khảo sát tối ưu hóa quy trình tách chiết dna trên nền mẫu đậu nành ứng dụng trong sàng lọc đậu nành biến đổi gen sử dụng quy trình real time pcr 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TRÊN NỀN MẪU ĐẬU NÀNH, ỨNG DỤNG TRONG SÀNG

LỌC ĐẬU NÀNH BIẾN ĐỔI GEN SỬ DỤNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH VI SINH- SINH HỌC PHÂN TỬ

Người hướng dẫn : ThS NGUYỄN VĂN MINH

Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG

Mã số sinh viên : 1253010262

Khóa : 2012- 2016

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 TỔNG QUAN VỀ SINH VẬT BIẾN ĐỔI GENE 10

1.1.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gene 10

1.1.2 Các thế hệ cây trồng biến đổi gene 10

1.1.3 Tình hình lưu hành GMO trên Thế giới và Việt Nam 11

1.1.4 Lợi ích của sinh vật biến đổi gene 13

1.1.5 Những lo ngại và dư luận xã hội về sinh vật biến đổi gene 13

1.1.6 Kiểm soát và phát hiện GMO trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi 14

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GENE 15

1.2.1 Các phương pháp chủ yếu phát hiện GMO 15

1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện GMO trong thực phẩm 16

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA SỬ DỤNG TRONG PHÁT HIỆN GMO 21

1.3.1 Nguyên tắc chung trong tách chiết DNA 21

1.3.2 Phương pháp tách chiết sử dụng cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 22

1.3.3 Phương pháp tách chiết DNA sử dụng silica 25

1.4 ĐÁNH GIÁ DNA SAU TÁCH CHIẾT 27

1.4.1 Đánh giá về hàm lượng 27

1.4.2 Đánh giá về chất lượng 27

2.PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 30

2.1.1 Địa điểm thực hiện thí nghiệm 30

2.1.2 Thời gian thực hiện 30

2.1.3 Tiến trình thí nghiệm 31

2.7.3 Hóa chất và chất chuẩn 47

2.7.4 Thiết bị 47

2.7.5 Chuẩn bị gel Agarose 48

2.7.6 Chuẩn bị dung dịch DNA mẫu 49

2.8.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại 51

2.8.6 Phân tích và diễn giải kết quả 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC: HƯỚNG DẪN PHA HÓA CHẤT 75

Agri-biotech Applicatons

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Một số phương pháp tách chiết DNA bằng CTAB 23

Bảng 2 1 Quy trình tách chiết DNA thí nghiệm 2 36

Bảng 2 2 Quy trình tách chiết DNA thí nghiệm 3 41

Bảng 2 3 Tỷ lệ khảo sát dịch DNA: GuSCN: Ethanol 45

Bảng 2 4 Nồng độ agarose sử dụng tương ứng với chiều dài đoạn DNA sản phẩm 48

Bảng 2 5 Thành phần chuẩn bị dung dịch điện di 49

Bảng 2 6 Chu kỳ luân nhiệt trên máy PCR 52

Bảng 3 1 Kết quả định lượng và kiểm tra độ tinh sạch thí nghiệm 1 56

Bảng 3 2 Kết qủa tách chiết DNA, hàm lượng và độ tinh sạch của hạt đậu nành bằng phương pháp tách chiết DNA bằng cột silica so với phương pháp CTAB (ISO) 58

Bảng 3 3 Kết quả tách chiết DNA hạt đậu nành trong thí nghiệm khảo sát binding buffer ở thí nghiệm 3 60

Bảng 3 4 Kết quả tách chiết DNA hạt đậu nành với các tỷ lệ thể tích dịch DNA sau ly giải, GuSCN và EtOH 100% 61

DANH MỤC SƠ ĐỒSơ đồ 2 1 Sơ đồ quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB (ISO) 34

Sơ đồ 2 2 Sơ đồ quy trình tách chiết thí nghiệm 4 46

DANH MỤC HÌNHHình 1 1 Bản đồ các quốc gia trồng, nhập khẩu, và/hoặc tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng sinh vật biến đổi gene tại 70 quốc gia trên Thế Giới năm 2014 12

Hình 1 2 Nguyên tắc phát hiện khi sử dụng Taqman Probe Hoạt tính 5’-3’ exonuclease của Taq DNA polymerase 18

Hình 1 3 Quá trình chuyển gene và bốn cấp độ đặc hiệu của các module phân tích trình tự DNA mục tiêu 21

Hình 1 4: Độ hấp thụ UV của các base 27

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh và các thầy cô chuyên ngành Vi sinh- Sinh học phân tử trong khoa đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt bốn năm học và rèn luyện tại trường

Em xin chân thành cảm ơn cô Trương Kim Phượng, người đã xây dựng cho em những nền móng đầu tiên về thực nghiệm Sinh Học Phân Tử trong thời gian còn là sinh viên học việc phòng Thí Nghiệm Sinh học Phân tử

Xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh đã cho em cơ hội được thực hiện khóa luận tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3 (QUATEST 3), hướng dẫn và tạo động lực cho em trong suốt quá trình làm khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Trung Tâm QUATEST 3, chị Vũ Diệu Thu, anh Chu Nguyên Thanh, chị Đinh Thị Thu Hồng, chị Nguyễn Thị Uyên Vy và các anh, chị Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh- GMO, đã giúp đỡ, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện cho em học hỏi và ứng dụng những kiến thức trường lớp trong suốt thời gian qua Thời gian tại QUATEST 3 đã cho em học hỏi được nhiều kinh nghiệm thực tế, được trải nghiệm trong một môi trường làm việc chuyên nghiệp và nghiêm túc Những kinh nghiệm quý báu và những tình cảm, kỉ niệm tuyệt vời từ các anh, chị là niềm hạnh phúc mà em xin luôn trân trọng Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn chị Trần Thị Ánh Nguyệt và chị Nguyễn Phạm Phương Thanh đã tạo mọi điều kiện và hướng dẫn tận tình để em có thể hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp này

Con xin cảm ơn bố mẹ đã sinh thành, dạy dỗ để con có được ngày hôm nay Cảm ơn gia đình đã luôn bên con, giúp con vững tin để đi tiếp con đường mà con đã chọn

Xin chân thành cảm ơn

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Genetically Modified Organism (GMO) là sinh vật biến đổi gene do con người tạo ra mang một hay nhiều gene hữu ích cho con người Thế giới hiện nay tồn tại hai trường phái đối lập nhau về việc công nhận các thành tựu GMO và lo ngại các tác động chưa biết đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người [8] Vì vậy, trên thế giới, đặc biệt các quốc gia Châu Âu, chính phủ các nước đã triển khai nhiều biện pháp kỹ thuật nhằm phát hiện và định lượng những biến đổi trên vật chất di truyền cây trồng, vật nuôi do tác động của các kỹ thuật công nghệ sinh học Mục đích nhằm kiểm soát sự hiện diện của GMO, đồng thời bảo vệ quyền của người tiêu dùng trong việc lựa chon sử dụng sản phẩm nông sản truyền thống (non- GMO) hay nông sản đã được biến đổi di truyền (GMO) [4,26]

Real- time PCR là một trong số những kỹ thuật đang áp dụng phổ biến trên thế giới, giúp phát hiện GMO một cách chính xác và đáng tin cậy Ưu điểm của nó là thao tác đơn giản, độ nhạy cao, chuyên biệt và đặc hiệu Hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc nhiều yếu tố từ DNA đầu vào như: tính nguyên vẹn, độ tinh sạch và nồng độ DNA sau tách chiết phù hợp cho phản ứng Real-time PCR [40]

Sử dụng phương pháp cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) để tách DNA thực vật rất phổ biến hiện nay[4] Ưu điểm của nó là tách được hầu hết các loại DNA thực vật, quy trình đơn giản, hiệu suất tách chiết cao Tuy nhiên, đối với các mẫu thực vật như đậu nành, đậu hà lan, tiêu, có chứa hàm lượng cao các hợp chất thứ cấp như: protein, các hợp chất phenol và các polysaccharide, DNA sau tách chiết bằng CTAB có chứa nhiều hợp chất thứ cấp Các hợp chất này có khả năng gây ức chế sự hoạt động của Taq polymerase, gây hiện tương âm tính giả kết quả PCR[41] Hiện nay, trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã công bố quy trình CTAB cải tiến từ quy trình CTAB cơ bản bằng

cách bổ sung các nhân tố loại tạp chất như: polyvinylpyrrolidone (PVP), mercaptoethanol hoặc phương pháp sử dụng cột silica [5, 19]

β-Promoter 35S RNA của Cauliflower mosaic virus (CaMV) và Terminator plasmid Ti nopaline synthase gene (T-NOS) của Agrobacterium tumefaciens là hai chỉ tiêu tầm

soát GMO phổ biến nhất Đặc biệt, trong các GMC có giá trị thương mại quan trọng như: bắp, đậu nành, gạo, các thành phần này có mức độ hiện diện phổ biến [41]

Với mục tiêu thu nhận được một quy trình tách chiết DNA tối ưu trên nền mẫu hạt đậu nành, có khả năng loại bỏ các hợp chất thứ cấp, ứng dụng trong sàng lọc đậu nành biến đổi gene bằng kỹ thuật Real-time PCR, được sự đồng ý của Trung Tâm Quatest 3, khoa Công Nghệ Sinh Học, ThS Nguyễn Phạm Phương Thanh và ThS Nguyễn Văn Minh, tôi quyết định chọn đề tài Khóa luận Tốt nghiệp là: “KHẢO SÁT TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TRÊN NỀN MẪU ĐẬU NÀNH, ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC ĐẬU NÀNH BIẾN ĐỔI GEN SỬ DỤNG QUY TRÌNH REAL-

TIME PCR” với mong muốn được học hỏi, trải nghiệm và nâng cao kiến thức về Sinh

học Phân tử nói chung và phát hiện GMO nói riêng

Mục tiêu

Thu được quy trình tách chiết DNA giúp thu nhận DNA trên nền mẫu đậu nành một cách nguyên vẹn, tinh sạch, với hàm lượng phù hợp cho phản ứng Real-time PCR, ứng dụng trong sàng lọc đậu nành biến đổi gene

1.PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ SINH VẬT BIẾN ĐỔI GENE 1.1.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gene

Sinh vật biến đổi gene (Genetically Modified Organism- GMO) là những sinh vật (thực vật, động vật hoặc vi sinh vật) bị biến đổi cấu trúc vật liệu di truyền (DNA) không theo cách tự nhiên như giao phối và/ hoặc tái tổ hợp tự nhiên Công nghệ này cho phép con người lựa chọn những gene mong muốn chuyển từ sinh vật này sang sinh vật khác, giữa các loài không có quan hệ họ hàng Thực phẩm được sản xuất từ GMO được gọi là thực phẩm biến đổi gene [3] Các cấu trúc chuyển gene bao gồm nhiều yếu tố, thường có ít nhất một gene quan tâm, một promoter hoạt động như một tín hiệu bắt đầu, và một terminator hoạt động như một tín hiệu kết thúc để điều hòa biểu hiện gen [4] Kể từ khi sinh vật biến đổi gene đầu tiên được thương mại hóa năm 1994, hiện nay 357 sự kiện GMO trong 27 loài đã được thương mại hóa với mục đích cải thiện chất lượng nông nghiệp và phục vụ lợi ích cho con người [27]

1.1.2 Các thế hệ cây trồng biến đổi gene

Cây trồng biến đổi gene được chia làm 3 thế hệ dựa theo lợi ích mà chúng mang lại [33]

Thế hệ thứ nhất xuất hiện khi cà chua Flavr Savr TM có đặc tính chậm chín được thương mại hóa đầu tiên năm 1994 [53] Hiện nay, thế hệ này phát triển bao gồm các đặc tính được tập trung ở thực vật về nông học như: khả năng kháng thuốc trừ cỏ, kháng thuốc trừ sâu, kháng virus [34]

Thế hệ tiếp theo tập trung vào các đặc tính có lợi cho con người như tạo ra giá trị dinh dưỡng cao, chất lượng cao và ít gây dị ứng Thế hệ này tiêu biểu có đậu nành giàu acid oleic và gạo vàng giàu vitamin A[34]

Năm 1998, thế hệ thứ ba xuất hiện được ứng dụng nhiều trong việc sản xuất vaccin, kháng sinh và protein dùng trong dược phẩm[34]

Sự phát triển của GMO tăng nhanh theo tốc độ phát triển của nhân loại, tính đến năm 2015, cây trồng biến đổi gene đã được trồng trên hơn 13% đất canh tác thế giới và các sản phẩm từ chúng có mặt tại hầu hết các siêu thị, cửa hàng của các quốc gia, trong đó có Việt Nam [27]

1.1.3 Tình hình lưu hành GMO trên Thế giới và Việt Nam

1.1.3.1 Tình hình lưu hành GMO trên Thế giới

Theo báo cáo của Tổ chức Quốc Tế về Tiếp Thu Các Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Nông Nghiệp (ISAAA), tính đến năm 2014, cây trồng biến đổi gene đã được trồng bởi 18 triệu nông dân tại 28 quốc gia trên tổng diện tích là 181.500.000 ha, tương đương với 13% bề mặt canh tác của thế giới Trong đó, 82% trên tổng diện tích được dùng để trồng đậu nành, 68% bông, 30% đối với ngô và 25% cải dầu được trồng với các giống cây trồng biến đổi gene vào năm 2014 [27]

Hình 1 1 Bản đồ các quốc gia trồng, nhập khẩu, và/hoặc tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng sinh vật biến đổi gene tại 70 quốc gia trên Thế Giới năm 2014 [45]

1.1.3.2 Tình hình lưu hành GMO tại Việt Nam

Ngày 03/02/2015, tại Hội nghị Triển vọng cây trồng về biến đổi gene, Viện trưởng

100% đậu tương biến đổi gen đã được nhập vào Việt nam chiếm đến 93% nhu cầu, 7% còn lại là nguồn cung trong nước”[52] Tuy nhiên, mãi cho đến năm 2005, nước ta mới bắt đầu xây dựng hành lang pháp lý cho việc ứng dụng công nghệ sinh học bao gồm các giống chuyển gene [55]

Năm 2015, ngô biến đổi gene có khả năng kháng sâu được đưa vào trồng đại trà

và Việt Nam trở thành quốc gia thứ 29 trên Thế Giới trồng cây biến đổi gene[ 51] Mục

tiêu đến năm 2020, diện tích trồng trọt các cây mới tại Việt Nam tạo ra bằng các kỹ thuật

Quốc gia cho phép trồng và nhập khẩu

Quốc gia cho phép nhập khẩu

Quốc gia đang tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng

công nghệ sinh học chiếm trên 70%, trong đó diện tích trồng các giống cây biến đổi gene chiếm 30-50% Ba giống cây được quan tâm đưa vào sản xuất là ngô, bông và đậu

nành [54]

Hiện nay, dù đã có một số lượng lớn sản phẩm biến đổi gen được lưu hành trong nước, nhưng hiện vẫn chưa có quy trình kiểm nghiệm và quy chế cụ thể trong việc kiểm soát các sản phẩm biến đổi gen nhập khẩu Quy chế dán nhãn thông báo sản phẩm biến đổi gen đã nhiều lần được đưa ra thảo luận nhằm giúp người tiêu dùng nhận diện và lựa chọn, nhưng hiện vẫn là vấn đề còn nhiều tranh cãi

1.1.4 Lợi ích của sinh vật biến đổi gene

Theo báo cáo của Tổ chức Quốc Tế Về Tiếp Thu Các Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Nông Nghiệp (ISAAA), từ dữ liệu tạm thời năm 1996-2013, cây trồng biến đổi gene góp phần vào an ninh lương thực, giảm thiểu biến đổi khí hậu, và đóng góp trong chiến lược “phát triển bền vững - sustainable intensification” theo năm cách:

- Góp phần vào việc tự túc và an ninh lương thực, thức ăn chăn nuôi, chất xơ, cung cấp chi phí thực phẩm hợp lý, bằng cách tăng lợi ích kinh tế và năng suất một cách bền vững ở cấp độ nông nghiệp [27]

- Bảo tồn đa dạng sinh học [27]

- Góp phần vào công cuộc xóa đói giảm nghèo [27] - Giảm lượng khí thải trong môi trường nông nghiệp [27] - Giúp giảm thiểu biến đổi khí hậu và giảm khí nhà kính [27]

Bên cạnh những lợi ích có thể thấy của sinh vật biến đổi gene, nhiều lo ngại về tác động có thể có của chúng đối với sức khỏe con người, vật nuôi và môi trường [32]

1.1.5 Những lo ngại và dư luận xã hội về sinh vật biến đổi gene

Các ảnh hưởng tiềm ẩn của sinh vật biến đổi gen đối với con người bao gồm: chất gây dị ứng, độc tố, chuyển giao marker kháng kháng sinh Một số nhà khoa học quan ngại rằng sự xuất hiện GMO có liên quan trực tiếp đến sự gia tăng các vấn đề sức khỏe

như nguy cơ gia tăng một số bệnh ung thư, các vấn đề sinh sản, bệnh tự kỉ và bệnh tim [7,32]

Một số ảnh hưởng đối với vật nuôi, cây trồng và môi trường:

- Xuất hiện siêu vi khuẩn và cỏ kháng thuốc gây thiệt hại mùa màng và chi phí cho người nông dân [9]

- Ô nhiễm không khí, nước và đất Ví dụ như Glyphosate- thuốc diệt cỏ Roundup của Mosanto có thể phá hủy chất lượng đất và làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực vật [9]

- Gây mất sự đa dạng sinh học bằng cách gây biến đổi, làm mất các loài thực vật bản địa tự nhiên thông qua thụ phận chéo, tác động tới các sinh vật khác như vi khuẩn đất [32, 34]

Những lo ngại trên khiến nhiều quốc gia trên thế giới phát triển hệ thống quy định pháp lý chặt chẽ giúp kiểm soát việc lưu hành và tiêu thụ GMO trong môi trường [9]

1.1.6 Kiểm soát và phát hiện GMO trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

VIệc quản lý các sinh vật biến đổi gene trên toàn cầu được quy định bằng nghị định thư An toàn sinh học Cartagena (Liên Hiệp Quốc ban hành và có hiệu lực từ ngày 11/9/2003) Đây là văn bản đầu tiên trên Thế giới xác định các sinh vật biến đổi gene là khác biệt so với các sinh vật thông thường khác, vì vậy cần có biện pháp quản lý riêng biệt [18]

Hiện nay, quy định tại các quốc gia là rất đa dạng và khác biệt tùy theo tình hình thực tế tại mỗi quốc gia Một điểm chính trong các quy định là yêu cầu dán nhãn các sản phẩm biến đổi gene được thương mại hóa Bên cạnh việc quản lý, quy định này còn giúp bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng bằng cách cho phép họ phân biệt và quyết định sử dụng sản phẩm biến đổi gene hay các sản phẩm truyền thống không biến đổi gene cùng

chủng loại Đồng thời, các nước cũng ban hành những quy định cụ thể nhằm sàng lọc, định lượng phần trăm GMO, tạo thuận lợi cho việc quản lý việc xuất nhập khẩu và thương mại hóa các sản phẩm biến đổi gene [4, 18]

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GENE

1.2.1 Các phương pháp chủ yếu phát hiện GMO

Các phương pháp được sử dụng phát hiện các sản phẩm biến đổi gene hiện nay có thể chia thành 2 nhóm [16]:

Nhóm 1: Phương pháp dựa trên việc khuếch đại nucleotide (PCR-based methods) Nhóm này bao gồm:

- PCR cổ điển - Real-time PCR

Nhóm 2: Phương pháp dựa trên việc phát hiện protein tiêu biểu như kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Kỹ thuật này dựa trên tương tác giữa kháng thể và kháng nguyên Các thuốc thử quan trọng trong kỹ thuật này là những kháng thể, đó là những protein hòa tan được sản xuất bởi hệ thống miễn dịch có khả năng đáp ứng miễn dịch với một chất từ bên ngoài được gọi là kháng nguyên Trong trường hợp phát hiện GMO, các kháng nguyên là protein mới được tổng hợp từ các gene mới được chèn [16, 30]

Thuận lợi của phương pháp này là khá nhạy và đơn giản, có thể định lượng sự hiện diện sản phẩm biến đổi gene với tỷ lệ từ 0.3% đến 5% Tuy nhiên, nó mang khuyết điểm lớn là chỉ áp dụng cho các mẫu sản phẩm thô, chưa chế biến do protein dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao trong khi đối tượng chính của việc phát hiện GMO là các sản phẩm thực phẩm và thức ăn đã chế biến với nhiệt độ cao trong thời gian dài Chính điều này đã hạn

chế khá lớn phạm vi áp dụng của kỹ thuật ELISA Đồng thời, các nghiên cứu cho thấy DNA có độ bền vững cao trong quá trình chế biến khắc nghiệt [16, 19]

1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện GMO trong thực phẩm

1.2.2.1 Kỹ thuật PCR cổ điển

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này [39, 44]

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :

Bước 1(biến tính, denaturation): Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới [39]

Bước 2 (bắt cặp, annealing): Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer 1 khoảng thích hợp, cho phép các primer bắt cặp đặc hiệu với mạch khuôn [39]

Bước 3 (kéo dài, elongation – extension): Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn [39]

Trong các kỹ thuật phát hiện bằng PCR, kỹ thuật PCR cổ điển xuất hiện từ sớm, tuy nhiên mang nhiều khuyết điểm như độ nhạy không cao, kết quả chỉ phản ánh được lượng sản phẩm cuối cùng thu được trong toàn quy trình, tốn nhiều thời gian và tăng nguy cơ nhiễm chéo do phải tiến hành điện di sau đó để đọc kết quả [44] Trong khi đó, kỹ thuật Real-time PCR với các ưu điểm là độ nhạy cao, có thể xác định sự hiện diện GMO trong thực phẩm ở tỷ lệ thấp, thời gian ngắn và có thể quan sát kết quả trong toàn

bộ quá trình thực hiện Những ưu điểm này giúp Real-time PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới [16, 30]

1.2.2.2 Kỹ thuật Real-time PCR

Real-time PCR cho phép giám sát sự tổng hợp các phân tử amplicon mới trong PCR trong thời gian thực [30] Nguyên tắc của phương pháp này là xác định lượng DNA được tạo thành dựa vào sự tích lũy tín hiệu huỳnh quang Nói cách khác, trong phản ứng Real-time PCR, cường độ tín hiệu huỳnh quang được giải phóng tỷ lệ thuận với số lượng sản phẩm PCR được tạo ra Bằng cách ghi lại số lượng phát xạ huỳnh quang tại mỗi chu kì ta có thể theo dõi các phản ứng PCR trong giai đoạn theo cấp số nhân thông qua biểu đồ khuếch đại (amplification graph) Tín hiệu huỳnh quang đầu tiên tương quan với số lượng DNA mục tiêu ban đầu [5,26]

Hiệu quả của kỹ thuật Real-time PCR dựa trên hóa chất được dùng để định lượng, và công cụ để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang [16, 30] Trong đó, hóa chất định lượng được sử dụng trong phản ứng Real-time PCR có thể chia thành hai loại chính [16]:

- Thuốc nhuộm xen giữa DNA: ethidium bromide, SYBR Green I

- Mẫu dò lai: Taqman, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Molecular Beacons, Scorpions và Taqman Minor Groove Binder

Phương pháp Real-time PCR sử dụng Taqman probe là một trong những phương pháp phổ biến được sử dụng nhằm phát hiện GMO đã được ISO công nhận [25] Phương

pháp này dựa trên khả năng 5’-3’ exonuclease của Taq DNA polymerase để cắt đứt một

mẫu dò trong phản ứng Taqman probe thông thường là một chuỗi oligonucleotide dài

chảy của mồi) có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5’ và một chất hấp thụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ Do đầu 3’ bị khóa, mẫu dò không thể kéo dài được như mồi [16]

1.2.2.2.1 Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe

Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn, huỳnh quang được phát ra từ reporter đầu 5’ và bị quencher ở đầu 3’ hấp thụ Ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích [16]

Khi bắt đầu có sự xuất hiện hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và bị enzyme

Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của

Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter càng nhiều, đến khi cường độ huỳnh quang phát ra đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích [16]

Hình 1 2 Nguyên tắc phát hiện khi sử dụng Taqman Probe Hoạt tính 5’-3’ exonuclease của Taq DNA polymerase [16]

Quencher hấp thụ huỳnh quang

Reporter phát huỳnh quang

1.2.2.2.2 Chương trình luân nhiệt của Real-time PCR

Chương trình luân nhiệt của Real-time PCR sử dụng Taqman probe thường có hai giai đoạn nhiệt độ Biến tính 94-95oC/ 15-30 giây, sau đó là giai đoạn vừa bắt cặp vừa kéo dài ở 60oC/30giây Ở giai đoạn nhiệt độ 60oC Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi gene

là 65-70OC, bằng /cao hơn Tm của mồi là 55- 60oC), sau đó mồi mới bắt cặp vào [16]

1.2.2.3 Yêu cầu về DNA cho phản ứng PCR

Nhiều yếu tố có thể gây ra sự đứt gãy DNA trong quá trình tách chiết Sự suy thoái của DNA do các endonuclease trong quá trình tinh sạch DNA thực vật trọng lượng phân tử cao gây ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến các phản ứng enzyme[34] Polysaccharide có thể gây ra những ảnh hưởng lớn khi hiện diện trong mẫu DNA và đã

được chứng minh là gây ức chế hoạt động của Taq polymerase [21] và enzyme cắt giới

hạn [46] Các dạng oxy hóa của polyphenol dòng hóa trị liên kết với DNA làm giảm độ bền của DNA, gây giảm hiệu quả trong nghiên cứu phân tử [18]

1.2.2.4 Các mức độ chuyên biệt trong phát hiện GMO bằng Real-time PCR hiện nay

Trong mục tiêu phát hiện GMO, các module PCR được phân biệt thành bốn cấp độ đặc hiệu [5] Mỗi cấp độ tương ứng với thành phần đoạn DNA được khuếch đại trong phản ứng PCR [4, 5]

Module chuyên biệt yếu tố (Element specific)[5]

Module chuyên biệt yếu tố phù hợp với việc sàng lọc để xác định một mẫu có khả năng chứa GMO hay không Sàng lọc các yếu tố chuyên biệt cũng có thể giới hạn danh sách các đối tượng nghi ngờ GMO và cung cấp manh mối để nhận dạng GMO hiện nay [5] Trong đó, Promoter 35S (P- 35S) của Virus Cauliflower mosaic (CaMV) và/hoặc

T-35S hoặc Terminator nopaline synthase (T-NOS) từ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens là hai trình tự được tầm soát phổ biến nhất để sàng lọc GMO [4], [47]

Module chuyên biệt loài (Taxon specific)[5]

Module chuyên biệt loài phát hiện một trình tự được biết là chuyên biệt cho loài đó [1] Module này phù hợp để xác định và định lượng thành phần (được định nghĩa là tất cả các vật liệu có nguồn gốc từ một loài nhất định) Kết quả định lượng của vật liệu trong sản phẩm cung cấp cơ sở cho việc tính toán tương đối GMO trong mỗi thành phần [5]

Module chuyên biệt cấu trúc (Construct specific) [5]

Mục tiêu của module này là nhắm đến một motif trình tự DNA được chèn bao gồm ít nhất hai yếu tố không tự nhiên cùng tồn tại trong cấu trúc này Module này phù hợp với việc sàng lọc và định lượng đồng thời cung cấp bằng chứng chắc chắn về sự hiện diện của GMO khi thu được kết quả dương tính [5]

Modue chuyên biệt sự kiện (event specific) [5]

Mục tiêu của module này là nơi tiếp xúc giữa bộ gene vật chủ và đoạn DNA được chèn vào [3] Module này đặc biệt thích hợp để xác định, định lượng và đại diện về cơ sở pháp lý trong việc ủy quyền một GMO cho phép được sử dụng thương mại như thực phẩm/ thức ăn chăn nuôi tại EU [5]

Hình 1 3 Quá trình chuyển gene và bốn cấp độ đặc hiệu của các module phân tích trình tự DNA mục tiêu [5]

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA SỬ DỤNG TRONG PHÁT HIỆN GMO

1.3.1 Nguyên tắc chung trong tách chiết DNA

Chất lượng DNA tốt là điều kiện tiên quyết cho tất cả các thí nghiệm thao tác trên DNA Có nhiều phương pháp khác nhau để tách chiết DNA Hầu hết các phương pháp đều nhằm giải quyết ba mục tiêu [37]:

- Sự ly giải toàn diện của các tế bào và thu nhận acid nucleotide trong tế bào ở pha lỏng [37]

- Loại bỏ các hợp chất hữu cơ và vô cơ có trong dịch sau ly giải [37]

- Giảm thiểu các tổn thất về acid nucleotide trong suốt quá trình tách chiết [37] Ly giải tế bào được thực hiện theo phương pháp cơ học, như: nghiền, làm lạnh nhanh, sử dụng enzyme có khả năng thủy phân vách tế bào và màng tế bào, và/ hoặc

Chuyên biệt loài Taxon specificChuyên biệt yếu tố Element specific Chuyên biệt cấu trúc Construct specific

Chuyên biệt sự kiện Event specific

Cấu trúc được chèn vào bộ gene vật chủ Gene vật chủ

Promoter Gene tính trạng Terminator

theo phương pháp hóa học như các chất tẩy rửa làm hòa tan các thành phần màng lipid hoặc các tác nhân chaotropic gây biến tính protein xuyên màng [37]

Qúa trình tinh sạch tiếp theo được thực hiện bằng cách rửa với chất hữu cơ và/ hoặc các chất tẩy rửa như: phenol, chloroform, hoặc cetyl trimethylamoni bromide (CTAB), tủa lại DNA với ethanol, isopropanol, polyethylene glycol và/ hoặc lọc qua

cột silica, hạt từ tính, hoặc gel [37]

Trong khi những năm 1980- 1990 việc tách chiết DNA chủ yếu dựa vào các phương pháp thủ công thì nay đã có sự thay đổi theo hướng tăng cường sử dụng các bộ kit thương mại Sử dụng các bộ kit có nhiều lợi thế, thuốc thử và quy trình tách chiết đã được chuẩn bị hợp lý Một số bộ kit cho khả năng thu nhận đủ lượng DNA trên một phạm vi lớn các nền mẫu Sử dụng cùng một bộ kit trên nhiều đối tượng cho phép khả năng so sánh bộ dữ liệu sinh học phân tử dựa trên việc tiêu chuẩn hóa phương pháp Mặc dù có những lợi thế, tuy nhiên không có bộ kit chung để thực hiện tốt nhất trên tất cả các loại mẫu và mục tiêu nghiên cứu cần được phát triển Một phần do các nền mẫu khác nhau mang những đặc tính và thành phần, hàm lượng các hợp chất thứ cấp khác nhau Do đó, việc cần điều chỉnh các phương pháp tách chiết để đáp ứng đặc điểm mẫu là yêu cầu nghiên cứu cụ thể [37]

1.3.2 Phương pháp tách chiết sử dụng cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)

1.3.2.1 Nguyên tắc

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) là chất khử cation được sử dụng để phá màng tế bào giải phóng DNA tổng số CTAB làm cho DNA dễ hòa tan, dễ dàng tách polysaccharide và RNA ra khỏi DNA Protein được tách khỏi DNA bằng phenol hoặc chloroform [3, 7]

Khi nồng độ NaCl thấp hơn 0,5M, CTAB sẽ kết tủa với nucleic acid tạo phức không tan và lắng xuống đáy Trong khi polysaccharide, các hợp chất phenol và các chất

bẩn ức chế enzyme khác trong tế bào thực vật sẽ được loại bỏ vì chúng không kết tủa trong điều kiện này Phức hợp CTAB-nucleic acid chỉ tan trong dung dịch NaCl nồng độ cao, nên ta dễ dàng tách chúng bằng cách tăng nồng độ NaCl và tủa lại DNA Loại bỏ CTAB dư bằng cách rửa trong ethanol hoặc isopropanol [29]

1.3.2.2 Quy trình

Dung dịch CTAB ly trích cơ bản gồm 2% CTAB, 1,4M NaCl, 20mM EDTAvà 100mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-HCl, pH 8,0 Quy trình ban đầu sử dụng dung dịch đệm CTAB và sử dụng chloroform: isoamyl alcohol (24:1) để loại bỏ các protein và polysaccharide [14]

Các quy trình CTAB cải tiến bao gồm việc bổ sung proteinase K và mercaptoethanol trong dịch đệm CTAB và sử dụng phenol: chlorofrom: isoamyl alcohol (25:24:1) ban đầu và sau đó dùng chloroform: isoamyl alcohol (24:1) để làm sạch hơn nữa [14,17] Một số phiên bản cải tiến của phương pháp này được trình bày trong bảng 1.1 Nồng độ các thành phần trong dung dịch đệm buffer CTAB trong các phiên bản có thể khác nhau Phương pháp tách chiết DNA bằng CTAB đã được công nhận bởi Community Reference Laboratory cho thực phẩm biến đổi gene và thức ăn chăn nuôi [25, 29]

Bảng 1 1 Một số phương pháp tách chiết DNA bằng CTAB

liệu

CTAB cơ bản Đệm CTAB trích+ chloroform/ isoamyl alcohol +

isopropanol/ rửa bằng EtOH 70% + hòa tan DNA bằng TE

[15]

tủa lại trong NaCl 1.2M + chloroform + isopropanol/ rửa bằng

[49]

EtOH 70% + hòa tan DNA bằng TE hoặc nước cất siêu sạch Dùng trong định tính nguyên liệu biến đổi gene trong bột đậu nành và bắp

CTAB (ISO)

Đệm CTAB trích/ RNase A/ α-amylase/ proteinase K + chloroform + dịch CTAB tủa + hòa tan tủa lại trong NaCl 1.2M +chloroform+ isopropanol/ rửa bằng EtOH 70% + hòa tan DNA bằng TE hoặc nước cất siêu sạch Dùng trong tách DNA từ hạt ngũ cốc và thực phẩm

[13]

CTAB+ Wizard resin+ microSpin column

Đệm CTAB trích/ RNase A/ proteinase K + chloroform + dịch CTAB tủa + hòa tan tủa lại trong NaCl 1.2M +chloroform + isopropanol/ Tinh sạch bằng Wizard® DNA clean-up + tinh sạch bằng cột S-300 HR microSpin + hòa tan DNA bằng TE hoặc nước cất siêu sạch Dùng trong tách DNA từ hạt đậu nành và bắp

[21]

CTAB+ PEG

Đệm CTAB trích/mercaptoethanol/proteinase K + phenol/chloroform/isoamyl alcohol (3×) + tủa bằng isopropanol + TE/RNase + chloroform/isoamyl alcohol (3×) + tủa lại DNA với ammonium acetate và ethanol + TE/PEG tủa + hòa tan lại bằng TE hoặc nước siêu sach

12]

1.3.2.3 Ưu điểm

- Phương pháp CTAB đã được sử dụng rộng rãi để tách DNA từ thực vật, động

vật, vi sinh vật và mẫu thực phẩm/ thức ăn chăn nuôi [10]

- CTAB có thể tách DNA từ nhiều bộ phận thực vật như rễ, thân, lá, hạt, nội nhũ, phôi, mô sẹo và phấn hoa

- Lượng mẫu cần sử dụng có thể rất thấp, tới hàng miligram nếu số lượng mẫu ít Nguyên liệu sử dụng có thể ở dạng đông khô, đông lạnh, tươi và sấy khô

- Thời gian phương pháp dao động 4-6 giờ phụ thuộc phẩm chất của vật liệu, độ tinh sạch và độ dài DNA mong muốn [42]

1.3.2.4 Nhược điểm

tách chiết DNA bằng CTAB thường thấp (trung bình là 1.29) biểu thị khả năng nhiễm các hợp chất như polysaccharide có thể làm ức chế phản ứng Real-time PCR [14] Do đó, phương pháp này cần có thêm các bước tinh sạch sâu hơn để có thể sử dụng cho phản ứng khuếch đại Real-time PCR [17] Hơn nữa, các quy trình này tốn nhiều thời gian và sử dụng các hóa chất độc hại như phenol, chloroform Việc cải tiến phương pháp CTAB nhằm loại bỏ các chất ức chế hiệu quả hơn so với các phương pháp hiện nay là một nhu cầu cần thiết

1.3.3 Phương pháp tách chiết DNA sử dụng silica

1.3.3.1 Quy trình chung

Quy trình tách chiết DNA qua cột silica gồm 4 bước:

Bước 1(Ly giải tế bào): Dung dịch ly giải thường chứa nồng độ muối phân cực mạnh như: Guadigine HCl, Guanidine thiocyanate, urea, và lithium perchlorate Các muối này có khả năng gây mất ổn định liên kết hydro, van der Waals và tương tác kỵ nước Điều này khiến protein và nuclease bị mất ổn định, sự kết hợp của acid nucleatide trong nước bị phá vỡ tạo điều kiện cho việc bám vào silica của DNA [36, 40] Bên cạnh các muối phân cực mạnh, có thể sử dụng bộ đệm ly giải chứa các chất tẩy rửa như CTAB giúp hòa tan protein và ly giải [36, 40]

Bước 2: Bám cột silica

Trong giai đoạn này, muối vẫn đóng vai trò quan trọng, nhưng để tăng hiệu quả bám cột silica của DNA cần bổ sung thêm alcohol [36, 40]

Hầu hết các trường hợp sử dụng ethanol nhưng vẫn có thể sử dụng isoropanol Sự ảnh hưởng của phần trăm và thể tích ethanol thêm vào là một điều kiện quan trọng giúp cải thiện khả năng tách DNA với hàm lượng lớn, có độ tinh sạch và độ nguyên vẹn cao [36, 40]

Bước 3: Rửa

Qúa trình này giúp loại bỏ các tạp chất Lần rửa đầu tiên thường chứa muối phân cực mạnh với hàm lượng thấp để loại bỏ protein và các tạp chất khác như polysaccharide hay sắc tố đối với mẫu thực vật Lần rửa thứ hai chỉ gồm ethanol để loại bỏ các muối [36, 40]

Bước 4: Rửa giải

Sau khi loại bỏ hết muối, cột được phơi nhằm loại bỏ hết ethanol, DNA sẽ được rửa giải trong TE hoặc nước cất siêu sạch ở 65oC [40]

1.4 ĐÁNH GIÁ DNA SAU TÁCH CHIẾT

1.4.1 Đánh giá về hàm lượng

Nồng độ DNA trong dung dịch sử dụng trong phản ứng PCR và các nghiên cứu sinh học phân tử khác thường được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ UV của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này tỷ lệ với nồng độ DNA ở bước sóng 260nm

OD tương ứng với 38 mg DNA/ml [39]

nucleic Bước sóng 230 cũng được đo nhằm đánh giá mức độ nhiễm các chất như carbonhydrate, peptide, phenol và các hợp chất thơm [39]

Tỷ lệ A260/A280 và A260/A230 được sử dụng để ước tính độ tinh sạch của DNA [36]

Tỷ lệ A260/A280 chấp nhận đượckhi nằm trong khoảng 1,8- 2,0 Nếu thấp hơn, có nghĩa là DNA bị nhiễm protein , cao hơn có nghĩa bị nhiễm RNA [39]

Tỷ lệ A260/A230 nên > 1,5 cho biết mức độ tinh sạch của DNA Nếu thấp hơn, có nghĩa là DNA đã bị nhiễm các chất như carbonhydrate, peptide, phenol và các hợp chất thơm [25]

1.4.2.1 Độ nguyên vẹn

Điện di trên gel agarose được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA Đồng thời, phương pháp này thường được sử dụng để đánh giá độ nguyên vẹn DNA Các phân tử nucleic acid có khối lươṇg và điêṇ tích khác nhau đươc ̣ tách ra khi di chuyển từ cưc ̣ âm sang cưc ̣ dương của hê ̣điêṇ di trong môṭ điêṇ trường có điêṇ thế và cường đô ̣thích hơp ̣ Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp bằng cách các băng DNA trong gel đươc ̣ nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) ở nồng đô ̣thấp và được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại [35].

2.PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Trong phạm vi khóa luận này, các nội dung chính bao gồm các mục sau:

- Khảo sát hiệu quả của β- mecaptoethanol trong quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB theo tiêu chuẩn ISO

- Khảo sát hiệu quả của phương pháp cột silica lên chất lượng DNA thu được sau quá trình tách chiết.

- Khảo sát thành phần dung dịch binding buffer khi tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica

- Khảo sát tỷ lệ hiện diện của dịch DNA sau ly giải với Guanidine thiocyanate và Ethanol tuyệt đối trong dung dịch binding buffer

- Kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA với quy trình tối ưu bằng phương pháp điện di trên gel agarose

- Thử nghiệm khả năng thực hiện phản ứng khuếch đại Real-time PCR của DNA hạt đậu nành sau tách chiết

Các vấn đề nghiên cứu này sẽ giúp tôi xây dựng một quy trình tách chiết DNA từ mẫu hạt đậu nành nguyên có hàm lượng và chất lượng DNA thu được tốt hơn so với tách chiết bằng phương pháp CTAB (ISO), phù hợp cho việc sàng lọc đậu nành biến đổi gene bằng Real-time PCR

2.1.1 Địa điểm thực hiện thí nghiệm

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh- GMO, Khu thí nghiệm Trung Tâm Tiêu Chuẩn đo Lường Chất Lượng 3, 07 đường số 1, Khu công nghiệp Biên Hòa 1, Đồng Nai

2.1.2 Thời gian thực hiện

Thời gian thực hiện từ tháng 3/2016 đến tháng 4/2016

2.1.3 Tiến trình thí nghiệm

Trong khóa luận này, các thí nghiệm được tiến hành theo trình tự như sơ đồ sau:

Thí nghiệm 1

Khảo sát hiệu quả của β-mecaptoethanol trong quy trình tách chiết DNA từ hạt

đậu nành bằng phương pháp CTAB (ISO)

Thí nghiệm 6

Thử nghiệm khả năng thực hiện phản ứng khuếch đại Real-time PCR của DNA

hạt đậu nành sau tách chiết

2.2 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM

Vật liệu thí nghiệm được chọn như sau:

Hạt đậu nành nguyên được mua ngẫu nhiên ngoài thị trường

Chất chuẩn đậu nành RRS 10% Chất chuẩn này chứa trình tự Promoter 35S và Terminator NOS

2.3 THÍ NGHIỆM 1

2.3.1 Mục tiêu

Thông qua khảo sát các nồng độ β- mercaptoethanol (BME) sử dụng trong dung dịch ly giải tế bào xác định khả năng loại bỏ các hợp chất thứ cấp có trong nền mẫu hạt đậu nành

2.3.2Vật liệu

Hạt đậu nành nguyên đã được đồng nhất

2.3.3 Hóa chất- thuốc thử

- Dung dịch đệm trích CTAB - Dung dịch CTAB tủa

- Dung dịch NaCl 1.2 mol/L - Chloroform

- Isopropanol

- α-amylase 10mg/mL - Ethanol 70%

- Proteinase K 20mg/ml - RNase –A 10mg/ml - β- mercaptoethanol 99.9% - Đệm TE pH 8,0

2.3.5 Phương pháp tiến hành

Tiến hành khảo sát thí nghiệm hiệu quả loại bỏ các hợp chất thứ cấp trong hạt đậu nành của BME tại các nồng độ 0%, 0.5%, 2%, 4% trên quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB (ISO) được trình bày ở sơ đồ 2.1

Số lần lặp lại: 4 lần

Sơ đồ 2 1 Sơ đồ quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB (ISO) [19]

+ 10µl Proteinase

K Eppendorf 2ml

Cân 200-500mg mẫu

Ủ lắc ổn nhiệt 650C /30 phút

+ ≥1,5ml CTAB trích (650C)

+ 10µl α-amylase + β- mercaptoethanol

Trộn đều

Ủ lắc ổn nhiệt 650C / 30 phút

Thu pha lỏng phía trên (eppendorf 2ml) + 0,7-1V chloroform,

+ 350 µl NaCl 1,2M + 350 µl chloroform

Trộn đều

12000rpm/15 phút Thu tủa Thu pha lỏng phía trên

sang eppendorf 1,5ml

12000rpm/10 phút

Trộn đều, để nhiệt độ phòng 20 phút

+ 0,6V isopropanol

Thu tủa + 500µl ethanol 70% đảo ống vài lần 12000rpm/15 phút

Thu tủa, phơi khô 12000rpm/

10 phút

3

9 5

4

6

7 8

10

11

2.3.6 Đánh giá hàm lượng và chất lượng DNA sau tinh sạch

DNA thu được từ quy trình ly trích được phân tích dựa trên các chỉ tiêu:

Độ tinh sạch của DNA: đo độ hấp thụ ánh sáng của mẫu ở bước sóng 260 nm (OD260), 280 nm (OD280) và OD230 Xác định tỷ lệ OD260/OD280 và OD260/OD230

DNA thu được tinh sạch khi tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,8- 2,0 và OD260/OD230 >1,5

Kết quả thí nghiệm chúng tôi xác định được cần có các khảo sát hơn nữa nhằm loại bỏ các hợp chất thứ cấp

2.4 THÍ NGHIỆM 2 2.4.1 Mục tiêu

Thông qua khảo sát quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica xác định khả năng loại bỏ các hợp chất thứ cấp có trong nền mẫu hạt đậu nành so với quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB (ISO)

2.4.2 Vật liệu

Hạt đậu nành nguyên đã đồng nhất

2.4.3 Hóa chất- thuốc thử

- Dung dịch đệm trích CTAB - Chloroform

- Isopropanol

- α-amylase 10mg/mL - Ethanol 70%

- Ethanol 100 %

- Proteinase K 20mg/ml - RNase –A 10mg/ml

- Guanidine thiocyanate - Đệm TE pH 8.0

- Nước cất 2 lần

2.4.4 Thiết bị

- Cột Silica

- Máy ly tâm Mikro 200R

- Máy ly tâm Minispin Eppendorf - Máy vortex

- Máy ủ- lắc (Incubator 1000)

- Máy quang phổ Thermo (Nanodrop 2000) - Pipetman 0.5-10µl, 10-100µl, 100-1000µl - Eppendorf, đầu tuýp,

Bảng 2 1 Quy trình tách chiết DNA thí nghiệm 2

Quy trình Bước

1.Ly giải tế bào

-Bổ sung 1,5 ml đệm trích CTAB 65oC, trộn đều

-Bổ sung 10 μl α-amylase và 10 μl RNase

-Ủ lắc 65oC, 30 phút

-Ly tâm 12000 rpm tại 4oC/ 10 phút, thu dịch nổi sang eppendorf 2 ml mới

phần không mong muốn

-Thêm 0,7- 1V chloroform, trộn đều

-Ly tâm 12000 rpm/10 phút, thu dịch nổi sang eppendorf 2ml mới

(lặp lại 2 lần)

-Thêm 0,7- 1V chloroform, trộn đều

-Ly tâm 12000 rpm tại 4oC/10 phút, thu dịch nổi sang eppendorf 2ml mới

-Thêm 0,7- 1V chloroform, trộn đều

-Ly tâm 12000 rpm tại 4oC/10 phút, thu dịch nổi sang eppendorf 2 ml mới