khảo sát tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây cúc xuyến chi sphagneticola trilobata l pruski

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

GVHD : ThS DƯƠNG NHẬT LINH SVTH : ĐÀM THỊ PHÚC

MSSV :1253010281 LỚP: DH12VS01

TP.Hồ Chí Minh, năm 2016

Bài khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và các bạn Em xin gửi lời cảm ơn đến:

Ban Giám hiệu, quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian học tập tại trường làm cơ sở để em thực hiện đề tài nghiên cứu

Cô Dương Nhật Linh, đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em những kinh

nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành đề tài trong suốt thời gian thực hiện

Chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, chị Trần Thị Á Ni đã cho những ý kiến đóng góp

quan trọng trong quá trình tìm hiểu vấn đề, cảm ơn các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Các bạn lớp DH12VS01, đã quan tâm và chia sẻ cùng tôi quãng đời sinh viên nhiều kỉ niệm đẹp và đáng nhớ

Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ, cảm ơn gia đình, người thân và các anh chị

luôn chăm lo, ủng hộ, tin tưởng, khích lệ con những lúc khó khăn và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để con được yên tâm học hành, nghiên cứu

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến các Thầy Cô khoa CNSH, chúc các Thầy Cô gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống và trên con đường giảng dạy

Xin chân thành cảm ơn !

Bình Dương, năm 2016 Sinh viên thực hiện

Đàm Thị Phúc

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang i

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

1.1 Tổng quan về vi sinh vật nội sinh 4

1.1.1 Sơ lược về vi sinh vật nội sinh 4

1.1.2 Phân loại vi sinh vật nội sinh 5

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố và đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh 5

1.1.4 Quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật 6

1.1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

1.1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8

1.2 Tổng quan về cây Cúc Xuyến Chi 9

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang ii

1.4.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation) 17

1.4.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) 18

1.4.3 Kỹ thuật chiết Sohxlet 19

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Vật liệu 21

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2.2 Thiết bị 21

2.2.3 Môi trường và hóa chất 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 22

2.3.2 Xác định tên khoa học của cây dược liệu 22

2.3.3 Quy trình thu nhận mẫu 23

2.3.4 Quy trình xử lí mẫu 23

2.3.5 Quy trình chiết xuất cao dược liệu 23

2.3.6 Phân lập vi khuẩn nội sinh 27

2.3.7 Bảo quản chủng vi khuẩn nội sinh 28

2.3.8 Định tính khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh 29

3.1 Giám định tên khoa học cây dược liệu 32

3.2 Chiết cao 32

3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết thu được từ lá Cúc Xuyến Chi 32

3.2.2 Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 34

3.3 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn của cao chiết 34

3.4 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh: 37

3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn nội sinh 41

4.1 Kết luận 43

4.2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 48

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth PDA Potato Dextrose Agar TSA Trypticase Soy Agar

Cs Cộng sự

P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

SDA Sabouraud Dextrose Agar

S aureus Staphylococcus aureus S typhi Samonella typhi

E.coli Escherichia coli

ANOVA: One –way analysis of variance

CFU Colony forming unit –đơn vị hình thành khuẩn lạc DMSO Dimethyl sulfoxid

SDA Sabouraud Dextrose Agar SE Standard Error

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây Cúc Xuyến Chi (Nguồn: Neelam Balekar và cs., 2014) 9

Hình 1.2 Escherichia coli 14

Hình 1.3 Salmonella typhi 15

Hình 1.4 Staphylococcus aureus 15

Hình 1.5 Pseudomonas aeruginosa 16

Hinh 2.1 Minh họa kết quả vòng kháng khuẩn của cao chiết 27

Hình 3.1 Khả năng kháng một số chủng vi khuẩn bệnh của các loại cao chiết từ lá 35

Hình 3.2 Hình quan sát đại thể chủng BDL3 37

Hình 3.3 chủng BDL5 38

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang v

Chi 38Bảng 3.5 Kết quả quan sát vi thể của chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Cúc

Xuyến Chi 39

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm 22 Sơ đồ 2.2 Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu 24

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang vii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết thu được từ

lá Cúc Xuyến Chi 33 Biểu đồ 3.2 Kết quả kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Cúc Xuyến Chi 36

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ thời xa xưa ông cha đã biết sử dụng và bào chế ra những phương thuốc y học cổ truyền từ dược liệu có nguồn gốc từ tự nhiên Ngày nay cùng với sự phát triển của hóa học và dược học, một số chất có trong thực vật được phân lập, tinh chế, xác định tính chất hóa học và tác dụng dược lí Tuy nhiên đối với thuốc có nguồn gốc hóa dược, ngoài những ưu điểm nổi bật như hiệu quả điều trị nhanh, dễ sản xuất, dễ sử dụng và bảo quản, thì vấn đề hạn chế lớn nhất cần quan tâm đó là những tác dụng phụ và độc tính kèm theo, đặc biệt trong những trường hợp điều trị lâu dài đối với bệnh nhân mãn tính Vì vậy, ngày nay người ta thường có xu hướng trở về với tự nhiên, tìm kiếm ra các nguồn thảo dược sẵn có mà lại ít gây độc đối với con người hơn Theo Venkatesh.U và cs (2016) có khoảng 35.000 loài thực vật đã và đang được sử dụng cho mục đích y tế trên khắp thế giới (Venkatesh.U và cs., 2016) Để giải quyết vấn đề đó thì việc tìm ra các hợp chất có nguồn gốc thực vật có khả năng chữa bệnh là rất cần thiết Bên cạnh đó, một số hướng nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng vi khuẩn nội sinh thực vật có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh đó là nguồn chất kháng khuẩn kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc điều trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh

cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới Nghiên cứu cơ chế sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel và cs., 2004).

Hiện nay, có những loại thực vật rất thông dụng trong dân gian có tác dụng trị liệu không kém gì so với các loại thuốc tân dược hiện đại Một trong những cây điển hình là cây Cúc Xuyến Chi, cây còn có tên gọi khác là cúc mặt trời, tên khoa

học là Sphagneticola trilobata (L.) Pruski, là cây trang trí nền, trồng thành thảm,

cho hoa vàng, sức sống mạnh Trong cây Cúc Xuyến Chi có một số hoạt chất sinh học như: tanin, saponin, flavonoid, phenol, terpenoids …được nghiên cứu là có khả năng chống oxy hóa, giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn và làm lành vết thương

con người và động vật chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây Cúc Xuyến Chi

(sphagneticola trilobata (l.) pruski )

Nội dung thực hiện bao gồm :

- Tiến hành và sàng lọc vi khuẩn nội sinh trong cây Cúc Xuyến Chi - Chiết xuất cao dược liệu từ lá cây Cúc Xuyến Chi

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm

- Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm.

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 3

PHẦN I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 4

1.1 Tổng quan về vi sinh vật nội sinh

1.1.1 Sơ lược về vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh (Endophyte) là những vi sinh vật sống trong mô tế bào của cây chủ Không biểu hiện ra bên ngoài và không gây tác động tiêu cực đến thực vật (Holliday, 1989; Schulz & Boyle, 2006) Các nhóm khác nhau của các sinh vật như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và mycoplasma được báo cáo như là vi sinh vật nội sinh Trong đó, nấm và vi khuẩn là hai loại được phân lập nhiều nhất Trong thế kỷ XX, nghiên cứu về các loại nấm nội sinh được thực hiện ở một quần thể sinh học, giới hạn cho ba họ thực vật: Coniferaeceae, Ericaceae và Gramineae Hầu hết tất cả các loài thực vật (khoảng 300.000) chứa một hoặc nhiều vi sinh vật nội sinh (Strobel và cs, 2004) Nơi vi sinh vật nội sinh xâm nhập vào hình thành các mối quan hệ khác nhau bao gồm cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… Hầu hết các dạng nội kí sinh này bắt đầu từ vùng rễ hay bề mặt lá tuy nhiên một số loại có thể kí sinh trên hạt (Robert P Ryan và cs., 2007) Vi sinh vật nội sinh thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây chủ do tạo ra được một hàng rào kiểm soát sinh học bằng việc tiêu diệt trực tiếp các mầm bệnh đã xâm nhập vào cây chủ Do đó cây chủ không bị bệnh hoặc bị bệnh ở mức độ nhẹ đến trung bình phân lập được vi khuẩn nội sinh kháng nấm gây bệnh trong khi đó cây bị bệnh ở mức độ nặng, rất nặng hoàn toàn không có vi sinh vật nội sinh kháng nấm gây bệnh (Vũ Văn Định, 2008)

Bên cạnh đó, vi sinh vật nội sinh còn có tiềm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử độc trên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trình phosphate và cố định đạm Vi sinh vật nội sinh còn có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian qua đó tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới Nghiên cứu cơ chế sản sinh các chất chuyển hoá mới trong sự đa dạng của vi sinh vật nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel và cs.,2004) Cùng với việc sản xuất các chất mới vi sinh vật nội sinh đã cho thấy khả năng làm giảm các chất ngoại sinh (xenobiotic) hay có thể hoạt động như các vector mở đầu cho quá trình đó Chúng có khả năng kháng kim loại nặng, khảng khuẩn và làm giảm các gốc hữu cơ thông

1.1.2 Phân loại vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh được chia thành hai loại chính: vi sinh vật nội sinh bắt buộc và vi sinh vật nội sinh tuỳ ý Vi sinh vật nội sinh tuỳ ý có khả năng tồn tại trong đất, trên bề mặt cây trồng, bên trong thực vật cũng như trên các chất dinh dưỡng nhân tạo (Baldani và cs., 1997) và vi sinh vật sống bên trong mô thực vật trong suốt vòng đời của chúng được gọi là vi sinh vật nội sinh bắt buộc (Stoltzfus và cs., 2000) Vi sinh vật nội sinh tuỳ ý được phân bố rộng rãi trên toàn giới thực vật và có thể được phân lập từ các loài thực vật khác nhau Vi sinh vật nội sinh cũng được báo cáo là có ở cả một số loài thực vật và cây con nuôi cấy in vitro

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố và đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh

Bằng chứng về mối quan hệ giữa vi sinh vật và thực vật được tìm thấy trong các mô hóa thạch của thân và lá đã chứng minh rằng các mối quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật có thể đã tiến hóa từ thời thực vật bậc cao đầu tiên xuất hiện trên Trái Đất (Redecker và cs., 2000) Sự tồn tại của nấm bên trong các cơ quan của thực vật mà không gây triệu chứng đã được biết đến từ cuối thế kỷ XIX và thuật ngữ ''endophyte'' lần đầu tiên được De Bary đề xuất vào năm 1866 (De Bary, 1866) Kể từ khi vi sinh vật nội sinh được mô tả lần đầu tiên trong cây cỏ mọc lẫn với lúa

(Lolium temulentum) (Freeman, 1904) Vi sinh vật nội sinh có thể được phân lập từ

các cơ quan khác nhau của các loài thực vật khác nhau (Arnold, 2007), cho đến nay, tất cả các loài thực vật nghiên cứu đã được tìm thấy chứa ít nhất một vi sinh vật nội sinh

Để tự bảo vệ mình trước những tác động của môi trường, các vi khuẩn nội sinh tạo thành những ổ vi khuẩn, xâm chiếm và nội sinh trên đốt cây Những vi khuẩn này thường di chuyển đến vùng không gian ở giữa các tế bào, chúng có thể được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả hạt giống (Posada và cs.,

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 6

2005) Vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây một lá mầm tới cây hai lá mầm, từ những loài cây thân gỗ, như gỗ sồi và lê, cây thân thảo tới cây lương thực như củ cải đường và ngô Những nghiên cứu cổ điển về sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh chỉ tập trung vào phương pháp phân lập chúng từ các mô nội sinh sau khi khử trùng bề mặt thực vật với hypochlorite natri hoặc các hóa chất tương tự (Miche và cs., 2001) Một nghiên cứu của Lodewyckx và cộng sự (2002) nêu lên phương pháp phân lập và mô tả đặc điểm vi khuẩn nội sinh từ các loài thực vật khác nhau Dựa trên nền tảng nghiên cứu của Hallmann và cộng sự (1997); Lodewyckx và cộng sự (2002), Berg và Hallmann (2006) đã công bố một danh sách đầy đủ của vi khuẩn nội sinh được phân lập từ một loạt các bộ phận của cây

Có khoảng 300.000 loài thực vật tồn tại trên Trái Đất, mỗi loài là một cây chủ cho một đến nhiều các dạng nội sinh cư trú Chỉ có một số loài thực vật được nghiên cứu hoàn chỉnh về các mối quan hệ nội sinh của chúng Do đó cơ hội nghiên cứu và tìm ra các dạng nội sinh mới và có lợi trong sự đa dạng sinh học của các hệ sinh thái khác nhau là đáng kể (Strobel và cs., 2003)

1.1.4 Quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật

Vi sinh vật nội sinh xuất phát từ một bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây Trên cây có những hệ vi sinh vật trong đó có những chủng tồn tại và chỉ gây bệnh khi cây già yếu hoặc điều kiện bất lợi Sự tương tác giữa thực vật chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh thành những chủng vi sinh vật hữu ích Vi sinh vật nội sinh là một tác nhân cân bằng hệ vi sinh vật trên thực vật chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh vật gây bệnh (Strobel, 2003) Vi sinh vật nội sinh được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật trên Trái Đất, chúng cư trú ở trong nội mô và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh, tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh,…Các dạng nội kí sinh này đa phần xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá Tuy nhiên, một số loài có thể kí sinh trong hạt Vi sinh vật nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò như một tác nhân điều hòa sinh học (Strobel, 2003) Những tương tác có lợi giữa thực vật – vi sinh vật nội sinh như thúc đẩy sự phát triển, tăng sức đề kháng của cây

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 7

trồng, vấn đề này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm như nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở các dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế (Phạm Quang Thu và cs., 2012) Vi sinh vật nội sinh cư trú trong các mô của thực vật sống, được nghiên cứu và có tiềm năng của sản phẩm tự nhiên mới để khai thác trong y học, nông nghiệp và công nghiệp Có khoảng 300 000 loài thực vật tồn tại trên Trái Đất, mỗi loài là một ký chủ cho một đến nhiều dạng nội sinh cư trú Chỉ có một số loài thực vật được nghiên cứu hoàn chỉnh về mối quan hệ nội ký sinh của chúng Do đó cơ hội nghiên cứu và tìm ra các dạng nội ký sinh mới và có lợi trong sự đa dạng sinh học của các hệ sinh thái khác là rất đáng kể (Strobel, 2003) Vi sinh vật nội sinh cư trú trong hệ sinh thái thích hợp tương tự như các chồi mầm ở thực vật, điều này làm cho chúng trở thành các tác nhân kiểm soát sinh học (Berg và cs., 2005) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật nội sinh có khả năng kiểm soát mầm bệnh trên thực vật Năm 2009, Gazis và cộng sự đã phân lập vi khuẩn nội sinh mới kiểm soát sinh học chống

lại các tác nhân gây bệnh rụng lá trên cây cao su (Hevea brasiliensis) tại Peru

Trong một số trường hợp vi khuẩn nội sinh đẩy mạnh tốc độ nảy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật (Chanway, 1997) Bên cạnh đó, vi sinh vật nội sinh còn có khả năng ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới Nghiên cứu chế phẩm sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả cả bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel và cs., 2003) Trên thế giới có vô số loài thực vật với số lượng khổng lồ, do đó không thể đưa vào thí nghiệm một cách chủ quan hay ngẫu nhiên Vì vậy, cần có nguyên tắc lựa chọn nhất định, phù hợp với mục đích để có được nguồn vi sinh vật nội sinh hữu ích, có tính ứng dụng cao (Strobel và cs., 2003)

1.1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước

Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong các loài cây ở Việt Nam như Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi (2009) đã phân lập được vi khuẩn nội sinh trong

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 8

cây bắp trồng trên đất xám Tây Ninh, Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng (2010) phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An và huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng, 2010) Vũ Văn Định (2008) phân lập vi khuẩn nội sinh có khả

năng phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai (Acacia auriculiculiformis x Acacia mangium) do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.; Phạm

Quang Thu, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Xuân Hưng và Nguyễn Văn Nam (2012) nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây

bệnh ở các dòng keo tai tượng (Acacia mangium) 1.1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng vi sinh vật nội sinh gây tác động có lợi trên các cây chủ Chẳng hạn như vi khuẩn nội sinh kích thích tăng trưởng thực vật, cố định đạm (Kirchhorf và cs., 2000), đề kháng với chất cảm ứng thực vật của tác nhân gây bệnh (Chen và cs.,1995)

Nghiên cứu của Chanway (1997) chỉ ra rằng trong một số trường hợp chúng có thể đẩy mạnh tốc độ nẩy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật

Ngoài ra còn có một số vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ cây họ đậu như cỏ linh lăng (Gagne và cs., 2000), cỏ ba lá (Sturz và cs., 2002) và hạt đậu (Elvira-Recuenco và van Vuurde, 2000) Như năm 2002, Sturz và cộng sự đã chỉ ra rằng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ sự đa dạng lớn của thực vật Năm 1985 Laydon và cộng sự, chỉ ra rằng nấm nội sinh thuộc họ Xylariacea có khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong vật chủ của chi Fagus và các chất này ảnh hưởng đến các ấu trùng bọ cánh cứng Theo Sherwood-Pike và cộng sự (1986) đã mô tả trong

gỗ sồi (Quercus sp.), nấm Rhabdocline parkeri nội sinh chống lại côn trùng Contarinia sp (Sherwood-Pike và cs.,1986)

Hiện nay, việc sử dụng vi sinh vật để phòng trừ bệnh cây ở trên thế giới đã được nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất đạt hiệu quả cao (Robert P Ryan và cs.,2007) Bởi những lợi ích mà vi sinh vật nội sinh mang lại, nhiều công trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh được thực hiện nhằm tìm ra những vi sinh vật có

- Tên khoa học: Sphagneticola trilobata (L.) Pruski

- Tên gọi khác: Sài ba thùy Thuộc họ cúc (Compositae hay Asteraceae)

- Vị trí phân loại - Giới : Plantae

- Nghành : Magnoliophyta - Lớp : Magnoliophyta - Bộ : Asterales

- Họ : Asteraceae - Chi : Sphagneticola

- Loài : Sphaneticola trilobata

Hình 1.1 Cây Cúc Xuyến Chi (Nguồn: Neelam Balekar và cs., 2014)

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cây thân thảo, bò hoặc leo Bao phủ trên mặt đất từ khoảng 15-30 cm, bò dài khoảng 2 m Thân cây màu xanh lục hoặc màu đỏ có thể có những lông thô Lá có chiều dài từ 2-4 cm và rộng từ 1,5-2,5 cm nhọn ở đỉnh có cuống hoặc không có cuống ở đáy Lá đơn, mọc đối, thường có 3 thùy không đều nhau, phiến lá hình răng cưa Hoa đơn xuất hiện ở ngọn thân hay nách cành có từ 2-4 lá bắc bao bên ngoài hình thành một lớp bọc ngoài phía bên dưới hoa Hoa có màu vàng nhạt mỗi hoa có từ 8-13 cánh, có nhụy nhỏ Quả hình thuôn dài trên cùng một vòng tua ngắn bế quả

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 10 màu nâu và có cấu trúc bề mặt xù xì bao phủ quả khô và cứng (Neelam Balekar và cs., 2014)

1.2.3 Phân bố

Cây có nguồn gốc xuất xứ từ Mexico, Trung Mỹ (Belize, Costa Rica, Guatemala, Honduras, Nicaragua và Panama) và khắp vùng Caribbean, mọc hoang ở Trinidad, Puerto Rico, Cộng hòa Dominica, Jamaica, Panama và các vùng nhiệt đới Nam Mỹ (ở Guiana thuộc Pháp, Guyana, Surinam, Venezuela, Brazil, Bolivia,Colombia, Ecuador và Peru) Cây du nhập vào các nước Nam Phi, Florida, Louisiana, Hawaii, Puerto Rico và quần đảo Virgin Mọc nhiều ở các vùng có khí hậu nhiệt đới trên thế giới, bao gồm cả Australia (Đông Nam Queensland và đông bắc New South Wales), quần đảo Thái Bình Dương (American Samoa, Cook Islands, Fiji, French Polynesia, Guam, Kiribati, quần đảo Marshall, Nauru, Niue, New Caledonia, Palau, Tây Samoa, Tonga và Hawaii), Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Ấn Độ, Papua New Guinea Hiện nay cây phân bố nhiều ở Việt Nam chủ yếu được trồng làm nền tạo thảm cây lớn trong các công viên, khu giải trí hay ven đường (Neelam Balekar và cs., 2014)

1.2.4 Công dụng

Cúc Xuyến Chi từ lâu đã được sử dụng như thuốc thảo dược truyền thống ở Nam Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ trong điều trị nhiều loại bệnh Nhiều báo cáo dược học cho rằng loại thực vật này có khả năng chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn, làm lành vết thương, kháng u, điều trị tiểu đường và các vấn đề về sinh sản ở phụ nữ Vì vậy, Cúc Xuyến Chi là nguồn thảo dược có tiềm năng lớn cho các nghiên cứu sinh học khác nhau đặc biệt là khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và các ảnh hưởng của chúng lên hệ thống sinh sản (Neelam Balekar và cs., 2014)

❖ Một số bài thuốc từ cây Cúc Xuyến Chi

- Chữa rôm sảy ở trẻ em: Cúc Xuyến Chi vò nát, pha nước tắm cho trẻ

- Chữa sốt cao: Cúc Xuyến Chi 20-50 g, giã nát pha với nước uống, bã đắp vào lòng bàn chân

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 11 - Chữa sốt xuất huyết: Cúc Xuyến Chi tươi 30 g, kim ngân hoa 20 g, lá trắc bá

(sao đen ) 20 g, củ sắn dây 20 g, hoa hòe 16 g, cam thảo đất 16 g Sắc uống ngày một thang Nếu sốt cao, khát nhiều, thêm củ tóc tiên 20 g

- Chữa viêm cơ (bắp chuối ): Cúc Xuyến Chi 50 g, bồ công anh 20 g kim ngân hoa 20 g, cam thảo đất 16 g Sắc uống ngày một thang Kết hợp với Cúc Xuyến Chi tươi, giã nát đắp tại chỗ sưng đau

- Chữa viêm tuyến vũ: Cúc Xuyến Chi 50 g, bồ công anh 20 g, kim ngân hoa 20 g, thông thảo 20 g, cam thảo đất 16 g Sắc uống ngày một thang

- Chữa viêm bàng quang: Cúc Xuyến Chi tươi 30 g, bồ công anh 20 g, mã đề 20 g, cam thảo đất 16 g Sắc uống ngày một thang

- Chữa nhọt: Cúc Xuyến Chi 30 g, kim gân hoa, lá 15 g, thổ phục linh 10 g, bồ công anh 20 g Sắc uống ngày một thang

- Chữa mụn, lở, chàm: Cúc Xuyến Chi 30 g, kim ngân hoa, lá 15 g khúc khắc 10 g, ké đầu ngựa 12 g, cam thảo đất 16 g Sắc uống ngày một thang Xuyến Chi giã nát, đắp lên mụn lở cũng tốt

- Dự phòng bệnh sởi hoặc bạch hầu: dùng 30-50 g cây khô, dạng thuốc sắc Liên tục trong 3-5 ngày

- Bệnh ban độc, ban trái ở trẻ: Cúc Xuyến Chi 3 g, cỏ mực 4 g, nhãn lồng 4 g, bạc hà 4 g, thạch cao 2 g Sắc uống , chia làm 3 lần trong ngày

1.2.5 Tác dụng dược lí

Theo Meena A.K và cộng sự (2011), các hợp chất thứ cấp chủ yếu trong cây cúc xuyến chi là tanin, saponin, flavonoid, phenol, terpenoids …được nghiên cứu là có khả năng chống oxy hóa, giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn và làm lành vết thương

❖ Hợp chất flavonoid có trong cây Cúc Xuyến Chi:

- Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ (Min và cs, 2010)

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 12 - Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol (Ye và cs, 2004)

- Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư: methoxy-3',5'-dimethylchalcone phân lập từ nụ vối có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư với các dòng tế bào ung thư khác nhau (Nguyễn Thị Kim Tuyến và cs, 2010)

2',4'-dihydroxy-6' Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng ức chế maltase đường ruột làm giảm đường huyết trên chuột gây bệnh tiểu đường (Nguyễn Quốc Tuấn, 2012)

- Tác dụng chống oxy hóa: ức chế các enzym α-glucosidase

- Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid như quercetin, kaempferol, tamarixetin được phân lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase (Nguyễn Thị Dung và cs, 2008)

❖ Hợp chất saponin có trong cây Cúc Xuyến Chi:

- Giảm Cholesterol: Saponin liên kết với muối mật và cholesterol trong đường ruột Muối mật hình thành các mixen nhỏ với cholesterol tạo thuận lợi cho sự hấp thụ của nó

- Giảm nguy cơ ung thư: Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponin có khả năng chống ung thư và làm giảm hoạt tính đột biến, có thể giảm nguy cơ ung thư ở người, bằng cách ngăn chặn tế bào ung thư phát triển Saponin có thể phản ứng với các tế bào giàu cholesterol của các tế bào ung thư Do đó hạn chế sự tăng trưởng và khả năng tồn tại của các tế bào này Ngoài ra, các nhà nghiên cứu còn phát hiện ra rằng saponin có thể giúp ngăn ngừa ung thư ruột kết

- Tăng cường khả năng miễn dịch: Các saponin có khả năng chống lại nhiễm trùng, giúp cải thiện hệ thống miễn dịch chống lại vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể

- Chất chống oxy hóa: Giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư và tim mạch nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol

Wedelolactone

15α-(cinnamoyloxy)- 16-en-19-oic acid

- Họ: Enterobacteriaceae

- Chi: Escherichia Hình 1.2 Escherichia coli - Loài: Escherichia coli (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

E coli là trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình từ 2 – 3 µm x 0,5 µm;

trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh)

vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng E coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông

và có khả năng di động

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu

khí tùy nghi, nhiệt độ từ 5 – 40oC Trong điều kiện thích hợp E coli phát triển rất

nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút

E coli là vi khuẩn thường trú ở đường tiêu hóa của người, có thể được tìm thấy ở đường hô hấp trên hay đường sinh dục E coli đứng đầu trong các vi khuẩn

gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết

E coli có khả năng gây bệnh khi xâm nhập vào những vị trí trong cơ thể mà

bình thường chúng không hiện diện

E coli hội sinh có trong phân người khỏe mạnh chỉ gây bệnh khi có dị vật

hay hệ thống miễn dịch của ký chủ bị suy yếu

E coli gây bệnh đường ruột Tác nhân gây bệnh qua đường tiêu hóa bất cứ

khi nào ký chủ nuốt vào đủ số lượng vi khuẩn Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 15

1.3.2 Salmonella typhi

Phân loại như sau:

- Phân ngành: Proteobacteria - Lớp: Gamma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales

- Họ: Enterobacteriaceae

- Loài: Salmonella typhi (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012) Khả năng gây bệnh của S typhi: Gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh

thương hàn Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3.3 Staphylococcus aureus

Phân loại như sau: - Giới: Prokaryote

- Phân ngành: Firmicute - Lớp: Firmibacteria - Họ: Micrococceae

S aureus gây ra hai loại hội chứng nhiễm độc và nhiễm trùng:

Nhiễm độc có thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S aureus

(độc tố) mà không cần có sự hiện diện của vi khuẩn, như hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng phỏng ngoài da, hội chứng ngộ độc thức ăn

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 16

Nhiễm trùng là do S aureus xâm nhập vào cơ quan bảo vệ của vật chủ khi bị

tổn thương hay giảm chức năng, như nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng hệ hô hấp, nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, nhiễm trùng xương…

S aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người Thường

xảy ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng như viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

1.3.4 Pseudomonas aeruginosa

Phân loại như sau:

- Phân ngành: Proteobacteria - Lớp: Gamma Proteobacteria - Bộ: Pseudomonadales

- Họ: Pseudomonadaceae

- Chi: Pseudomona Hình 1.5 Pseudomonas aeruginosa - Loài: Pseudomonas aeruginosa (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn,

hai đầu tròn, dài 1 - 5 µm, rộng 0,5 - 1 µm, ít khi có vỏ có một ít lông ở một đầu, di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram âm Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10

lạc: một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên, một loại khác thì xù xì

Khả năng gây bệnh của P aeruginosa:

- Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như: khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hay mãn tính khi dùng corticoid lâu dài, hoặc khi sử dụng kháng sinh tùy tiện… Chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài,

viêm loét giác mạc P aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng,

vết thương, xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 17 - Trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh) Khi có điều kiện thuận lợi chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm phế quản, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xương tủy (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.4 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu

Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được chế bằng cách cô đặc hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ cao dược liệu thực vật hay động vật với dung môi thực vật Các dược liệu khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp)

❖ Cao dược liệu được chia thành ba loại:

- Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trò dung môi chính Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế

Trong thực nghiệm việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn – lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet, chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method), … (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation)

Dụng cụ: bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van

khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 18 hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết

Tiến hành:

Bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm, mẫu không được xay quá mịn hay có tính nhầy nhụa hoặc có thể trương nở… sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt

Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này

Ưu điểm: dược liệu được chiết kiệt, giữ được hoạt tính

Nhược điểm: năng suất thấp, thủ công, phức tạp, tốn dung môi (Từ Minh Koóng,

2007)

1.4.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)

Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép không rỉ có nắp đậy Rót dung môi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp tục rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 19 Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Phương pháp làm ở nhiệt

độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung môi và thời

gian chiết (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.3 Kỹ thuật chiết Sohxlet

Bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong túi vải trắng hay giấy lọc dày rồi cho vào trụ chiết (đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy để tránh làm nghẹt ống thông nhau), không được để lượng bột cây cao hơn mức thông nhau của trụ chiết Rót dung môi vào bình cầu cho thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (không được để lượng thể tích trong bình cầu nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu)

Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt dung môi và thử lên mặt kiếng, nếu thấy không có vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt Sau khi hoàn tất lấy dung môi ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi thu được cao chiết Đối với dịch chiết ethanol 100 ml, chiết liên tục 10 g bột dược liệu ở 60 - 80oC trong 10 giờ, dịch chiết

C, ly tâm 5.000 vòng/ 10 phút, lọc với giấy lọc, cô quay cho bay ethanol

Ưu điểm: tiết kiệm dung môi, không tốn thao tác lọc và châm dung môi, chiết kiệt

hợp chất trong bột cây

Nhược điểm: hạn chế lượng bột cây cần chiết do kích thước máy nhỏ, các hợp chất

kém bền nhiệt có chứa trong bột cây dễ bị phân hủy Giá thành máy khá cao, máy làm bằng thủy tinh nên dễ vỡ, nhất là các nút mài được gia công bằng thủ công nên khi bị vỡ rất khó tìm được bộ phận khác để thay thế (Từ Minh Koóng, 2007)

SVTH: ĐÀM THỊ PHÚC Trang 20

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU