca và (3), Philipines: 2.913 ca Về số trường hợp tử vong thì

Việt Nam cũng đứng thứ hai trong ba quốc gia có số ca tử vong cao do UTVH gây ra, lên đến 4.232 trường hợp (Bảng 1.1) Số liệu trên còn cho thấy số ca mắc UTVH ở các nước đang phát triển (chỉ số phát triển con người trung bình) cao hơn rất nhiều so với các nước phát triển và rất phát triển như Singapore và Thái Lan Nguyên nhân có thể là do ở các nước đang phát triển thì tác động của các yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVH xảy ra nhiều hơn, việc phân bổ ngân sách ít hơn cho ngành y tế và y tế công cộng, không được tiếp cận với các phương pháp điều trị tiên tiến và kịp thời, thu nhập của người dân chưa cao, giáo dục sức khỏe và dịch vụ y tế kém làm cho hầu hết các trường hợp chẩn đoán UTVH đều ở giai đoạn muộn, đặc biệt là ở giai đoạn tiến triển của bệnh (xâm lấn – di căn), vì vậy, tỷ lệ tử vong cao cũng được ghi nhận nhiều hơn ở các quốc gia này [101, 111, 134]

Bảng 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong do UTVH ở các nước Đông Nam Á được ghi nhận vào

- Đồng thời, tại Việt Nam, cũng theo ghi nhận tại chương trình nghiên cứu ung thư trên thế giới thì UTVH xếp thứ sáu trong các loại ung thư phổ biến nhất tại Việt Nam và đứng đầu trong các loại ung thư vùng đầu và cổ (Hình 1.3)

Hình 1.3 Tỷ lệ các loại ung thư mắc phải phổ biến tại Việt Nam 1.1.3 Bệnh nguyên của UTVH

Hiện nay, việc chẩn đoán UTVH ở giai đoạn sớm thường chậm và gặp nhiều khó khăn bởi các triệu chứng ở giai đoạn đầu của bệnh khá mơ hồ, không đặc hiệu, rất dễ nhầm lẫn với các bệnh lý viêm nhiễm vùng tai mũi họng khác Trong đó, việc phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm thì cơ hội chữa khỏi bệnh càng cao Cụ thể, ở giai đoạn I, tỷ lệ sống sau 5 năm ở những bệnh nhân mắc UTVH nếu điều trị kịp thời lên đến 72%, trong khi, UTVH nếu được phát hiện ở giai đoạn trễ, sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng điều trị lẫn sống sót của bệnh nhân [200] Trong hai thập kỷ qua, việc điều trị UTVH đã được cải thiện đáng kể với sự kết hợp đồng thời của hóa trị và xạ trị Tuy nhiên, tỷ lệ mắc mới của bệnh nhân UTVH ở giai đoạn di căn vẫn còn khoảng từ 25-34% và tương quan với tỷ lệ sống sót thấp Do đó, việc tìm kiếm một hoặc nhiều dấu chứng sinh học, các chỉ thị phân tử (biomarker) ứng dụng trong chẩn đoán sớm, tiên lượng, thậm chí cả điều trị theo hướng y học cá thể hóa (personalized medicine) bao gồm trị liệu nhắm đích - nhắm tới một gen chuyên biệt, đặc hiệu cần cho sự phát triển và tồn tại của tế bào

UTVH hay nghiên cứu dược di truyền học (pharmacogenomics) – căn cứ vào đặc điểm di truyền của từng người ở cấp độ phân tử để đánh giá tác động đến việc cơ thể xử lý và đáp ứng với các loại thuốc điều trị đối với ung thư nói chung và UTVH nói riêng là vô cùng cấp thiết Cho đến nay, có ba nhóm nguyên nhân chính đã được xác định gây nên

UTVH, bao gồm (1): Sự xâm nhiễm của Epstein–Barr virus (EBV infection); (2): Yếu

tố di truyền (Genetic, Epigenetic susceptibility); (3): Yếu tố môi trường (Environmental carcinogens) [67] Đáng nhấn mạnh, UTVH là một bệnh lý đặc hữu với sự tương tác của nhiều nguyên nhân khác nhau (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Sự phân bố các yếu tố nguy cơ của UTVH trong các khu vực

Khu vực đại diện Quần thể đại diện

Yếu tố di truyền

Yếu tố nhiễm

Yếu tố môi trường

Tài liệu tham khảo

1.1.3.1 Sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus

Epstein-Barr virus (EBV), hay còn gọi là human herpesvirus 4, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1964 bởi Epstein và cộng sự [30] Về phân loại thì EBV thuộc họ

Herpesviridae, phân họ Gammaherpesvirinae, chi Lymphocryptovirus, loài Human Herpes virus 4 (HHV4) [69] Bộ gen của EBV có cấu trúc là DNA sợi đôi dài khoảng

184 kps mã hóa cho hơn 85 gen Có ba họ gen đóng vai trò rất quan trọng, bao gồm:

EBNAs (EBV nuclear antigens), LMPs (Latent membrane proteins) và EBERs

(Noncoding nuclear RNAs) [198, 199] Chức năng chính của các gen trong 3 họ gen

được đề cập như sau: (1), EBNA-1 có chức năng sao chép bộ genome của EBV, phân

chia episome của virus trong nguyên phân, góp phần tạo nên sự bất tử của tế bào,

EBNA-2 đóng vai trò là yếu tố kích hoạt đồng phiên mã giúp biểu hiện vượt mức các

gen của virus và tế bào, tạo nên sự bất tử của tế bào; (2), LMP-1 làm giả tín hiệu của CD40 ligand, tăng mức độ biểu hiện của Bcl-2 và a20, góp phần tạo nên sự bất của tử tế bào, LMP-2 đưa EBV vào trạng thái tiềm tan, đóng vai trò là một gen sinh ung (oncogene) trong hội chứng Hodgkin và UTVH; (3), EBERs bao gồm EBER-1 và

EBER-2, một trong những loại RNA không mã hóa xuất hiện trong giai đoạn tiềm tan

của EBV [198, 199] Một nghiên cứu của Old và cộng sự (1996) đã phát hiện trên những mẫu huyết thanh của người bệnh UTVH có sự hiện diện của EBV, từ đó đưa ra giả thuyết đầu tiên về mối liên hệ giữa EBV với bệnh UTVH Về sau, các nghiên cứu lần lượt của Stevens (2005) và Frappier (2013) đều cho thấy sự hiện diện của EBV là một trong những chỉ điểm sinh học tiềm năng để hỗ trợ trong tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh UTVH [23, 158]

Riêng tại cộng đồng Việt Nam, đã có một nghiên cứu tiêu biểu của Lao và cộng

sự (2017) ghi nhận được tỷ lệ dương tính các gen EBNA-1, EBNA-2, LMP-1, LMP-2

trong các mẫu UTVH cao hơn nhiều so với mẫu lành khi thực hiện trên tổng số 95 mẫu dịch phết bệnh và dịch phết lành bằng phương pháp PCR [69] Bên cạnh đó, tỷ lệ odds

(OR) của các gen EBNA-1, EBNA-2, LMP-1 và LMP-2 làm tăng tỷ lệ mắc UTVH lên đến 81,10, 187,06, 158,26 và 84,60 lần so với trường hợp không có các gen EBNA-1,

EBNA-2, LMP-1, LMP-2 Một điểm đáng chú ý, bốn gen này khi kết hợp trong sàng lọc

và chẩn đoán cho độ đặc hiệu là 57,89%, độ nhạy lên đến 97,89%, hướng đến việc xây dựng một tổ hợp chỉ thị phân tử hữu ích, giúp cung cấp các thông tin, dữ liệu khoa học cần thiết cho các bác sĩ trong tiên lượng, chẩn đoán sớm và đánh giá về nguy cơ phát triển của bệnh trong trường hợp không xác định được các tiêu chuẩn chuẩn đoán lâm

sàng ở bệnh UTVH, có thể được sử dụng như dấu chứng sinh học tiềm năng để phát hiện sự hiện diện và dự đoán cho sự phát triển của UTVH trên cộng đồng người Việt Nam Bên cạnh sự hiện diện của EBV, thì trong năm 2018, nhóm của ông cũng ghi nhận

được sự hiện diện các biến thể trên gen EBNA-1 tại codon 487, bao gồm biến thể V-val,

P-ala, P-thr và V-leu [63] Theo đó, biến thể V-val ở mẫu sinh thiết UTVH người Việt Nam là một biến thể đặc trưng ở khu vực châu Á và tương đồng với Trung Quốc [63]

Bên cạnh nhóm gen EBNAs, thì một số biến thể khác như RPMS1-C/RPMS1-C* [62],

hay sự biểu hiện ở các gen BALF5, LMPs cũng lần lượt được ghi nhận có mối tương

quan mạnh với sự hình thành UTVH khi thực hiện trên chính mẫu sinh thiết vòm họng thu nhận từ bệnh nhân UTVH người Việt Nam [71, 73, 117]

1.1.3.2 Yếu tố môi trường

Một số yếu tố môi trường đã được chứng minh làm tăng nguy cơ mắc bệnh UTVH có thể kể đến như tập quán tiêu thụ cá muối (nitrosamines), thói quen hút thuốc (nicotine), sử dụng rượu (acetaldehyde), phơi nhiễm nơi làm việc (formaldehyde) đã được ghi nhận [23,24]

Một phân tích tổng hợp (meta-analysis) gồm 32 nghiên cứu cho thấy nguy cơ mắc UTVH ở người hút thuốc cao hơn 60% so với người không hút thuốc [190] Theo công bố này, ở những người sử dụng thuốc lá với số lượng 30 gói trong một năm có nguy cơ mắc UTVH cao gấp hai lần so với người hút dưới 30 gói trong một năm Một điều đáng nhấn mạnh, nguy cơ mắc UTVH đã được chứng minh sẽ tăng dần theo thời gian và tần suất hút thuốc (tăng 1–2% với mỗi gói/năm) Khói thuốc lá với thành phần chính là nicotine, có thể chuyển hóa thành các hợp chất độc hại như nitrosamine (NNK & NNN) thông qua quá trình nitro hóa (25) Trong khi đó, hai độc tố NNK (4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone) và NNN (N’-nitrosonornicotine) chuyển hóa từ nitrosamine trong khói thuốc lá là các chất gây ung thư phổ biến thông qua việc hoạt hóa nhóm enzyme CYP2E1 (enzyme chịu chức năng xúc tác các phản ứng oxy hóa, cũng chịu trách nhiệm cho sự chuyển đổi sinh học của nitrosamines) để tạo ra các

dạng tổn thương DNA, gọi là DNA "adduct" (sản phẩm “cộng”, sản phẩm phụ) giúp khối u vòm họng hình thành và phát triển [115]

Hình 1.4 Con đường tín hiệu trong UTVH cảm ứng bởi Nitrosamines và Nicotine

[115]

Phân tích về con đường tín hiệu của hợp chất NNK và NNN, cho thấy NNN thường phản ứng với một thụ thể mang tên α7nAChR (thụ thể chịu trách nhiệm cho việc kích thích và tăng trưởng của các tế bào biểu mô ung thư), trong khi NNK lại ức chế với thụ thể α4β2nAChR (thụ thể ngăn chặn sự hình thành và tiến triển của ung thư), làm thúc đẩy hoạt động của các tế bào khối u bằng cách hoạt hóa dòng Ca2+ đi vào bên trong các tế bào, dẫn đến sự khử cực của màng tế bào [115, 152, 181] Dòng Ca2+ này sau khi đi vào bên trong tế bào, làm kích hoạt hàng loạt protein sinh ung như protein kinase C, serotonin, RAF1 (RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase), ERK 1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1&2), Bcl-2, gây ra sự tăng sinh tế bào ung thư Bên cạnh đó, con đường tín hiệu PI3K/Akt cũng được kích hoạt để đáp ứng với sự hiện diện của hợp chất NNK, làm tăng sinh tế bào khối u và ức chế quá trình apoptosis [115, 152, 181, 189], được trình bày ở hình 1.4

Thói quen ăn uống, đặc biệt là việc tiêu thụ cá muối hoặc các thực phẩm bảo quản có chứa nitrosamine hoặc tiền chất nitrosamine và một số hợp chất khác đã được báo cáo là một trong những yếu tố nguy cơ chính ở bệnh UTVH [57] Đầu những năm 1970, Ho và cộng sự phát hiện việc tiêu thụ cá muối có thể là một yếu tố nguy cơ ở bệnh UTVH trong một nghiên cứu gồm 2041 mẫu UTVH từ Hồng Kông và 205 trường hợp mắc UTVH từ Los Angeles [51] Tiếp theo, có ít nhất 11 nghiên cứu theo sau đã được thực hiện trên các cộng đồng khác nhau để chứng minh mối tương quan thuận giữa thói quen ăn cá muối với UTVH Trái ngược với các công trình trên, chỉ có một công trình nghiên cứu tại Thái Lan chỉ ra rằng không có mối liên quan đáng kể nào giữa việc ăn cá muối với nguy cơ mắc UTVH [28] Lý do chính cho việc không có sự tương quan này có thể đến từ cỡ mẫu nghiên cứu chưa đủ lớn để quan sát

Chất nitrosamine trong mắm cá muối kiểu Quảng Đông được biết là chất gây ung thư phổ biến cho con người và được đánh giá là chất gây ung thư nhóm 1 do Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (The International Agency for Research on Cancer, IARC) công nhận [169] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cá được bảo quản bằng muối có chứa N-nitrosamine, là một nguồn hóa chất gây ung thư có thể tác động lên vòm họng ở những người dễ mắc bệnh Theo cơ chế hoạt động, nitrosamine ở cá muối có thể chuyển hóa thành các phân tử gây ung thư bởi sự hoạt hóa của enzyme CYP450 2E1 Ngoài ra, một số hợp chất nitrite và các tác nhân nitro hóa khác còn có thể được tổng hợp bởi

chính vi khuẩn hiện diện trên cá muối (Staphylococci, các vi khuẩn nitrat hóa), làm

chuyển hóa nitrat và nitrit của muối thành các hợp chất độc hại như nitrosodimethylamine (NDMA), N-nitrosodiethylamine (NDEA), N-nitrosopyrrolidine (NYPR) và N-nitrosopiperidine cũng đã được quan sát [3, 129, 131, 169] Một nghiên cứu đáng chú ý được thực hiện bởi Jia và cộng sự, cho thấy thói quen ăn cá muối mặn ngay từ nhỏ sẽ làm tăng nguy cơ mắc UTVH về sau lên đến 2,45 lần (30) Ngoài ra, các thực phẩm được bảo quản bằng muối khác cũng có tác động tương tự đối với nguy cơ mắc UTVH Chẳng hạn như một phân tích tổng hợp được thực hiện bởi Gallicchio và cộng sự (2006) chứng minh các loại thực phẩm ướp muối, hay ngâm muối cũng chứa

N-hàm lượng nitrosamine cao [39] Theo công bố này, những người tiêu thụ các thực phẩm trên ít nhất một lần mỗi tháng có nguy cơ mắc bệnh UTVH cao gấp hai lần so với người lành Việc tiêu thụ thực phẩm lên men với tần suất ít nhất một lần trong một tuần cũng được tìm thấy làm tăng nguy cơ đáng kể trong sự hình thành của khối u vòm họng Riêng đối với việc sử dụng rượu, hiện nay vẫn còn nhiều tranh cãi liên quan đến nguy cơ mắc UTVH do rượu đối với quá trình sinh bệnh của UTVH [57] Tuy nhiên, một phân tích tổng hợp trong năm 2010 đã chỉ ra việc tiêu thụ rượu có sự tương quan dương với nguy cơ mắc UTVH [104] Rượu (Ethanol) được chuyển hóa thành acetaldehyd (AA) thông qua các quá trình oxy hóa được xúc tác bởi các enzyme ADH (alcoholdehydrogenase), cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) và một số catalase khác [39] Theo đó, các hợp chất AA này sẽ gắn chèn vào DNA người bệnh để tạo ra các sản phẩm phụ, làm ức chế các phân tử DNA sửa sai, gây sự methyl hóa DNA và làm hình thành ROS (Reactive oxygen species), dẫn đến sự suy giảm chức năng của tế bào và gây ra một loạt các phản ứng miễn dịch [115] Nhìn chung, AA là một chất chuyển hóa có thể gây tổn thương tế bào theo nhiều cách khác nhau Cụ thể, rượu được chuyển hóa thành các acetaldehyd (AA), làm kích thích con đường sinh ung thư, dẫn đến một số tổn thương trực tiếp trên DNA (Hình 1.5) Rượu và những chất chuyển hóa của nó, như acetaldehyde, cũng gây tổn thương trực tiếp màng tế bào Cụ thể, ethanol có thể làm thay đổi tính lưu động của màng tế bào, thay đổi hoạt động các enzymes gắn lên màng và protein vận chuyển Không những thế, các AA còn gắn chèn các liên kết cộng hóa trị gián tiếp với protein và lipid trên bề mặt tế bào, đóng vai trò như kháng nguyên lạ và gây tổn thương miễn dịch, làm suy giảm cơ chế sửa chữa DNA - khi DNA bị hỏng sẽ làm mất khả năng kiểm soát sự tăng trưởng và nhân lên của tế bào dẫn đến UTVH Thêm vào đó, việc tiêu thụ rượu liên tục cũng làm cảm ứng CYP2E1 dẫn đến các dạng oxi phản ứng mạnh (ROS), gây ra sự peroxid hóa trên màng lipid, làm chết tế bào và dẫn đến viêm nhiễm [8, 37, 144]

Hình 1.5 Cơ chế phân tử của Acetaldehyde trong UTVH [115]

Ngoài ra, việc tiếp xúc với formaldehyd tại nơi làm việc cũng làm tăng nguy cơ mắc UTVH Theo đó, formaldehyd được biết đến có tác dụng gây ra các đột biến xóa đoạn, đột biến thay nu hay đột biến dịch khung ở người Sự liên quan giữa bụi và khói với bệnh này có thể được xem là một chỉ thị y tế công cộng nhằm cải thiện chất lượng không khí trong môi trường nghề nghiệp ở Việt Nam [173]

1.1.3.3 Yếu tố di truyền

Các công bố gần đây đều khẳng định nguyên nhân chính dẫn đến UTVH, bên cạnh tính chất nhiễm của EBV, chính là hệ quả của sự rối loạn về mặt di truyền (bất ổn di truyền) Cụ thể, nhóm yếu tố di truyền được chia làm bốn phân nhóm khác nhau: (1): Sự mất dị hợp tử xảy ra trên NST số 3, 9, 14 hay sự bất hoạt của các gen ức chế khối u

(TSG: Tumor Supressor Gene) như p53, sự biểu hiện quá mức của gen sinh ung (Oncogene) như Bcl-2 đều được chứng minh là liên quan đến sự hình thành khối u vòm

họng [13, 21, 67] (2): Tính chất đa hình (polymorphisms) trên một số gen như

CYP2E1, GSTM1, GSTT1, p53… được chứng minh có liên quan đến quá trình phát sinh

khối u vòm họng, làm thúc đẩy quá trình sinh ung và đẩy nhanh tiến trình hình thành UTVH [12, 92, 206] (3): Các hiện tượng epigenetics bao gồm tính chất methyl hóa, sự

biến đổi histon và tính chất biểu hiện bất thường của các miRNAs cũng được nghiên cứu có vai trò quan trọng trong sự tăng sinh tế bào, apoptosis, biệt hóa, xâm lấn hay di

cư, cụ thể như tính chất methyl hóa trên một số gen RASSF1A, ZMNYD-10, hay sự biểu

hiện bất thường của các microRNA-155, microRNA-141 hoàn toàn tương quan mạnh với sự hình thành UTVH trên chính mẫu mô sinh thiết vòm họng người bệnh Việt Nam [64, 65, 70, 166] (4): Gen kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen Genes, HLA): Một phân tích tổng hợp trên cộng đồng người Trung Quốc cho thấy sự hiện diện của một số HLA nhóm 1 gồm HLA-A2, B14, B16, C11, B17, B46 có sự tương quan dương với nguy cơ mắc UTVH [14, 50, 164, 210] Sự hiện diện của các allele này làm giảm khả năng xử lý và trình diện các kháng nguyên của EBV, dẫn đến làm tăng nguy cơ phát triển UTVH [14] Ngược lại, HLA-A11, B13 và B22 lại có hiệu quả trong xử lý và trình diện kháng nguyên EBV, làm giảm nguy cơ mắc UTVH [151] Tóm lại, những người có allele HLA với chức năng trình duyện kháng nguyên kém sẽ dễ mắc UTVH hơn so với người lành

Rõ ràng, UTVH là một bệnh lý do một hoặc nhiều yếu tố nguy cơ kết hợp, tương tác qua lại với nhau, dẫn đến sự hình thành và phát triển của khối u vòm họng Mối tương quan giữa các yếu tố nguy cơ với sự hình thành UTVH được tóm tắt ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Mức độ tương quan giữa các yếu tố nguy cơ với bệnh UTVH

Yếu tố nguy cơ Mức tương quan Ghi chú Tài liệu tham khảo

Xâm nhiễm của EBV Mạnh Tương quan với type II và III

[135] Di truyền gia đình Mạnh

Yếu tố di truyền Mạnh

Kiểu gen HLA Trung bình – Mạnh Ít tương quan với HLA nhóm 2

Cá muối Trung bình – Mạnh

Hút thuốc Yếu – Trung bình Tương quan với UTVH type I

Formaldehyde Yếu – Trung bình

Khói bụi Yếu – Trung bình Tương quan với phơi nhiễm bụi gỗ Rượu Yếu – Trung bình

chính, thúc đẩy sự xâm nhiễm của EBV, hoặc mở đầu cho tiến trình sinh ung trong bệnh sinh của UTVH [10, 78] Bên cạnh đó, sự phối hợp của nhiều dấu chứng sinh học còn giúp cho chẩn đoán sớm UTVH với độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao [69] Một điều đáng lưu ý khác, việc phối hợp nhiều CCĐSH dựa trên tính chất biểu hiện của các gen còn có thể là một tổ hợp chỉ thị (phân tử) hữu ích, có tiềm năng ứng dụng, cung cấp các dữ liệu khoa học cho ngành khoa học Genomics,ứng dụng lâm sàng của dữ liệu Genome trong chẩn đoán sớm và nghiên cứu bệnh lý UTVH, biết được hệ thống gen của từng cá nhân và qua đó dùng thuốc tác động đặc hiệu vào các gen gây bệnh của người bệnh [58, 84, 170, 204, 217] Ngoài ra, sự hiểu biết chuyên sâu về các đường dẫn tín hiệu (phân tử) trong UTVH còn có thể giúp xác định thêm các dấu chứng sinh học mới trong chẩn đoán sớm và tiên lượng cũng như có thể ứng dụng phương pháp “nhắm trúng đích” trong việc điều trị cá thể ở những bệnh nhân mắc UTVH trong tương lai gần Do đó, trong nghiên cứu này, nguyên nhân di truyền được xét ở khía cạnh: tính chất biểu hiện bất thường của một số gen mục tiêu vừa là các phân tử đích trực tiếp của các miRNAs vừa là các chỉ thị phân tử độc lập đóng vai trò quan trọng như thế nào trong việc hình thành, phát triển khối u vòm họng sẽ được đề cập rõ (Bảng 1.4)

Bảng 1.4 Chức năng cụ thể và con đường tín hiệu của ba gen mục tiêu Tên gen Chức năng trong UTVH Con đường tín hiệu tham gia

Bcl-2

• Ức chế quá trình apoptosis • Thúc đẩy sự di cư

• Kháng lại hóa trị liệu (ciplastin)

Con đường tín hiệu: p53, PI3K-Akt, Apoptosis

PTEN

• Ức chế sự tăng trưởng, sống sót, tăng sinh, di cư, xâm lấn, cảm ứng sự sinh mạch

• Nhạy với liệu pháp xạ trị

Con đường tín hiệu: Akt/mTOR,

PI3K-Akt, HIF-1, Apoptosis, EMT

PDCD4 • Ức chế sự tăng sinh, sống sót, di cư, xâm lấn và di căn

Con đường tín hiệu: Apoptosis, FoxO, EMT, JNK, PI3K/Akt/mTor

• Nhạy với hóa trị liệu (cilastin) • Thúc đẩy quá trình apoptosis,

duy trì pha tiềm tan của EBV

1.2.1 Bcl-2 (B cell lymphoma 2) – nhân tố ức chế cơ chế tự thực bào và con

đường tín hiệu apoptosis

Bcl-2 (hay còn được gọi là B cell lymphoma 2), nằm trên nhiễm sắc thể số 18, vị

trí 18q21.33, là một thành viên thuộc họ Bcl-2, mã hóa protein với trọng lượng phân tử nặng 26 kD gồm 239 amino acids với một domain kỵ nước ở đầu C (C-terminus) cho phép nó định vị chủ yếu tại màng ngoài của ty thể, màng nhân và mạng lưới nội chất [179, 196] Bcl-2 là một protein được cấu thành bởi bốn domain khác nhau, bao gồm BH1 (nằm từ amino acid 136 đến 155), BH2 (amino acid 187 đến 202), BH3 (amino acid 93 đến 107), BH4 (amino acid 10 đến 30) và một lớp màng bán thấm nằm từ amino acid 230 đến 239 (Hình 1.6) Một số nghiên cứu cho thấy vùng Bcl-2 gồm bảy chuỗi xoắn alpha, bao gồm hai xoắn kỵ nước trung tâm (α1 và α2) được bao quanh bởi năm xoắn ốc lưỡng tính (α3, α4, α5, α6 và α7), các domain BH1, BH2 và BH3 nằm rất gần nhau và tạo thành khe hở kỵ nước để tương tác các thành viên khác trong họ Bcl-2 [24] Chức năng chủ yếu của gen này là duy trì sự sống sót của tế bào, bằng cách ức chế con đường tín hiệu apoptosis [133]

Hình 1.6 Cấu trúc protein của Bcl-2 [1]

Tùy vào số lượng sắp xếp của các domain mà chúng được phân làm hai loại chính yếu, là pro-apoptotic và anti–apoptotic, có chức năng kiểm soát sự chết tế bào theo chương trình thông qua việc điều hòa tính thấm màng ngoài của ty thể, dẫn đến con

đường apoptosis [133] Nhìn chung, những domain BH này đóng vai trò quyết định chức năng của các protein tạo thành, chẳng hạn ở những protein kháng apoptosis thường có đầy đủ cả 4 domain BH (Bcl-2, Bcl-XL), trong khi ở nhóm pro-apoptotic, các BH domain lại chia thành hai nhóm: (1), nhóm chứa nhiều domain (multi domain) như Bax, Bak,…và (2), nhóm chỉ chứa duy nhất một vùng domain BH3 (BH3 only) như Bim, Bid, BAD,…(Hình 1.7) Tóm lại, về cấu trúc tổng quát của họ Bcl-2 có một số đặc điểm phân tử đáng chú ý như sau: (1): Tất cả những protein của họ Bcl-2 đều chứa hoặc chỉ chứa domain BH1, BH2 BH3 hoặc BH4; (2): Tất cả các protein kháng apoptosis đều chứa domain BH1 và BH2, một số có thêm BH4 ở đầu N như Bcl-2, Bcl-w và Bcl-XL; (3): Đối với các pro-apoptotic protein, cấu trúc chúng đều chứa vùng domain BH3, cần thiết cho việc dimer hóa với những protein khác của họ Bcl-2 và đảm báo cho hoạt tính tiêu diệt tế bào, một số protein khác lại chứa thêm cả domain BH1 và BH2 như Bax và Bak; (4): Vùng domain BH3 cũng hiện diện ở một số anti-apoptotic protein như Bcl-2, trong khi domain BH3 lại là một α-helix lưỡng tính (có cả phần ưa nước lẫn kỵ nước), do đó, nếu được gắn vào các rãnh kỵ nước của các phân tử kháng apoptosis, sẽ làm mất đi khả năng duy trì sống sót của tế bào ở những phân tử này Như vậy, trong con đường apoptosis, các nhóm protein đặc biệt chỉ có mỗi domain BH3 (BH3 only) thường xuyên đối kháng chọn lọc (ức chế) sự biểu hiện của Bcl-2 thông qua việc gắn vào các túi kỵ nước của các protein này Đây cũng chính là cơ sở khoa học đầu tiên cho việc thiết kế các phân tử “giả dạng BH3” (BH3 mimetic) để ra đời nhóm thuốc ức chế Bcl-2 trong các loại ung thư ác tính [1, 156]

Hình 1.7 Cấu trúc protein của các thành viên họ Bcl-2 [24]

Nhiều nghiên cứu cho thấy: Bcl-2 là một gen sinh ung mã hóa cho protein có

chức năng kháng apoptosis của tế bào UTVH thông qua con đường ty thể, theo đó con đường này có thể được kích hoạt bởi các yếu tố kích thích như xạ trị, sự tổn thương DNA, và stress tế bào [42] Trong điều kiện có các yếu tố kích thích, Bcl-2 cư trú trên màng ty thể bên ngoài có thể mất ổn định thông qua sự giảm biểu hiện, theo đó, tỷ lệ giữa các chất proto-apoptotic và chất đối kháng apoptosis ngày càng lớn, gây ra sự lắp ráp các oligomers Bax, Bak ở màng ngoài ty thể [42, 120] Những oligomers này làm tổn thương tính thấm của màng, cho phép thành lập những kênh đầy protein ngoài màng [161] Kết quả là những nhân tố proto-apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể được phóng thích vào bên trong tế bào chất Trong số này, các Cytochrome c (Cyt c) hoạt hoá trực tiếp Apaf1 với sự hiện diện của dATP hoặc ATP, tạo điều kiện hình thành một phức hợp “apoptosome” [194] Thể apoptosome sau khi được hình thành sẽ tuyển lựa và điều biến quá trình tự hoạt hoá caspase khởi đầu (caspase 9), rồi tiếp tục hoạt hoá các caspase “thực thi” 3, 6 và 7, dẫn đến sự chết của tế bào (apoptosis) Một số yếu tố kích

thích khác như p53 hay Myc cũng có thể cảm ứng quá trình apoptosis thông qua việc phiên mã trực tiếp nhóm protein chỉ có BH3 (PUMA, NOXA, ), gây liên kết và ức chế Bcl-2 qua việc gắn vào domain BH3 của phân tử này, làm thúc đẩy cái chết của các phân tử dựa trên tính thấm hóa của màng ty thể [47] Trong con đường tín hiệu apoptosis cảm ứng bởi Bcl-2, Bcl-2 thường xuyên gắn với nhóm Bax, Bak thông qua vùng domain BH1 và BH2, hai vùng domain cần thiết cho chức năng ngăn chặn sự chết của Bcl-2, đóng vai trò trung tâm trong vai trò điều hòa âm tính quá trình apoptosis của hai phân tử này, làm ngăn cản sự phóng thích Cyt c ra khỏi ty thể, dẫn đến cơ chế kháng apoptosis [120, 126] Bên cạnh đó, các caspase 3 sau khi được hoạt hóa cũng có thể phân cắt tại các vị trí amino acid 34, 35 của Bcl-2, làm bất hoạt chức năng sinh ung của Bcl-2 Ngoài cơ chế chết tế bào theo chương trình, Bcl-2 còn chống lại sự tự thực bào (autophagy) bằng cách ức chế protein Beclin 1 (Atg6) cần thiết cho sự hình thành cơ chế tự thực bào [125], được mô tả ở hình 1.8

Hình 1.8 Con đường tín hiệu Apoptosis và sự tự thực bào cảm ứng bởi Bcl-2

Bcl-2 được phát hiện lần đầu tiên tại điểm gãy (breakpoint) do chuyển đoạn t(14,18) ở lympho nang (follicular lymphoma) cách đây 33 năm [83] Ngay từ trong tên gọi, đã cho thấy mối liên hệ mật thiết của gen mục tiêu này với cơ chế bệnh sinh của các nhóm bệnh lý dòng lympho Tuy nhiên, cũng có lẽ vì điều đó, hay ít nhất một phần, đã có sự “thiên vị” trong các nghiên cứu về vai trò của gen đích này trong các bệnh lý dòng

tủy Thậm chí, hàng loạt những bất thường trong Bcl-2 ở nhiều loại lympho còn đưa đến việc ứng dụng các các chất ức chế Bcl-2 trong điều trị lympho [130] Riêng trong UTVH, Bcl-2 vẫn là một protein sinh ung (onco-protein) với vai trò ức chế quá trình apoptosis [133] Một nghiên cứu của Lu và cộng sự (1993) cho thấy Bcl-2 được phát hiện lên đến 80% ở carcinome tế bào gai không sừng hóa ở vòm họng (type 3, loại UTVH hay gặp nhất trong bệnh nhân UTVH của Việt Nam) và hiện diện tỷ lệ thấp (33,33%) ở carcinome tế bào gai sừng hóa (type 1) [94] Ngoài ra, mức biểu hiện thấp của Bcl-2 cũng được ghi nhận trên mẫu lành Nhằm tìm hiểu rõ nét hơn các đặc điểm phân tử của Bcl-2 dẫn đến sự hình thành và phát triển của UTVH, một nghiên cứu của Sheu và cộng sự (1997) phân tích sự biểu hiện của Bcl-2 trên bốn loại mẫu sinh thiết: mẫu sinh thiết lành, mẫu sinh thiết lành bị viêm ở biểu mô vòm họng (không có u), mẫu sinh thiết loạn sản tiền xâm lấn mức độ cao (hình thức tổn thương tiền ung thư sớm nhất có thể nhận ra trong sinh thiết) và mẫu sinh thiết UTVH [146] Theo đó, sự biểu hiện của Bcl-2 đạt 80% trên mẫu UTVH, hoàn toàn tương đồng với nghiên cứu của Lu và cộng sự (1993), chiếm tới 71% trên mẫu sinh thiết loạn sản trầm trọng, và cao hơn có ý

nghĩa so với mẫu lành (p < 0,05) Điều này cho thấy sự tăng biểu hiện của Bcl-2 để

tránh apoptosis dường như xảy ra từ giai đoạn sớm và có thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung và tiến triển của UTVH khi được tìm thấy trên chính mẫu sinh thiết lành, cho đến mức độ nặng nhất của loạn sản mang tên ung thư biểu mô “tại

chỗ” (carcinoma in situ, là sự phát triển không kiểm soát của tế bào vòm họng nằm tại

vị trí ban đầu (trên màng đáy), chưa có biểu hiện xâm lấn đến nơi khác) và cuối cùng là mẫu UTVH Tương tự, một công trình tiêu biểu của Song và cộng sự (2006) thực hiện trên 164 mẫu lành (68 mẫu lành loạn sản, 45 mẫu sinh thiết lành tăng sản - mẫu có sự tăng kích thước của tổ chức và cơ quan nhưng chúng vẫn giữ trật tự sắp xếp bình thường trong mô (hyperplasia), 55 mẫu sinh thiết lành (được chẩn đoán không mắc UTVH) và 148 mẫu UTVH cho thấy sự tăng biểu hiện tăng của Bcl-2 chiếm 88,2% ở

mẫu UTVH không bị biệt hóa (type 3 UTVH) cao hơn có ý nghĩa so với mẫu lành (p <

0,001), làm tăng nguy cơ và tỷ lệ mắc UTVH với sự khác biệt có ý nghĩa giữa mẫu mô

sinh thiết bệnh và lành [33] Bên cạnh đó, sự tăng biểu hiện của Bcl-2 còn tương quan với giai đoạn bệnh, biểu hiện lên đến 92,5% ở giai đoạn III và IV Xét riêng về sự biểu hiện chuyên biệt của Bcl-2 trên từng loại sinh thiết, một sự khác biệt rất có ý nghĩa đã được quan sát thấy về mức độ biểu biện giảm của Bcl-2 trên chính mẫu lành và mẫu tăng sản so với mẫu UTVH Những kết quả này chỉ ra rằng quá trình tích lũy dần của sự bất hoạt của một số gen ức chế khối u, sự kích hoạt của Bcl-2 (gen sinh ung), cũng như tỷ lệ nhiễm EBV cao có liên quan chặt chẽ đến con đường hình thành và chuyển dạng UTVH từ các loại tổn thương biểu mô vòm họng cho đến UTVH [33] Quan sát trên mẫu lành, sự biểu hiện bất thường của Bcl-2 cao hơn một cách có ý nghĩa và thường xuyên quan sát thấy trên mẫu loạn sản hơn so với mẫu lành tăng sản, và phần trăm

dương tính biểu hiện của Bcl-2 cũng nhiều hơn ở mẫu loạn sản so với mẫu lành (p <

0,01) Nghiên cứu này cũng khẳng định Bcl-2 chính là một yếu tố nguy cơ trong quá

trình sinh ung Ngoài ra, ở một số công trình nghiên cứu tại các cộng đồng khác nhau trên thế giới cũng ghi nhận được tỷ lệ phát hiện của Bcl-2 đạt 89% trường hợp mắc UTVH người Nhật Bản [114], chiếm 75% mẫu mô mô đúc parrafin người Thái Lan [119], 76,49% ở ca mắc UTVH người Tây Ban Nha [174], 73% ở người mắc UTVH tại Bắc Phi [7], 75% trường hợp dương tính với sự biểu hiện của Bcl-2 ở UTVH trẻ em Argentina (pediatric carcinoma) [31] và 74,3% trường hợp mắc UTVH trên cộng đồng người Turkish [35], ngược lại, ở mẫu lành, tần số biểu hiện của gen này lại rất thấp Nhìn chung, sự tăng biểu hiện của Bcl-2 hoàn toàn tương quan dương với nguy cơ và tỷ lệ mắc bệnh UTVH, mối tương quan này có ý nghĩa về mặt thống kê

Ngoài sự biểu hiện độc lập của Bcl-2, thì một số hướng nghiên cứu kết hợp giữa

yếu tố nhiễm EBV (sự hiện diện của EBV, tính chất biểu hiện của LMP-1, EBER-1,2)

và yếu tố di truyền (sự tăng biểu hiện của Bcl-2) cũng đã được thực hiện [33, 119, 174] Theo đó, sự tăng biểu hiện của Bcl-2 trong các tế bào UTVH dương tính với EBV đã được chứng minh là cao hơn hẳn so với các mẫu âm tính EBV [193, 201] Do đó, mặc dù sự biểu hiện của Bcl-2 có thể không liên quan trực tiếp đến tính nhiễm EBV, tuy nhiên, Bcl-2 vẫn có thể hoạt động phối hợp với LMP-1 để thúc đẩy tăng trưởng tế bào

khối u vòm họng nhanh hơn so với Bcl-2 hoạt động đơn lẻ [146] Thậm chí, một số tổ nhóm chỉ điểm sinh học (CCĐSH) có chứa Bcl-2 cũng được tiến hành nghiên cứu, có ứng dụng tiềm năng trong chẩn đoán sớm, đặc biệt là ứng dụng trong tiên lượng, hay các đáp ứng điều trị cũng được ghi nhận, chẳng hạn như tổ hợp có Bcl-2 và p53 - các

chỉ thị phân tử của con đường apoptosis Gen ức chế khối u p53 (tumor supressor gene)

là một gen quan trọng có vai trò điều hòa chu kỳ của tế bào (91) Công bố đầu tiên của Sheu và cộng sự (1997) cho thấy có đến 77% mẫu sinh thiết UTVH có sự đồng biểu hiện của p53 và Bcl-2, và sự tương quan này dường như xảy ra ở giai đoạn sớm trong tiến triển của bệnh, ngụ ý về sự tăng biểu hiện của Bcl-2 và thay đổi chức năng của p53 đóng một vai trò quan trọng trong bệnh sinh của UTVH [146] Tuy nhiên, một công bố thực hiện trên người mắc UTVH Nhật Bản lại cho thấy không có sự tương quan giữa Bcl-2 và p53 dù có 50% trường hợp mắc UTVH dương tính với sự biểu hiện cả hai gen này [114] Dữ liệu này ngụ ý, cơ chế tăng biểu hiện của Bcl-2 trong con đường tín hiệu apoptosis có thể phụ thuộc, hoặc không phụ thuộc vào p53 Một công bố tiêu biểu của Fan và cộng sự (2006) cho thấy sự biểu hiện bất thường của p53 có tương quan với sự

biểu hiện của Bcl-2 và EBER-1, sự tương quan này được cho là có ý nghĩa thống kê (p

= 0,01) [33] Về tiến trình sinh ung, mức độ biểu hiện của p53 và EBER-1 được cho là

cao hơn một cách có ý nghĩa ở mẫu UTVH so với mẫu loạn sản, tăng sản và mẫu lành

(p < 0,001), đồng thời, ở mẫu lành, một sự khác biệt có ý nghĩa được quan sát trên mẫu

loạn sản (tổn thương tiền ung thư) so với mẫu tăng sản (EBER-1), và mẫu tăng sản so với mẫu lành (đối với p53) [33] Như vậy vai trò của EBV trong sự tiến triển của UTVH ban đầu đã được xác định, sự biểu hiện của phơi nhiễm EBV được tìm thấy trên mẫu UTVH và loạn sản cao hơn so với mẫu tăng sản một cách chặt chẽ, cho thấy tính nhiễm EBV trong tiến trình sinh ung của UTVH có thể xuất hiện từ giai đoạn loạn sản, theo đó, EBV có thể đóng vai trò là một bước quan trọng trong tiến trình chuyển đổi của các tổn thương tiền UTVH sang UTVH Như đã đề cập, UTVH là một bệnh lý ác tính với sự tương tác lẫn nhau của nhiều yếu tố, cụ thể ở đây là yếu tố nhiễm và một số bất ổn di truyền trong cơ chế sinh ung của UTVH Hay nói cách khác, trong giai đoạn sớm nhất

của tiến trình sinh ung, sự tăng biểu hiện quá mức của p53 có thể là sự thay đổi chính trong giai đoạn tế bào biểu mô vòm họng bình thường sang tế bào tế bào biểu mô tăng sản, trong khi từ giai đoạn tăng sản sang loạn sản lại chủ yếu phụ thuộc vào sự biểu hiện cao của EBV (sự tăng biểu hiện của EBER-1,2) và tăng biểu hiện vượt mức của Bcl-2, và ở giai đoạn cuối từ loạn sản sang UTVH lại đến từ sự tăng biểu hiện bất thường của p53 với tính nhiễm cao của EBV (Hình 1.9) Tóm lại, sự biểu hiện bất thường của các gen trên NST có thể xảy ra trước sự xâm nhiễm của EBV, đóng vai trò là nhân tố thúc đẩy tính nhiễm của EBV, có tiềm năng trong chẩn đoán sớm, sàng lọc và tiên lượng trong UTVH [33]

Hình 1.9 Sơ đồ mô tả bệnh sinh cơ bản của UTVH

Bên cạnh việc xác định Bcl-2 là một yếu tố nguy cơ trong chẩn đoán sớm UTVH, thì Bcl-2 còn được nhìn nhận là một yếu tố tiên lượng kém và độc lập ở những bệnh nhân mắc UTVH [35] Về mặt lý thuyết, gen Bcl-2 dẫn đến sự kháng xạ trị và tiên

lượng xấu thông qua hai cơ chế: (1), ngăn chặn quá trình apoptosis tự phát, dẫn đến sự sống sót và tích lũy nhanh chóng các tế bào khối u vòm họng và (2), làm cản trở các điều trị liên quan đến apoptosis, bất kể loại trị liệu được sử dụng Theo đó, hai công trình nghiên cứu lần lượt của Sempere và Sarac cho thấy sự biểu hiện của Bcl-2 hoàn toàn tương quan với tỷ lệ sống sót kém ở những bệnh nhân mắc UTVH, sự tương quan này rất có ý nghĩa thống kê, ngoài ra sự đồng biểu hiện của cả hai phân tử Bcl-2 và LMP-1 còn tương quan mạnh với sự di căn của hạch bạch huyết so với mẫu không có di căn của hạch [137, 174] Công bố của Yu và cộng sự (2003) cho thấy ở nhóm bệnh