khảo sát ảnh hưởng của dịch truyền đạm aminoplasmal đến khả năng phát triển của cordyceps militaris

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ hồ chí minh

TRUYỀN ĐẠM AMINOPLASMAL ĐẾN KHẢ NĂNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ Hồ CHÍ MINH

TRUYỀN ĐẠM AMINOPLASMAL ĐẾN KHÁ NĂNG 3

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Lưu Thanh Vũ

Ngày sinh: 24/07/1999 Nơi sinh: An Giang

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã học viên: 1753010304

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Phương Khanh

Học viên thực hiện: Lưu Thanh Vũ Lớp: NN01

Ngày sinh: 24/07/1999 Nơi sinh: An Giang

Tên đề tài: Khảo sát ảnh hưởng của dịch truyền đạm Aminoplasmal đến khả năng phát triển của Cordyceps militaris

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: Trong quá trình thực hiện khóa luận, em Lưu Thanh Vũ đã có tinh thần trách nhiệm cao thực hiện hoàn chỉnh các công việc đã đưa ra trong đề cương ban đầu Em có tinh thần làm việc nhóm rất tốt để hỗ trợ nhóm nghiên cứu kết hợp làm việc đoàn kết và hiệu quả Em thể hiện sự sáng tạo cải tiến thiết bị và quy trình trong quá trình thực hiện đề tài Do các tố chất trên, em Vũ đủ năng lực thực hiện đề tài và được bảo vệ đề tài khóa luận tốt nghiệp trước hội đồng

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng02 năm 2022

Người nhận xét

Em xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc đến quý thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Trong suốt bốn năm học qua, bản thân em thực sự cảm kích quý thầy cô đã cho em kiến thức, bản lĩnh, tinh thần làm việc đầy khoa học và trách nhiệm

Xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Ðại học Мở Tp Hồ Chí Мinh, Giám đốc cơ sở 3 Bình Dương và Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học đã tạo môi trường học tập và thực tập thuận lợi cho em trong suốt thời gian vừa qua

Ðặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Thạc sĩ Nguyễn Thị Phương Khanh là người cho bản thân em rất nhiều kiến thức quý báu Trong suốt thời gian thực tập, em đã được cô chỉ dẫn tận tình, giúp em nỗ lực hơn trong việc học tập và hoàn thành thật tốt thực tập tốt nghiệp Мột lần nữa em xin cảm ơn cô rất nhiều

Xin cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Мinh đã cho em mượn phòng và các thiết bị để em có thể hoàn thành thật tốt thực tập tốt nghiệp của mình

Xin cảm ơn tất cả những người bạn đã cùng học tập, chia sẻ kiến thức, giúp đỡ khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp

Xin cảm ơn bố mẹ đã chăm sóc, luôn bên cạnh và động viên con rất nhiều

Bảng 1 1: Thành phần dinh dưỡng có trong 100g gạo lứt theo Bộ Y Tế viện dinh

dưỡng Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam 9

Bảng 1 2: Thành phần dinh dưỡng có trong dịch truyền đạm Aminoplasmal 10

Bảng 7 5: Thống kê năng suất sinh học quả thể nấm Cordyceps militaris 47

Bảng 7 6 Thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris tươi trong thí nghiệm 3 47

Bảng 7 7 Thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris khô trong thí nghiệm 3 47

Bảng 7 8 Thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris tươi trong thí nghiệm 4 47

Bảng 7 9 Thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris khô trong thí nghiệm 4 47

Hình 1 1: Nấm Cordyceps militaris 3

Hình 1 2: Sự hình thành nấm Cordyceps trong tự nhiên 3

Hình 1 3: Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử 4

Hình 1 4: Nấm Cordyceps militaris trong tự nhiên 5

Hình 4 1: Sinh khối nấm thu được trong môi trường bổ sung bột đậu nành 26

Hình 4 2: Sinh khối nấm thu được trong môi trường bổ sung Pepton 26

Hình 4 3: Sinh khối nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm 27

Hình 4 4: Sinh khối nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm 27

Hình 4 5: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung bột đậu nành 30

Hình 4 6: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm 30

Hình 4 7: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm 31

Hình 4 8: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm 31

Hình 4 9: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm 31

Hình 5 1: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm 34

Hình 5 2: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm và nhộng khô 34

Hình 5 3: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm và nhộng khô 35

Hình 5 4: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm và nhộng khô 35

Hình 5 5: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm và nhộng khô 35

Hình 6 1: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm 38

Hình 6 2: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm và bột đậu nành 38

Hình 6 3: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm và bột đậu nành 39

Hình 6 4: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm và bột đậu nành 39

Hình 6 5: Quả thể nấm thu được trong môi trường bổ sung dịch truyền đạm và bột đậu nành 39

MỤC LỤC

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris 3

1.2 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng trong tự nhiên của Cordyceps militaris 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái của Cordyceps militaris: 4

1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris: 5

1.3 Điều kiện nuôi trồng 6

1.6.2 Thành thành phần dinh dưỡng của nấm Cordyceps militaris: 12

1.7 Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước 13

1.7.1 Trong nước: 13

1.7.2 Ngoài nước 14

PHẦN II: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15

2.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm: 15

2.2 Vật liệu và hóa chất sử dụng trong đề tài: 15

2.3 Dụng cụ và thiết bị: 15

3.1 Nội dung nghiên cứu 16

3.2Các phương pháp nghiên cứu thực hiện 17

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy 18

3.2.2 Phương pháp Sorensen 19

3.2.3 Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm cordyceps militaris 19

3.2.4 Phương pháp đo năng suất sinh học BE% 20

3.2.5 Phương pháp cân sinh khối: 20

3.3.3 Chỉ tiêu đánh giá thí nghiệm 1 21

3.3.4 Thí nghiệm 2: khảo sát tối ưu hàm lượng Nitơ từ dịch truyền đạm minoplasmal bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris 22

3.3.5 Bố trí thí nghiệm 2 22

3.3.6 Chỉ tiêu đánh giá thí nghiệm 2 22

3.3.7 Thí nghiệm 3: khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và nhộng khô bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris 23

3.3.8 Bố trí thí nghiệm 3 23

3.3.9 Chỉ tiêu đánh giá thí nghiệm 3 23

3.4 Thí nghiệm 4: khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và bột đậu nành bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris 24

3.4.1 Bố trí thí nghiệm 4 24

3.4.2 Chỉ tiêu đánh giá thí nghiệm 4 25

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

6.1 Tài liệu tiếng việt 43

6.2 Tài liệu tiếng anh 43

PHẦN VII: PHỤ LỤC 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm dược liệu từ lâu đã được sử dụng như một loại thuốc bổ dưỡng rất quan trọng cho việc phòng và chữa bệnh trong đời sống con người Ðặc biệt, các loài trong

chi Cordyceps chứa nhiều hoạt chất (Cordycepin, adenosine, polysaccharides,

manitol,…) có giá trị dược liệu cao và được coi là thần dược quan trọng nhất trong y học cổ truyền Trung Quốc và Việt Nam [24]

Hiện nay, trong chi Cordyceps có hai loài là Cordyceps militaris và Cordyceps

sinensis đang được nghiên cứu và sản xuất do có nhiều giá trị dược liệu và giá trị kinh

tế cao [10] Nấm Cordyceps sinensis là một loài nấm dược liệu quý hiếm, chủ yếu

được thu hái trong tự nhiên và có vùng phân bố rất hạn chế, chưa được nuôi trồng tạo quả thể thành công trên môi trường nhân tạo, do đó sản lượng nấm không đủ đáp ứng

được nhu cầu thị trường [14] Loài Cordyceps militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng có giá trị dược liệu, chứa các hợp chất tương tự như của nấm Cordyceps

sinensis, có thể nuôi trồng dễ dàng trên môi trường nhân tạo [9] Do đó, để đáp ứng

nhu cầu của thị trường trong và ngoài nước, việc nghiên cứu và ứng dựng quy trình

nuôi trồng sản xuất nấm Cordyceps militaris tại Việt Nam là một vấn đề cần thiết Trong Cordyceps militaris , có rất nhiều thành phần quan trọng bao gồm các loại

acid amin thiết yếu, vitamin: B1, B2, B12 và K, các loại carbohydrate khác nhau như monosaccharide, oligosaccharidesvà các polysaccharide, protein, sterole, nucleoside và các nguyên tố vi lượng khác [21] Quả thể nấm còn chứa nhiều axit amin khác như

lysine, glutamicacid, proline và threonine Hoạt chất chính trong Cordyceps militaris là Cordycepin và adenosine, Cordyceps militaris có rất nhiều tác dụng chẳng hạn như

chống ung thư, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, bồi bổ sinh khí, tăng cường khả năng sinh lý của phái mạnh [21]

Theo Nguyễn Thị Liên Thương (2016) cho thấy, chi Cordyceps thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae và

gồm có hơn 400 loài đã được tìm thấy và mô tả, trong số đó có khoảng 36 loài đã được nuôi trồng quả thể trong điều kiện nhân tạo [6]

Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh trên một số loài côn trùng Vào mùa

Ðông nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng đến mùa Hè, hệ sợi nấm phát triển thành quả thể nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu đã chết [18]

Nitơ là nhân tố có tính quyết định tới sự tổng hợp enzyme có trong cơ thể, ảnh hưởng mạnh tới sự trao đổi sơ cấp và thứ cấp Một nguồn Nitơ cơ bản có trong môi trường bao gồm dạng vô cơ ammonium, nitrat hoặc dạng hữu cơ là các acid hoặc protein và thường sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men, peptone ở dạng riêng rẽ hay kết hợp cả hai loại ở mỗi nồng độ từ 1-5g/l Pokhrel và Ohga đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ hữu cơ và vô cơ cho sự phát triển của sinh khối nấm Trong các nguồn Nitơ sử dụng trong nghiên cứu, cao nấm men cho khả năng phát triển cao nhất với hàm lượng sinh khối đạt 7,03g/l Khi nồng độ cao nấm men thay đổi từ 0,5% – 2% thì nồng độ ở 1% cho nấm khả năng phát triển tối đa 2,46g/l Tất cả các hợp chất chưa nitơ đều cho thấy những ảnh hưởng tích cực đến quá trình tạo sinh khối nấm, lượng sinh khổi thu được lên đến xấp xỉ 2,5 đến 4,7 lần Lương sinh khối tối đa trên môi trường sử dụng hợp chất hữu cơ là 2,5-3,0g/l.[10]

Dịch truyền đạm Aminoplasmal chứa các thành phần là nitơ hữu cơ, các acid

amin và vitamin là nguồn dinh dưỡng cung cấp nitơ giúp cho hệ sợi nấm phát triển tốt

nhất trong môi trường nhân giống cấp 2 dạng lỏng của nấm Cordyceps militaris Từ

các yếu tố trên chúng tôi quyết định tìm ra nguồn dịch truyền đạm phù hợp trong môi

trường tăng sinh khối hệ sợi nấm của nấm Cordyceps militaris

Do đó, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của dịch

truyền đạm Aminoplasmal đến khả năng phát triển của Cordyceps militaris”

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris

Phân loại

Giới nấm: Fungi Phân giới: Dikarya Ngành: Ascomycota

Phân ngành: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes

Phân lớp: Hypocreomycetidae Bộ: Hypocreales

Họ: Clavicipitaceae

Chi: Cordyceps

Loài: Cordyceps Militaris

1.2 Đặc điểm hình thái và sinh trưởng trong tự nhiên của Cordyceps militaris

1-Bướm đẻ trứng; 2-Sâu non hình thành và di chuyển vào lòng đất; 3-Sâu non bị nấm Cordyceps ký sinh;

Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, Cordyceps militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đông Bào tử nấm theo gió dı́nh vào bên ngoài ký chủ, sau đó từ bào tử hı̀nh thành các ống nảy mầm có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thể và gây chết ký chủ Ðến cuối hè hoặc thu quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí [12][13]

Các quả thể nấm Cordyceps militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng và cs, 2011) Nấm Cordyceps militaris có các dạng bào tử khác nhau trong chu trı̀nh sống của nấm Ở các điều kiện môi trường khác nhau, sự hı̀nh thành các dạng bào tử cũng cho thấy sự khác biệt, như việc tạo bào tử tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn hoặc các chồi bào tử tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng [6]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của Cordyceps militaris:

Nấm Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh trên bướm và sâu bướm, có màu

cam, chiều dài 8 - 10 cm Ðầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa Các nang bào tử dài từ 300 - 510 µm, bề rộng 4 µm Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, ̣ kích thước 3.5 - 6 × 1- 1.5 µm Các bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp Loài có phân bố rộng ở Bắc Мỹ, châu Âu và châu Á [17]

Hình 1 3: Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử

1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris:

Nấm Cordyceps militaris, là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu

trưởng thành của một số loài côn trùng Loài nấm đầu tiên các nhà khoa học Trung

Quốc xác định trên vùng núi trên cao nguyên Tây Tạng thuộc chi Cordyceps là

Cordyceps sinensis ký sinh vào ấu trùng của loài bướm thuộc chi Thitarodes Năm

1878, các nhà khoa học phát hiện ra loài Cordyceps militaris cũng ký sinh trên ấu

trùng của các loài côn trùng thuộc chi Thitarodes [11][19]

(Nguồn: http://vienbaovethucvat.com.vn)

Loài Cordyceps militaris được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Cordyceps và

cũng là loài có số lượng ký chủ đa dạng nhất Khả năng thích nghi của loài này cao nên chúng được tìm thấy ở nhiều khu hệ sinh thái trên trái đất Ký chủ phổ biến của

loài Cordyceps militaris trong tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng của các loài bướm, côn trùng cánh cứng (Coleoptera), cánh màng (Hymenoptera) và hai cánh (Diptera) như: Ips sexdentatus, Lachnosterna quercina, Tenebrio molitor (thuộc cánh cứng),

Cimbex similis (thuộc cánh màng) và Tipula paludosa (thuộc họ hai cánh) Trong tự

nhiên có nhiều loài Cordyceps có hình thái tương tự hoặc gần giống loài Cordyceps

Hình 1 4: Nấm Cordyceps militaris trong tự nhiên

militaris, bao gồm Cordyceps cardinalis, Cordyceps Kyusyuensis A Kawam., Cordyceps pseudomilitaris HywelJones & Sivichai, Cordyceps rosea Kobayasi & Shimizu, Cordyceps roseostromata Kobayasi & Shimizu, Cordyceps washingtonensis

1.3.2 Ánh sáng

Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tạo quả thể nấm Trong điều kiện che tối, việc tạo quả thể bị ức chế (Gao và cs, 2000; Sato và Shimazu, 2002) Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của nấm có thể dao động tùy chủng nấm, tuy nhiên từ 500-1000 lux được xem là điều kiện thı́ch hợp nhất (Sung và cs, 1999; Gao và cs, 2000; Sato và Shimazu, 2002) Cần thiết kế các chế độ chiếu sáng phù hợp trong phòng nuôi khi nuôi trong điều kiện nhân tạo đối

với nấm Cordyceps militaris [6]

1.3.3 Độ thoáng khı́ và ẩm độ։

Ðộ thoáng khı́ tốt kı́ch thích sự sinh trưởng của tơ nấm và tổng sinh khối nấm Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng màng bao HFМ (Hydrophobic Fluoropore

Мembrane) cho kết quả tốt nhất về hiệu suất quả thể nấm Cordyceps militaris (Zhang

và cs, 2010) Khoảng ẩm độ thı́ch hợp cho nấm dao động từ 70– 90 %, tương đương với độ ẩm không khí trong tự nhiên sẽ phù hợp cho việc tạo quả thể Khi độ ẩm thấp sẽ làm môi trường khô nhanh hạn chế sự phát triển của tơ nấm cũng như quả thể Do đó, trong phòng nấm cần bổ sung ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn

Ngoài độ thoáng khí và ẩm độ, dịch nuôi cấy Cordyceps militaris cần được chú ý duy

trı̀ nhiệt độ 20–25°C và bổ sung các nguồn dinh dưỡng như carbohydrate, nitrogen và muối khoáng [20]

1.4 Dinh dưỡng nuôi trồng

1.4.1 Nguồn Cacbon

Nguồn cacbon là thành phần chính của môi trường dinh dưỡng, đảm bảo cho sự

phát triển của vi sinh vật và tạo hợp chất thứ cấp như polysaccharide, Cordycepic

acid Mặc dù, nhiều nghiên cứu coi sử dụng glucose như một nguồn cacbon thích hợp

và cơ bản, tuy nhiên một số nghiên cứu cũng đã so sánh ảnh hưởng của các nguồn

cacbon khác nhau tới sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp Và việc tạo ra các hợp chất polysaccharide và Cordycepic acid

Khi lên men Cordyceps sp Pokhrel và Ohga đã sử dụng 7 nguồn cacbon khác

nhau ở cùng nồng độ 30g/l trong môi trường cơ bản Trên các môi trường ở nguồn cacbon khác nhau, kết quả thu được về sinh khối nấm cũng như các hợp chất có hoạt tính sinh học cũng rất khác biệt Trong 7 nguồn cacbon, lượng sinh khối nấm tốt nhất là lactose xếp sau là glucose và fructose (6,36 – 6,73 g/l) Các tác giả cho rằng các nguồn cacbon khác nhau đã ảnh hưởng tới cơ chế ức chế dị hóa của trao đổi thứ cấp Glucose hoặc maltose dễ dàng sử dụng hơn vì glucose là thành phần đường cơ bản của các Exopolysaccharide ngoại bào

1.4.2 Nguồn Nitơ

Nitơ là nhân tố có tính quyết định tới sự tổng hợp enzyme có trong cơ thể, ảnh hưởng mạnh tới sự trao đổi sơ cấp và thứ cấp Một nguồn Nitơ cơ bản có trong môi trường bao gồm dạng vô cơ ammonium, nitrat hoặc dạng hữu cơ là các acid hoặc protein và thường sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men, peptone ở dạng riêng rẽ hay kết hợp cả hai loại ở mỗi nồng độ từ 1-5g/l Pokhrel và Ohga đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ hữu cơ và vô cơ cho sự phát triển của sinh khối nấm Trong các nguồn Nitơ sử dụng trong nghiên cứu, cao nấm men cho khả năng phát triển cao nhất với hàm lượng sinh khối đạt 7,03g/l Khi nồng độ cao nấm men thay đổi từ 0,5% – 2% thì nồng độ ở 1% cho nấm khả năng phát triển tối đa 2,46g/l Tất cả các hợp chất chưa nitơ đều cho thấy những ảnh hưởng tích cực đến quá trình tạo sinh khối nấm, lượng sinh khổi thu được lên đến xấp xỉ 2,5 đến 4,7 lần Lương sinh khối tối đa trên môi trường sử dụng hợp chất hữu cơ là 2,5-3,0g/l

1.5 Thành phần dinh dưỡng và dịch truyền đạm Aminoplasmal

1.5.1 Gạo lứt

Trong môi trường nuôi trồng nấm Cordyrceps militaris, gạo là thành phần

chính Gạo lứt thường được sử dụng do vẫn còn lớp vỏ cám bên ngoài hạt chứa nhiều vitamin B1 [2] Gạo lứt đỏ với lớp vỏ cám rất dày bao gồm chất tinh bột, chất béo, chất đạm, chất xơ cùng các vitamin như B1, B2, B3, B6; các axit như paraaminobenzoic (PABA) pantothenic (vitamin B5), folic (vitamin M), phytic; các nguyên tố vi lượng như canxi, selen, glutathion (GSH), sắt, magie, kali và natri

Bảng 1 1: Thành phần dinh dưỡng có trong 100g gạo lứt theo Bộ Y Tế viện dinh dưỡng Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam

1.6 Các hoạt chất sinh học và thành thành phần dinh dưỡng của nấm

Cordyceps militaris

Các tác động được cho là của nấm Cordyceps militaris là chống ung thư, chống

di căn, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, diệt khuẩn, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ thần kinh và bảo vệ thận Cụ thể, polysaccharide đảm nhiệm chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, chống di căn khối u, điều hòa miễn dịch

Cordycepin đảm nhiệm chống ung thư, chống nhiễm khuẩn Ergosterol ức chế ung thư

và điều hòa miễn dịch

1.6.1Các hợp chất dược liệu

Các hoạt chất dược liệu của loài nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong điều trị

bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá tri ̣ kinh tế cao Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên Vì vậy, việc sản xuất ở quy mô lớn

các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện

đang là một vấn đề cấp thiết.[6]

Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất Cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ nấm

cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch.[6]

Hoạt tı́nh kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hơp chất CM-hs-CPS2 chứa

trong dịch chiết nấm C.militaris có khả năng bắt gốc tự do Hoạt tı́nh khử và tạo phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85.[6]

Tăng số lượng tinh trùng: ̣ Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm từ Cordyceps militaris, số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hı̀nh dạng bı̀nh thường tăng Hiệu quả này được duy trı̀ thậm chí sau 2 tuần ngưng sử dụng

chế phẩm Lượng Cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên

có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn.[6]

Hạn chế vius cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A

Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào.[6]

Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng ung thư: Protein (CМP) tách chiết từ nấm có

kı́ch thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7−9 Protein này ức chế nấm Fusarium oxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quan (Byung-Tae et

al., 2009) Hơp chất Cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium

Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh

nhiễm khuẩn đường ruột (Young-Joon ̣ et al., 2000) Cordycepin ngăn sự biểu hiện

của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua viêc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch.[6]

Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có

hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin ̣ Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người.[6]

Tı́nh kháng viêm: Ðể xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dich chiết từ quả

thể nấm Cordyceps militaris (CМWE) được thử nghiệm về tác dụng kiểm soát

lipopolysaccharide (LPS) (chịu ̣ trách nhiệm kı́ch thı́ch việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7 Các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CМWE làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết Những ̣ kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào.[6]

1.6.2 Thành thành phần dinh dưỡng của nấm Cordyceps militaris:

Kết quả nghiên cứu của Hur H (2008) cho thấy trong quả thể nấm Cordyceps

militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g

trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm) Khối lượng acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15-15,06 mg/g và 0,36- 2,99 mg/g Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) Số liệu phân tích của Chang và cs (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) [8]

• Acid béo:

Acid béo bao gồm cacbon, hydro và oxy Ở Cordyceps lượng acid béo no được

tìm thấy là 57,84% gồm có C16:1, C17:1, C18:1, C18:2 Acid linoleic chiếm hàm lượng cao nhất 38,44%, tiếp đó là acid oleic 17,94% Các acid béo không no chiếm 42,16% bao gồm C14, C15, C16, C17, C18, C20 và C22 Acid palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là 21,86% và 15,78% Các acid béo không no có chức năng giảm lipid máu và bảo vệ chống lại bệnh tim mạch, chứa một loạt các hợp chất dinh dưỡng như các acid amin thiết yếu : Vitamin E và K, các vitamin tan trong nước như B1, B2 và B12, nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Ti, Cr, Ga, V).[11]

- Adenosine và Cordycepin:

Adenosine và Cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm Cordyceps

militaris Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm Ðối

với hợp chất Cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối

(0,97% so với 0,36%) [10]

- Polysaccharide:

Nấm Cordyceps được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản xuất thực phẩm

chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh Chúng chứa rất nhiều loại đường bao gồm mono-, di- và các oligosaccharide và nhiều polysaccharides phức tạp [11]

Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động ung thư của các tế bào ung thư Trong một số loại nấm, polysaccharide liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide – protein hoặc polysaccharide – peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn [11]

1.7 Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước

1.7.1 Trong nước:

Theo Nguyễn Thị Minh Hằng và cộng sự, (2017), “Nghiên cứu nuôi trồng nấm

Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tổng hợp và nhộng tằm” Tác

giả đã sử dụng nhiều nguyên liệu khác nhau bổ sung vào các dạng môi trường khác nhau để khảo sát về môi trường tạo quả thể và môi trường nhân giống Ðặc biệt là môi nhân giống lỏng gồm các tỷ lệ thành phần (20g/l glucose + 5 g/l pepton + 5 g/l cao

nấm men + 0,5 g/l MgSO4 7H2O + 0,25 g/l KH2PO4) Kết quả cho thấy hệ sợi phát triển nhanh (chỉ 5 ngày hệ sợi đã ăn kín bề mặt môi trường).[4]

1.7.2 Ngoài nước

Theo Xie và cộng sự (2009b), Nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

đến sinh khối nấm và sinh tổng hợp Cordycepin nội bào của Cordyceps militaris trong

môi trường tự nhiên Kết quả cho thấy môi trường tự nhiên là hỗn hợp của 53% bột gạo lứt, 6% bia tươi, 42% nước ép đậu nành được sử dụng để lên men trong bình lắc Nhiệt độ lên men 28℃, pH 6.2 và dung tích trung bình 57ml [22]

Theo Gao et al (2000) cho biết nấm Cordyceps militaris yêu cầu hàm lượng nitơ

tương đối thấp Nếu hàm lượng nitơ quá nhiều trong môi trường sẽ làm chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, tỷ lệ C/N vào khoảng 4/1 – 6/1 là thích hợp, giai đoạn sinh trưởng sinh thực tỷ lệ thích hợp từ 10/1 – 15/1

PHẦN II: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm:

Ðịa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại: Trường Ðại học Mở Tp.HCM (cơ cở 3 Bình Dương)

Thời gian: 1/2021 – 8/2021

2.2 Vật liệu và hóa chất sử dụng trong đề tài:

- Giống nấm dùng phân lập: Giống nấm Cordyceps militaris được nuôi trồng tại 68

Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương (cơ sở 3 Bình Dương Trường Ðại học Mở thành phố Hồ Chí Minh)

- Bột đậu nành - Gạo lứt tím than

- Khoai tây: Chọn những củ không nảy mầm, còn tươi và sạch bệnh - Nhộng khô

- Dịch truyền đạm Aminoplasmal

2.3 Dụng cụ và thiết bị:

- Dụng cụ: Nồi nấu, đĩa petri, đồng hồ, Erlen 250 ml, đèn cồn, giấy lọc, cán dao số 3, dao mổ số 12, khăn sạch, bật lửa, phễu lọc, đũa thủy tinh, bình định mức 1000 ml,…

- Thiết bị: Máy lắc tròn, bếp gas, nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân phân tích, máy chụp ảnh,…

- Hóa chất: Ðường D-glucose, Kalidyhydro phosphate (KH2PO4.3H2O), Magie sunphate (MgSO4.7H2O), cồn 96o, NaOH, HCl

PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch truyền đạm Aminoplasmal đến sự tăng sinh của hệ sợi nấm Cordyceps militaris

Khảo sát tối ưu hàm lượng Nitơ từ dịch truyền đạm Aminoplasmal bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

Khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và bột đậu nành bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

Khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và nhộng khô bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

3.2 Các phương pháp nghiên cứu thực hiện Sơ đồ quy trình nuôi cấy:

GIỐNG CẤP 2 (Môi trường lỏng)

Khảo sát tối ưu hàm lượng Nitơ từ dịch

Aminoplasmal bổ sung

vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm

Cordyceps militaris.

HỘP

(Môi trường rắn)

Khảo sát ảnh hưởng của dịch truyền đạm Aminoplasnal đến sự tăng sinh của hệ sợi nấm Cordyceps

militaris

Khảo sát sự kết hợp từ

Aminoplasmal và nhộng khô bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể

militaris

Khảo sát sự kết hợp

từ dịch truyền Aminoplasmal và bột đậu nành bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

TN1

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Мôi trường thạch dinh dưỡng PDA (Potato D-glucose Agar)

Thành phần: Khoai tây(*)

D – glucose Agar

Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) pH: 6.0 - 6.5

Мôi trường giống lỏng: Thành phần:

Khoai tây(*) D-glucose Cao nấm men KH2PO4

MgSO4.7H2O Vitamin B1

Nguồn bổ sung Nitơ

(Pepton, bột đậu nành, dịch truyền đạm) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)

pH: 6.0 - 6.5 Мôi trường giá thể:

Thành phần:

Gạo lứt Khoai tây(*) D-glucose Saccarozo KH2PO4MgSO4.7H2O Vitamin B1

Bột đậu nành: Khảo sát

Dịch truyền đạm Aminoplasmal: Khảo sát

Khảo sát

Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) pH: 6.0 - 6.5

(*)Khoai tây: Chọn những củ không nảy mầm, rửa sạch, gọt vỏ, dùng dao cắt nhỏ, cho vào nồi, bổ sung 1000 ml nước cất, đun sôi từ 15 – 20 phút, lọc thu dịch chiết, bổ sung các chất dinh dưỡng rồi định mức lên 1000 ml Ðối với môi trường bổ sung khoáng cần chỉnh pH về 6.0 – 6.5 bằng dd NaOH 0.05N Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 30 phút Kiểm nhiễm sau 24h và tiến hành cấy

3.2.2 Phương pháp Sorensen

Cho vào bình nón 20ml dung dịch chứa axit amin và 0,5ml dung dịch phenolphtalein 1% Ðể trung hòa dung dịch axit amin, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt Cho thêm 20ml dung dịch fomanđehit 30% đã trung hòa và lắc đều bình nón Sau 5 phút dung dịch mất màu Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt trở lại (pH = 9,0) Thí nghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tương tự với các hoá chất trên nhưng thay dung dịch chứa axit amin bằng nước cất cùng thể tích

Xác định hàm lượng (mg) acid amin trong mẫu

1 ml dung dịch NaOH 0,1N tương đương l, 4 mg nitơ Số mg nitơ amin của dung dịch nghiên cứu được tính theo công thức:

mgN = (A - B) x 1, 4

Trong đó: A – Số ml NaOH 0, 1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm B – Số ml NaOH 0, 1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra

3.2.3 Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm cordyceps militaris

Cân trọng lượng tươi trong từng hộp: Cân khối lượng đĩa nhựa М1, cắt quả thể nấm sát đế rồi bỏ lên đĩa nhựa đem đi cân М2

М0: Khối lượng tươi М1: Khối lượng đĩa nhựa

М2: Khối lượng cả nấm lẫn đĩa

M0=M2- M1

Cân trọng lượng khô trong từng hộp: Lấy khối lượng tươi М0 của từng hộp mang đi sấy ở 40oC trong 24h đến 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không đổi

3.2.4 Phương pháp đo năng suất sinh học BE%

Năng suất sinh học BE tính theo phương pháp BE= ố ượ ả ể ươ

ố ượ ơ ấ ∗ 100

3.2.5 Phương pháp cân sinh khối:

Sử dụng phương pháp cân sinh khối, được thực hiện như sau: Cắt những miếng giấy lọc có kích thước bằng nhau, ghi số theo từng nghiệm thức và theo mỗi lần lặp lại, cho sấy cùng một lúc với nhiệt độ là 100oC, cứ 15p đem ra cân một lần, sấy tới khi 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không thay đổi thì dừng lại

Hút lượng dung dịch môi trường (lắc đều) cần khảo sát với thể tích bằng nhau từ các nghiệm thức trong thí nghiệm lọc qua giấy lọc trên phễu, sau khi lọc xong hết tất cả, đem sấy cùng một lúc với nhiệt độ 100oC, cứ sau 15p đem cân một lần, sấy tới khi 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không thay đổi thì dừng lại, lúc này khối lượng sinh khối đã đạt được khối lượng không đổi

Dùng cân phân tích 4 số để cho kết quả chính xác, cân lần lượt từng mẫu giấy chứa sinh khối đã sấy khô và ghi lại kết quả

Sau khi thu được kết quả hoàn chỉnh ta dùng công thức này để tính được khối lượng sinh khối cần khảo sát:

Khối lượng sinh khối của sợi tơ nấm ( Gram) = M2 – M1

Trong đó:

M1: khối lượng giấy ban đầu sau khi sấy ( Gram)

M2: Khối lượng giấy chứa sinh khối sau khi sấy ( Gram) 3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được xử lý thống kê trên phần mềm Stagraphis plus 3.0 và Excel

3.3.3 Chỉ tiêu đánh giá thí nghiệm 1

Thời gian 5 ngày sau khi cấy đem lọc dung dịch cân sinh khối nấm tươi và khô

KÝ HIỆU NGHIỆM THỨC SINH KHỐI TƯƠI (G)

SINH KHỐI KHÔ (G)

3.3.4 Thí nghiệm 2: khảo sát tối ưu hàm lượng Nitơ từ dịch truyền đạm

Aminoplasmal bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

Mục đích: Xác định hàm lượng tối ưu của dịch truyền đạm Aminoplasmal bổ

sung vào giá thể nuôi nấm Cordyceps militaris để phát triển tốt nhất

3.3.6 Chỉ tiêu đánh giá thí nghiệm 2

- Trọng lượng tươi (gram), Trọng lượng khô (gram), năng suất sinh học BE

KÝ HIỆU NGHIỆM THỨC

KHỐI LƯỢNG TƯƠI (G)

KHỐI LƯỢNG KHÔ (G)