nghiên cứu khả năng phòng trừ sinh học của chủng nấm kí sinh côn trùng isaria fumosorosea bb v3 đối với ruồi đục trái bactrocera dosalis

xQx -NGUYỄNTHANH TRIỀU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ

Isaría fumosorosea Bb-V3 ĐỐI VỚI RUỒI ĐỤC TRÁI Bactrocera dosalís

KHÓALUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

-x0x - jj

NGUYỄN THANH TRIỀU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ

Isaría fumosorosea Bb-V3 ĐỐI VỚI RUỒI ĐỤC TRÁI Bactrocera dosalis

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Nguyễn Thanh Triều

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

PHIẾU NHẬN XÉT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên GV : Nguyễn Ngọc Bảo Châu Học hàm - học vị : Tiến Sĩ

Đơn vị công tác : Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Mở TP.HCM

Tên đề tài : NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM KÍ

SINH CÔN TRÙNG Isaria fumosorosea Bb-V3 ĐỐI VỚI RUỒI ĐỤC TRÁI Bactrocera

dosalis

1 Tinh thần và thái độ làm việc :

Sinh viên có tinh thần học hỏi và trách nhiệm với công việc của mình Có tinh thần hỗ trợ giúp đỡ bạn bè

Thường xuyên trao đổi với giảng viên, tra cứu tài liệu và biết lắng nghe

2 Nội dung đề tài :

- Một số đặc điểm sinh học chủng nấm Isaria fumosorosea

- Chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 phát triển tốt nhất trong môi trường PDA ở pH là 5,5,

- Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis của chủng nấm Isaria

fumosorosea Bb-V3 cho thấy nồng độ 109 bào tử/ml cho hiệu quả diệt nhộng ruồi đục trái

Bactrocera dosalis tốt nhất đạt 73,72% sau 10 ngày phun dịch bào tử nấm - Tạo môi trường để sản xuất chế phẩm từ chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3

- Kết quả khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ chế phẩm (mật độ bào tử 109 bào tử/ml) của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 cho thấy hình thức trộn nấm chung với đất cho hiệu quả tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis tốt nhất đạt 73,81% sau 10 ngày trộn chế phẩm nấm

Chữ ký của Giảng viên (Ghi rõ họ và tên)

Nguyễn Ngọc Bảo Châu

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm Động Vật Học- Trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh đã để lại trong em nhiều kỉ niệm đẹp, kiến thức và kinh nghiệm quý báu Để hoàn thành đề tài thực tập này, ngoài sự nỗ lực của bản thân em còn nhận được sự giúp đỡ, động viên, khích lệ của thầy cô, người thân, bạn bè trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô giáo, cán bộ Khoa Công Nghệ Sinh Học- Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và hướng dẫn em hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài

Em xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu là người đã dẫn dắt, định hướng cho em những từ những bước đầu thực hiện đề tài, tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn góp ý, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ về chuyên môn và tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Và em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ em trong suốt những năm tháng học tập rèn luyện tại Trường cũng như thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2021 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thanh Triều

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh ruồi đục trái Bactrocera dosalis đang phá hoại trên trái xoài.( Nguồn

www.agriculture-biodiversite-oi.org) 4

Hình 1.2 Hình ảnh gây hại của ruồi đục trái Bactrocera dosalis trên cây khổ qua 6

Hình 1.3 Hình ảnh ruồi đục trái Bactrocera dosalis trưởng thành 7

Hình 1.4 Vòng đời ruồi đục trái Bactrocera dosalis ( nguồn Internet) 8

Hình 1.5 Chu trình xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng 10

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng 12

Hình 2.1 Hình ảnh giống chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 trong phòng thí nghiệm Động vật học 22

Hình 2.2 Hình ảnh nhân nuôi lấy nhộng ruồi đục trái từ khế 25

Hình 2.3 Hình ảnh bố trí thí nghiệm hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis trong điều kiện phòng thí nghiệm 33

Hình 2.4 Hình ảnh bố trí thí nghiệm hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis của chế phẩm từ chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở ngoài vườn 35

Hình 3.1 kích thước bào tử bề dọc (A), bề ngang (B) và sợi nấm (C) của chủng nấm Isaria fumososea Bb-V3 được nuôi cấy trên môi trường PDA sau 15 ngày 37

Hình 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở mặt trên (A) và mặt dưới (B) đĩa petri 37

Hình 3.3 Thời gian nuôi cấy đến đường kính khuẩn lạc của chủng nấm I fumosorosea Bb-V3 lần lượt (A) 6 NSNC, (B) 8 NSNC, (C) 10 NSNC, (D) 12 NSNC 42

Hình 3.4 Hình ảnh nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis bị nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 kí sinh khi phun dịch bào tử nấm sau 10 ngày 45

Hình 3.5 Môi trường cấp 1 (A), môi trường cấp 2 ( B) sau 20 ngày nuôi cấy 47

Hình 3.6 Hình ảnh nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 kí sinh lên nhộng ruồi đục trái

Bactrocera dosalis ở dạng rải chế phẩm (DRN) lên bề mặt (A), ở dạng trộn chế phẩm

(DTN) với đất (B) và đối chứng (C) sau 10 ngày thí nghiệm trong phòng thí nghiệm 49

Hình 3.7 Hình ảnh nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis bị nấm Isaria fumosorosea

Bb-V3 kí sinh ở ngoài vườn RN (A), TN (B), Đối chứng ( C) sau 10 ngày ở ngoài vườn

51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng bố trí thí nghiệm hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocea dosalis.

33Bảng 3.1 pH ảnh hưởng đến đường kính khuẩn lạc và sự phát triển bào tử của chủng

nấm I fumosorosea Bb-V3 sau 12 ngày nuôi cấy 38

Bảng 3.2 Nhiệt độ ảnh hưởng đến đường kính khuẩn lạc và sự phát triển bào tử của

chủng nấm I fumosorosea Bb-V3 sau 12 ngày nuôi cấy 39

Bảng 3.3 Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến đường kính khuẩn lạc và sự phát triển bào

tử của chủng nấm I fumosorosea Bb-V3 sau 6, 8, 10, 12 ngày nuôi cấy 40

Bảng 3.4 Hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái của dịch chết nấm ở mật độ bào tử khác nhau trong điều kiện phòng thí nghiệm 42

Bảng 3.5 Mật độ bào tử nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 của môi trường cấp 1 sau 5, 10,

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình các bước thực hiện thí nghiệm 24

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Isaria

trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 32

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BVTV PDA

Bảo vệ thực vật Potato Dextrose Agar VQG

NSNC NSTH DTN

DRN

Vườn quốc gia Ngày sau thực hiện Ngày sau thực hiện Dạng trộn nấm Dạng rải nấm

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ RUỒI ĐỤC TRÁI Bactrocera dosalis 4

1.1.1 Phân bố và kí chủ của ruồi đục trái Bactrocera dosalis 4

1.1.2 Tập tính sống và gây hại của ruồi đục trái Bactrocera dosalis 5

1.1.3 Đặc điểm hình thái của ruồi đục trái Bactrocera dosalis 6

1.1.4 Vòng đời của ruồi đục trái Bactrocera dosalis 7

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG 8

1.2.1 Khái niệm 8

1.2.2 Chu trình lây nhiễm của nấm kí sinh côn trùng 9

1.2.3 Tình hình nghiên cứu nấm kí sinh côn trùng trên thế giới 14

1.2.4 Tình hình nghiên cứu nấm kí sinh côn trùng ở Việt Nam 17

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 21

2.2 VẬT LIỆU 21

2.2.1 Nguồn ruồi đục trái Bactrocera dosalis 21

2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm 21

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG 22

2.3.1 Thiết bị 22

2.3.2 Dụng cụ 22

2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm 23

2.4 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 23

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 23

2.4.2 Nhân nuôi nguồn ruồi đục trái Bactrocera dosalis 25

2.4.3 Quan sát đặc điểm hình thái sinh học của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3… 25

2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành bào tử chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 26

2.4.5 Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis của dịch bào tử nấm từ chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau trong điều kiện phòng thí nghiệm 29

2.4.6 Tạo môi trường thích hợp để sản xuất chế phẩm từ chủng nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 31

2.4.7 Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ chế phẩm của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 trong điều kiện phòng thí nghiệm… 32

2.4.8 Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ chế phẩm của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở ngoài vườn 34

2.4.9 Phương pháp thống kê số liệu 35

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Mô tả đặc điểm hình thái sinh học của chủng nấm I fumosorosea Bb-V3 37

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 38

3.2.1 Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của chủng nấm Isaria

3.4 Tạo môi trường thích hợp để sản xuất chế phẩm từ chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 45

3.5 Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ chế phẩm của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 trong điều kiện phòng thí nghiệm 47

3.6 Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ chế phẩm của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở ngoài vườn 50

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên rất thuận lợi cho cây trồng phát triển Đi đôi với cây trồng phát triển là sâu bệnh hại cũng phát sinh, chúng gây hại đáng kể về mặt năng suất Hằng năm, theo thống kê của chi cục BVTV, các loài sâu bệnh hại đã làm thiệt hại khoảng 40 – 50% năng suất và sản hưởng nghiêm trọng đến phẩm chất của nông sản Một trong những loại dịch hại nguy hiểm dược biết đến trong những năm gần đây là loài ruồi đục trái gây ra Ruồi đục trái thuộc

bộ Diptera họ Tephritidae giống Bactrocera Ruồi cái trưởng thành đẻ vào trong quả,

trứng và sâu non phát triển trong quả làm cho quả bị thối hỏng, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm bệnh gây hại, gây rụng quả và làm giảm nghiêm trọng năng suất, chất lượng và mẫu mã quả, nhiều ghi nhận cho thấy chúng có khả năng gây thiệt hại 100% sản lượng quả ( CABI, 2016)

Ruồi đục trái Bactrocera dosalis là dịch hại khó đạt hiệu quả cao trong việc phòng

trừ vì những nguyên nhân sau: phổ ký chủ rộng, khả năng đẻ trứng cao, sâu non gây hại trong quả, vòng đời ngắn, dễ bùng phát số lượng và chúng có khả năng lây nhiễm cao do trưởng thành có thể bay xa 100 km/năm ( CABI, 2016) Kết quả nghiên cứu của Trần Văn Hậu và cộng sự (2015) cho thấy cây xoài cát Hòa Lộc không phun thuốc phòng trừ ruồi đục trái trong mùa khô tỉ lệ trái bị nhiễm ruồi có thể lên đến 80-85% Các loài ruồi

đục trái gây hại quan trọng nhất gồm các loài Bactrocera dorsalis (ruồi phương Đông),

Bactrocera correcta và Bactrocera cucurbitae

Để phòng trừ ruồi đục trái , người nông dân chủ yếu dựa vào biện pháp sử dụng thuốc hóa học và bao quả bằng nilon Thực tế cho thấy các biện pháp phun thuốc bảo vệ thực vật đem lại hiệu quả phòng trừ cao, giải quyết nhanh những trận dịch lớn, sử dụng đơn giản, thuận tiện Vì vậy, các biện pháp hóa học đã trở thành biện pháp chủ yếu trong quy trình trồng các loại cây ăn trái ở Việt Nam Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc hóa học vừa gây lãng phí trong sản xuất, làm tăng khả năng kháng thuốc và hơn cả là việc quá lạm dụng sẽ tác động rất xấu đến môi trường xung quanh, gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí cũng như ảnh hưởng đến các sinh vật xung quanh, kẻ thù tự nhiên của

sâu hại bị thuốc hóa học tiêu diệt, phá vỡ cân bằng sinh học trong tự nhiên Việc sử dụng nilon để bao quả làm tăng chi phí sản xuất, tốn thời gian, nilon lâu phân hủy trong môi trường gây ô nhiễm môi trường Một trong những giải pháp hiệu quả hiện nay là sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ sinh học để nhằm tăng cường sức khỏe cây trồng cũng như giúp bảo vệ cây phòng ngừa các tác nhân gây bệnh Nấm kí sinh côn trùng có khả năng lây nhiễm trên rất nhiều loại sâu hại khác nhau, ngoài ra nấm kí sinh côn trùng không chỉ tiêu diệt trực tiếp sâu hại vào thời kì phá hoại mà còn tích lũy trên đồng ruộng truyền cho thế hệ tiếp theo ( Lê Anh Tuấn, 2013) Từ đó cho thấy triển vọng sử dụng nấm kí sinh côn trùng có hoạt lực mạnh như là một chiến lược kiểm soát sâu bệnh hại thay thế Vì vậy, việc nghiên cứu và áp dụng đa dạng các chế phẩm nấm ký sinh côn trùng là cần thiết, góp phần thân thiện với môi trường để quản lý sự gây hại của côn trùng Xuất phát từ lý do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ NGHIÊN CỨU KHẢ

NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG Isaria

fumosorosea Bb-V3 ĐỐI VỚI RUỒI ĐỤC TRÁI Bactrocera dosalis ”

❖ Mục tiêu:

sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3.

❖ Nội dung nghiên cứu:

chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3.

của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau trong điều kiện

phòng thí nghiệm.

nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 trong điều kiện phòng thí nghiệm và

ngoài vườn.

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ RUỒI ĐỤC TRÁI Bactrocera dosalis

Ruồi đục trái có tên khoa học là Bactrocera dosalis

Bộ: Diptera Họ: tephritidae Chi: Bactrocera

Loài: B dosalis

1.1.1 Phân bố và kí chủ của ruồi đục trái Bactrocera dosalis

Hình 1.1 Hình ảnh ruồi đục trái Bactrocera dosalis đang phá hoại trên trái xoài.(

Nguồn www.agriculture-biodiversite-oi.org)

Ruồi đục trái Bactrocera dosalis được mô tả ban đầu từ Đài Loan, là một trong

những loài phá hoại mạnh nhất ở Đông Á và Thái Bình Dương Phạm vi phân bố của nó bao gồm Pakistan và Ấn Độ đến miền nam Nhật Bản, Indonesia đến Micronesia, và quần đảo Mariana và Hawaii Tình cờ du nhập vào Hawaii vào năm 1944 - 1945 (Fullaway DT, 1947), loài gây hại này hiện có mặt trên tất cả các hòn đảo lớn của Hawaii Ở Hawaii,

ấu trùng được tìm thấy trong hơn 125 loại vật chủ Ruồi đục trái Bactrocera dosalis đã

được ghi nhận từ 478 loại trái cây và rau quả (USDA, 2016), bao gồm: mơ, bơ, chuối, cam quýt, cà phê, sung, ổi, quất, xoài, quả hồng, đu đủ, chanh dây, đào, lê, hồng, dứa,

cherry và cà chua Tuy nhiên, bơ, xoài và đu đủ bị tấn công nhiều nhất Chúng hiện diện và phá hoại cây trồng khắp mọi nơi, gây tổn thất đến năng suất, chất lượng cây ăn trái và là đối tượng kiểm dịch gắt gao trong việc xuất nhập khẩu rau quả

1.1.2 Tập tính sống và gây hại của ruồi đục trái Bactrocera dosalis

Ruồi đục trái Bactrocera dosalis thường thích vườn trái cây um tùm, rậm rạp, nhất

là vườn cam, bưởi, ổi gần ven rừng Vào tháng 5 con trưởng thành bắt đầu xuất hiện trong các vườn cam, vườn bưởi,… Từ tháng 7 trở đi ruồi đục trái hoạt động mạnh, chúng tìm trái cây chín sớm để đẻ trứng có thể đây là lứa đầu tiên Đến tháng 8, tháng 9 khi trái cây bắt đầu chín, mật độ ruồi đục trái gia tăng rõ rệt, đỉnh cao mật độ lớn vào cuối tháng 10 đầu tháng 11 thu hoạch trái cây xong, ruồi chuyển sang cây trồng khác Ruồi trưởng thành chủ yếu kiếm ăn vào buổi sáng Chúng tìm kiếm thức ăn trong tất cả các loại thảm thực vật, bao gồm cả cây che phủ thấp và cây bụi, và có thể di chuyển đến những khu vực không có cây ký chủ (Christenson và Foote, 1960) Nếu không có thức ăn, chúng sẽ chết trong vòng ba ngày (Christenson và Foote, 1960)

Sự phá hoại mùa màng do ruồi đục trái Bactrocera dosalis gây ra là do ruồi cái

trưởng thành đẻ trứng trong quả và mô mềm của các bộ phận sinh dưỡng của một số cây nhất định Sau đó ấu trùng ăn và phân hủy mô thực vật do đó các vi sinh vật thứ cấp xâm nhập Sâu non ăn quả là gây hại nhất Thiệt hại thường bao gồm sự phân hủy các mô và thối rữa bên trong liên quan đến sự phá hoại của dòi, nhưng điều này thay đổi tùy theo loại trái cây bị tấn công (Steiner, 1957) Trái non bị nhiễm bệnh trở nên méo mó, chai sạn và thường rụng; quả chín bị tấn công phát triển có vẻ ngoài bị ngâm nước Ấu trùng ăn thịt quả cung cấp các điểm xâm nhập cho vi khuẩn và nấm làm cho quả bị thối Khi chỉ có một vài ấu trùng phát triển, thiệt hại bao gồm ngoại hình khó coi và giảm khả năng bán trên thị trường do bị thủng hoặc mô bị vỡ do thối rữa (Steiner, 1957)

Hình 1.2 Hình ảnh gây hại của ruồi đục trái Bactrocera dosalis trên cây khổ qua

1.1.3 Đặc điểm hình thái của ruồi đục trái Bactrocera dosalis

❖ Trưởng thành: phần ngực màu nâu đen, phần bụng màu nâu vàng Kích thước: thân dài từ 7,5 - 8mm Sải cánh dài 7,5 mm, Trên lưng có nhiều vết chấm và vết dài màu vàng Ngực trước có 2 vệt vàng to ở ngay góc vai Ngực giữa có 2 vệt vàng dài hình dấu ngoặc đơn, Hai bên hông của đốt ngực giữa cũng có vệt vàng to nằm ngay phần gốc cánh Đốt ngực sau có vệt vàng rất to, hình tứ giác cân, phần giáp bụng nhỏ, phần giáp ngực giữa to Bụng to tròn giống bụng ong, cuối bụng nhọn Bụng con đực ngắn, bụng con cái dài nhất là phần cuối bụng vì con cái có bộ phận máng đẻ trứng Trên đỉnh đầu của con đực có 5 điểm đen 4 chấm đen nhỏ là mắt đơn và 1 vệt đen to ở giữa Phần lưng bụng có 3 dãy màu đen chạy song song, ngang bụng 2 vệt phía trên và phía dưới mờ, không liên tục Vệt đen ở giữa to, đậm, chạy ra 2 bên hông Một vệt đen nhỏ nối vào vệt đen to, chạy giữa lưng, xuống đến tận hậu môn, tạo thành hình chữ T Đốt bàn chân nâu vàng Chân trước và chân giữa có đốt ống màu nâu vàng phía gần đốt bàn và có màu nâu

đậm phần giáp với khớp gối Chân sau có đốt đùi màu vàng bóng, đốt ống màu nâu đen Trên đầu có đôi mắt kép rất to màu nâu bóng ( www.vacvina.org.vn)

Hình 1.3 Hình ảnh ruồi đục trái Bactrocera dosalis trưởng thành

❖ Trứng: Trứng màu vàng nhạt, thon 2 đầu dài hình quả dưa chuột, chiều dài từ 1,1 – 1,2mm

❖ Ấu trùng (Dòi): màu trắng ngà, phía đầu nhọn có giác hút dịch màu đen, phía hậu môn to tròn Khi mới nở ấu tùng có chiều dài thân 1,5mm khi đẫy sức có thể dài đến 10mm Ấu trùng đục và ăn phần mềm của quả, phân thải ra làm ô nhiễm quả gây thối và rụng Khi ấu trùng đẫy sức chui ra ngoài vỏ quả, co mình bật rơi xuống đất hóa nhộng

❖ Nhộng: dạng nhộng bọc nằm trong kén hình quả dưa hấu, bằng hạt gạo Khi mới hóa nhộng, nhộng có màu trắng sữa, sau một thời gian có màu vàng cam, khi sắp vũ hóa chuyển sang màu nâu nhạt Kích thước của nhộng từ 5-5,5mm

1.1.4 Vòng đời của ruồi đục trái Bactrocera dosalis

Vòng đời: 35- 45 ngày

Trứng phát triển: 1 - 2 ngày Ấu trùng tuổi 1 phát triển: 2 - 3 ngày Ấu trùng tuổi 2 phát triển: 3 – 5 ngày

Ấu trùng tuổi 3 phát triển: 5 – 7 ngày Nhộng phát triển: 10 – 14 ngày Trưởng thành có thể sống được từ 30 - 40 ngày

Hình 1.4 Vòng đời ruồi đục trái Bactrocera dosalis ( nguồn Internet)

Tùy thuộc vào điều kiện ôn hòa, ẩm độ thay đổi mà vòng đời của ruồi đục trái kéo dài hoặc rút ngắn lại, thường từ 35 - 45 ngày Mỗi năm có thể phát sinh 4 - 6 lứa Tỷ lệ sống từ trứng đến trưởng thành của loài này đạt khá cao , đạt từ 75 đến 85% (Lạng Sơn 8.2017 Dr Thành )

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG 1.2.1 Khái niệm

Nấm ký sinh côn trùng - Entomology phathogenic fungi (EPF) hay nấm côn trùng Insect fungi là khái niệm được các nhà khoa học sử dụng như là một thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật ký sinh gây bệnh cho côn trùng

Theo Evans (1988), nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm:

(1) Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côn trùng ký chủ

(2) Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể của côn trùng và gây nên bệnh hại cho ký chủ

(3) Nấm mọc trên côn trùng tức là những nấm đã được trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng (Samson và cộng sự, 1988)

(4) Cộng sinh có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống

Nấm còn được chia ra thành nhóm ký sinh sơ cấp (Primery pathogen) và nhóm ký sinh thứ cấp (Secondery pathogen) (Pu và Li, 1996) Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng yếu hoặc bị thương Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyên tính, loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng (Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008)

Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượng nấm ký sinh trên hoặc trong ký chủ côn trùng Khái niệm này cũng được dùng cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là 2 nhóm (lớp) trong một ngành động vật chân khớp, chúng có cùng kiểu sinh thái ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trên cây(Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008)

1.2.2 Chu trình lây nhiễm của nấm kí sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏ cuticun của chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơ thể vật chủ Bào tử nấm bám vào

bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cuticun Khi nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọc khắp cơ thể của côn trùng và sản xuất các độc tố để tăng tốc độ giết côn trùng hoặc ngăn chặn sự cạnh tranh của các loài vi sinh vật khác

Hình 1.5 Chu trình xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng

❖ Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

⮚ Giai đoạn xâm nhập:

Giai đoạn xâm nhập được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase, aminopept, carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme này được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay cả trong một loài Enzyme protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là

protein) Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai trò không kém phần quan trọng Nhưng quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein (protease) và enzyme phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Tạ Kim Chỉnh, 1994)

⮚ Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng:

Giai đoạn này được tính từ khi nấm hoàn thành quá trình xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (Phạm Văn Lầm, 2000)

⮚ Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết:

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bên trong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng, các

nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và Fusarium spp định cư ở lớp

biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng Do nấm côn trùng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng các enzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, ở giai đoạn nấm đâm

xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật chủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và các bào tử, vì vậy mà rất khó hoặc không thể xác định các vật chủ

Đặc điểm cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị thối, nhũn mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trong cơ thể sâu chết chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết do nấm côn trùng với sâu chết do virus, vi khuẩn gây bệnh (Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008)

Thomas M B., Read A F., (2007) đã đưa ra sơ đồ xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng vào cơ thể vật chủ

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng

Theo Thomas M B., Read A F., (2007) chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn

trùng, như nấm Beaueria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai đoạn: Bào

tử đính tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ Bào tử nảy mầm và sinh sản hình thành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tác động của enzyme phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trong xoang máu cơ thể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ chết Tầng cuticun của vỏ cơ thể vật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của nấm và nó có vai trò quyết định tính chuyên hóa đặc hiệu của nấm Nếu nấm phá vỡ được tầng cuticun thì sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụ thuộc vào khả năng chiến thắng được phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở côn trùng của nấm

Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng cả hai phương thức là tế bào và thể dịch Sự hình thành hoạt động miễn dịch càng sớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâm nhập Các loài nấm nói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phản ứng tự vệ của vật chủ: Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là sự ngụy trang hữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất ra các chất miễn dịch phân hóa thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thống bảo vệ

Nấm ký sinh thường để lại những dấu hiệu trên cơ thể vật chủ hay làm cho tập tính sống của chúng bị thay đổi Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiện trên bề mặt, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc mầm xâm nhiễm

vào bên trong cơ thể vật chủ Nơi xâm nhập của nấm Beauveria bassiana thường có vệt

chấm đen hình dạng bất định Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 đến 3 ngày trước thời điểm phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ Nếu bị

bệnh do nấm Beauveria thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày trước khi chết

Những cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùng thường có màu hồng nhạt Một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh lá cây hoặc nâu Cơ

thể sâu bị bệnh trở nên hóa cứng Một số loài Cordyceps ký sinh có thể ảnh hưởng đến hành vi của vật chủ sâu bọ Cordyceps unilateralis gây bệnh trên kiến và khiến chúng leo

lên cây rồi bám ở đó trước khi chết, đảm bảo phân phối tối đa bào tử từ quả thể mọc ra ngoài cơ thể côn trùng đã chết (Phạm Văn Lầm, 2000)

1.2.3 Tình hình nghiên cứu nấm kí sinh côn trùng trên thế giới

Cho đến nay, trên thế giới đã phát hiện có khoảng 1,5 triệu loại nấm, với khoảng 2000 loài nấm kí sinh côn trùng Trong đó, đa dạng nhất là chi Cordyceps với 500 loài, tiếp theo chi Verticilium với 261 loài, chi Entomophthora với 152 loài, chi Hypocrella 112 loài, chi Torrubiella 83 loài, chi Aschersonia 79 loài, chi Isaria 42 loài,…( Aung et al., 2008; Luangsa- ard et al., 2006, Sung et al., 2007a)

Trước đây chi Isaria và chi Peacilomyces javanicus Vấn đề này đã gây ra nhiều

tranh luận cho các nhà khoa học và đến nay đã tách biệt thành 2 chi, 3 họ riêng biệt,

trong đó chi Isaria thuộc họ Cordyceps, chi và Ophiocordycipitaceae, bộ Hypocreales

Kết quả phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự RNAs riboxom, β-tubulin cho thấy chi

Isaria cùng chi với chi Cordyceps Cac loài thuộc chi Isaria có sinh sản dạng vô tính

(Anamorph), còn sinh sản hữu tính ( Telemorph) không có hoặc chưa được biết (

Luangsa- ard et al., 2009; Sung et al., 2007a; Petch, 2009)

Đi tiên phong trong phòng trừ sinh học của nấm kí sinh côn trùng chủ yếu có 2 loài

B bassiana và M anisoplie Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy các loài nấm

chi Isaria cũng có nhiều triển vọng để phòng trừ sâu hại nông nghiệp Hiện nay, một số loài nấm chi Isaria được sử dụng trong phòng trừ sinh học cây trồng như I javanica, I

fariosa, I fumosorosea Các loài nấm này được nghiên cứu và ứng dụng vào phòng trừ

một số đối tượng sâu hại thuộc bộ Lepidoptera, Hemiptera, Diptera, Cleoptera,

Hymenoptera,…ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Brazil, Thái Lan

và cho kết quả tốt

Các nghiên cứu của Nigel và Hywel- Jones (2005) cho thấy chi Isaria có triển vọng trong phòng trừ sâu hại cây trồng điển hình như loài I fumosorosea, I javanica, I

tenuipes Năm 2008 ở Argentina đã sử dụng nấm Isaria phòng trừ sâu hại cây trồng ở

khác các loài nấm thuộc chi Isaria thường dễ phân lập, phát triển nhanh, có số lượng bảo

tử nhiều nên có lợi thế nhân nuôi và ứng dụng phòng trừ

Nghiên cứu của Hong Z et al., 2013, nấm I javanica có khả năng gây hại cho loài

bọ phấn hại khoai lang trong phạm vi nhiệt độ khá rộng 15℃ - 35℃ Tỉ lệ chết của bọ phấn đạt thấp ở độ ẩm tương đối thấp và không đổi, nhưng khi giữ độ ẩm cao trong 24 giờ đầu rồi chuyển sang độ ẩm thấp các mẫu phân lập có thể xâm nhiếm gây bệnh ở tất

cả các giai đoạn phát triển từ trứng đến nhộng Những kết quả này cho thấy loài I

javanica có tác dụng phòng trừ tốt loại bọ phấn ở các điều kiện khác nhau, có triển vọng

để phát triển thành một loại thuốc vi sinh vật để kiểm soát bọ phấn trắng

Hiệu lực của nấm I.javanica đối với loài mối Coptotermes gestroi đạt hiệu lực khá

ẩm 80% ± 10% Kết quả cho thấy, nấm I javanica có hiệu quả trong phòng trừ loài mối này ( Lopes et al., 2011)

Isaria fumosorosea, được gọi là P fumosoroseus trong hơn 30 năm trước sửa đổi

phân loại, phân bố trên toàn thế giới và được phân lập từ nhiều côn trùng, đặc biệt là

Lepidoptera, cũng như không khí, nước, thực vật, các loại nấm khác và thường từ đất Isaria fumosorosea được coi là một phức hợp loài với ít nhất ba nhóm đơn thể (

Zimmermann, 2008) Tổ hợp loài I fumosorosea đã thu hút được sự chú ý trong những năm gần đây do hiệu quả của chúng kiểm soát sinh học các loài bướm trắng Bemisia và

một số chủng thương mại được bán, đặc biệt ở Châu Âu dùng để kiểm soát sinh học ruồi trắng và các loài sâu bệnh trong nhà kính ( Fana, Wraight, 2007)

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm

phỏng khí hậu ôn đới Sự nảy mầm giảm khi nhiệt độ tăng cao và khả năng tồn tại của

bào tử khá cao ở nhiệt độ 45℃ và 50℃, 33% RH trong 160 giờ ( Bouamama et al., 2010)

Kết quả nghiên cứu của Gabiel và đồng tác giả (2010) đã lựa chọn được môi trường

nhân sinh khối nấm I.fumosorosea trên môi trường gạo vỡ 3mm dài × 2mm dày ( ngâm

nước 40 phút) và gạo nguyên ( ninh 8- 10 phút với nước) đều cho kết quả tốt về khả năng phát sinh bào tử

Kết quả nghiên cứu của Jason et al (2008), đã chỉ ra rằng nấm Isaria fumosorosea Wize (Ifr) (Paecilomyces fumosoroseus) (Hypocreales: Cordycipitaceae) là tác nhân kiểm soát quan trọng đối với rầy chổng cánh Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) vecto

truyền bệnh Greening trên cây có múi tại Florida, Mỹ Cho trưởng thành rầy chổng cánh

100% số rầy thí nghiệm chết và không có cá thể chết ở công thức đối chứng Triệu chứng gây bệnh, gây co giật chân râu, sau 2-3 ngày xuất hiện sợi nấm mọc ở chân, ổ chậu, sau một tuần toàn bộ bên trong cơ thể sợi nấm bao phủ, sau đó xuất hiện bào tử khô, dạng bột màu xám xuất hiện

Theo David et al., 2012 đã nghiên cứu đánh giá khả năng tương thích của nấm

Isaria fumosorosea và ong kí sinh Lysiphlebus testaceipes đối với rầy nâu hại cam quýt

tại Florida, Mỹ Thí nghiệm cho thấy sử dụng đơn lẻ nấm Isaria fumosorosea trong

vòng hai tuần đầu tỷ lệ chết của rầy không sai khác so với đối chứng Tuy nhiên, sau đó rệp có hiện tượng nhiễm bệnh Hai tác nhân này có khả năng tương thích với nhau vì vậy có thể kết hợp trong kiểm soát rệp nâu hại cam quýt

Năm 2009, Universidade Estadual Paulista (Unesp) đã tiến hành thử nghiệm

phun chế phẩm tạo ra từ nấm Isaria sp3 lên đối tượng ruồi trưởng thành và nhộng

và 56,6% đối với ruồi trưởng thành

Kết quả nghiên cứu của Pasco et al (2013) xác định khả năng tương thích của nấm

Isaria fumosorosea với các hóa chất nông nghiệp được sử dụng để kiếm soát rầy chổng

cánh Diaphorina citri Sự tăng trưởng của I fumosorosea trong phòng giảm ít nhất với

các loại hóa chất có nguồn gốc từ dầu mỏ và lớn nhất với cấc hóa chất từ dầu thực vật

và borax Do đó không nên trộn I fumosorosea với các sản phẩm trên

Rahim et al (2013) đã ghi nhận kết quả bước đầu về sử dụng nấm Isaria fumosorosea kiểm soát bọ phấn (Bemisia tabaci Genn.) tại Malaysia.Trong điều kiện phòng thí

lệ chết đạt 91, 90, 86 và 89% đối với trứng, thiếu trùng tuổi 2, tuổi 3 và tuổi 4

Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã và đang nghiên cứu, ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sinh học sâu hại Bên cạnh các loài nấm truyền thống thuộc

chi Beauvera và Metarhizium, thì chi nấm Isaria cũng đã bắt đầu được nghiên cứu và

hứa hẹn có thể tạo ra chế phẩm hiệu quả Kết quả bước đầu cho thấy các loài nấm chi

Isaria có triển vọng trong phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng

1.2.4 Tình hình nghiên cứu nấm kí sinh côn trùng ở Việt Nam

Ở Việt Nam có một số điều tra khảo sát về thành phần các loài nấm kí sinh côn

trùng chi Isaria ở hệ sinh thái rừng và hệ sinh thái nông nghiệp

Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An được đánh giá có tính đa dạng sinh học cao, chứa đựng nguồn lợi lớn về nấm kí sinh côn trùng Theo kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và đồng tác giả (2018a,b) đã thu thập và xác định được 71 loài nấm thuộc 17 chi kí

sinh trên vật chủ thuộc 3 bộ côn trùng khác nhau, trong đó có chi Isaria có 4 loài là I

farinosa, I javanica, I.tennuiqes, Isaria sp… Trần Ngọc Lân và đông tác giả (2011a)

đã xác định được 101 loài nấm thuộc 21 chi kí sinh trên 11 bộ côn trùng, 1 bộ nhện Chi

Isaria có 10 loài, 143 mẫu, trong đó I tenuipes phổ biến nhất, tiếp theo là I javanica

Theo Nguyễn Thị Thúy và dồng tác giả (2012) đã phát hiện dạng sinh sản hữu tính

của loài I tenuipes là Cordyceps takaomontana tại VQG Pù Mát Nấm Cordyceps

takaomontana kí sinh trên côn trùng bộ cánh vảy, quả thể từ 2- 4 cái; màu nâu nhạt đến

da cam nhạt; hình trụ hoặc hình chùy; dài 3,90 đến 11,20 mm Nuôi cấy trên môi trường

PDA ở 25℃ nấm phát triển tương đối nhanh, đường kính tản nấm sau 12 ngày đạt 38,18

± 4,47 mm Đây là một trong ít loài nấm thuộc cho Isaria xác định thuộc dạng hữu tính và thuộc chi Cordyceps

Theo Trần Ngọc Lân và tác giả (2011a, b) loài nấm I tennuipes thu thập tại

VQG Pù Mát, Nghệ An chủ kí sinh trên sâu nhộng, sâu cánh vải, quả thể có 4 dạng hình thái ( hoa cúc trắng, lục bình trắng, bông tuyết, dạng vô tính kết hợp hữu tính), sinh trưởng nhanh trên PDA, bào tử dạng bột và có triển vọng phòng trừ sâu hại cây trồng

Ở hệ sinh thái nông nghiệp, Phan Thị Vượng và đồng tác giả (2014) đã thu thập, phân lập và xác định được tên khoa học của 6 loài nấm kí sinh rầy nâu hại lúa

tại Thái Bình, loài I javanicus chiếm ưu thế với 20.83% so với các loài nấm kí sinh côn trùng khác Trần Thị Tho và đồng tác giả (2014) đã thu thập được 7 chủng P

javanicus kí sinh trên rệp sáp giả gây hại vườn cây ăn quả tại Cần Thơ, Vĩnh Long

và Sóc Trăng

Trên sâu khoang nấm xâm nhiễm, gây bệnh và phát triển nhanh quá 5 giai đoạn, với vòng đời 7,82 ± 0,23 ngày và chu kì 12,7 9± 0,36 ngày Mỗi giai đoạn có những triệu chứng khác nhau và điểm đặc trưng là bảo tử hình thành sớm sau 5-6 ngày sâu chết, mật

Thùy, 2016)

Phan Thị Thu Hà và đồng tác giả (2014) đã nghiên cứu sản xuất và ứng dụng nấm

tím P javanica phòng chống rầy nâu hại lúa Kết quả cho thấy, sử dụng công nghệ sản

Chế phẩm có hiệu lực trừ rầy đạt 82,26%- 86,09% sau 11-14 ngày trong điều kiện nhà lưới; đạt 57,24% hiệu lực sau phun 10 và 14 ngày tương đương với thuốc hóa học Actara 25WG khi sử dụng trên đồng ruộng tại Thái Bình trong vụ mùa 2012

Nấm I.javanica có hiệu lực cao đối với 2 loại rệp Brevicoryme brasiceae (Linn.)

bt/ml sau 10 ngày lây nhiễm ở cả trong phòng thí nghiệm và ở nhà lưới (theo Nguyễn Thị Thanh và đồng tác giả (2011b)

Nhìn chung các nghiên cứu về đa dạng sinh học hay nguồn lợi tự nhiên của chi nấm

Isaria còn ít Một số kết quả bước đầu cho thấy, các loại nấm Isaria phân bố khá rộng

ở nhiều nước trên thế giới nhưng không phổ biến Chi nấm này chủ yếu thu thập được ở hệ sinh thái rừng nhiệt đới với phổ vật chủ ký sinh khá đa dạng thuộc bộ Cánh màng, bộ Cánh vảy, bộ Cánh nửa, bộ Nhện lớn, ở pha sâu non nhộng và trưởng thành Ngoài

ra một số loài I fumosorosea và I javanica cũng mới phát hiện có phân bố ở cả rừng

trồng và hệ sinh thái nông nghiệp nhưng không phổ biến, sinh trưởng nhanh trên môi trường PDA ( Nguyễn Thị Thúy, 2016)

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2021- 7/2021 tại phòng thí nghiệm Động vật học và phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp HCM, cơ sở 3 Bình Dương số 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Nguồn ruồi đục trái Bactrocera dosalis

Thu thập nguồn ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ những trái khế có dấu hiệu hư

hỏng, có chấm đen, ứa mủ ở chợ Thủ Dầu Một đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình

Dương Việc xác định loài ruồi đục trái Bactrocera dosalis được vào tài liệu Cục Bảo vệ

thực vật- Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn

2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm

Nguồn nấm kí sinh côn trùng được phân lập từ mẫu côn trùng bị nhiễm nấm kí sinh ngoài tự nhiên gồm mẫu ve sầu bị nấm kí sinh thu tại vườn cà phê, xã Sơ Pai, K’bang, tỉnh Gia Lai

Mẫu nấm kí sinh sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 sau khi phân lập và làm

thuần sẽ tiến hành giữ giống tại phòng thí nghiệm Động vật học Sau đó các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Động vật học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở, cơ sở 3 Bình Dương

Hình 2.1 Hình ảnh giống chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 trong phòng thí

nghiệm Động vật học

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG 2.3.1 Thiết bị

- Mẫu nấm kí sinh côn trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 đã được phân lập và giữ

giống tại phòng thí nghiệm Động vật học

- Đối tượng thử nghiệm: nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis

- Các thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy lắc, máy xay, cân phân tích, kính hiển vi, kính sôi nổi, buồng đếm hồng cầu

2.3.2 Dụng cụ

- Ống nghiệm - Đĩa petri - Lame

- Pipet (thủy tinh và pipetman) - Becher

- Ống đong - Máy xay

- Phễu

- Đũa thủy tinh - Que cấy - Đèn cồn - Bình Scott - Bình serum - Lưới

- Ống nước (Ø 24) - Lưới

- Thùng xốp - Dao

- Kéo - Băng keo - Bông gòn

- Bao bọc thực phẩm

2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm

- Môi trường: Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

- Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm Lactophenol Control blue (LPCB)

- Nguyên liệu: cám gạo, bột đậu nành, trấu, bột ngô, lúa, khoai tây

2.4 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.4.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu đề tài đưa ra, tôi tiến hành bố trí thí nghiệm theo sơ đồ:

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình các bước thực hiện thí nghiệm

Chủng nấm Isaria

fumosorosea Bb-V3 đã được

phân lập và giữ giống

Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera doalis từ chế phẩm của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Quan sát đặc điểm hình thái sinh học của chủng nấm Isaria

fumosorosea Bb-V3

Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis của dịch bào tử chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở mật độ bào tử khác

nhau trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Khảo sát hiệu lực tiêu diệt nhộng ruồi đục trái Bactrocera dosalis từ chế phẩm của chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở ngoài vườn.

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành bào

tử chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3.

Tạo môi trường thích hợp để sản xuất chế phẩm từ chủng nấm kí sinh côn

trùng Isaria fumosorosea Bb-V3.

2.4.2 Nhân nuôi nguồn ruồi đục trái Bactrocera dosalis

Ruồi đục trái Bactrocera dosalis được thu thập từ những trái khế có dấu hiệu bị

đục lỗ trên trái, vết thâm đen, bị úng, ứa mũ, đem về phòng thí nghiệm Động vật học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở TP HCM, cơ sở 3 Bình Dương sẽ được tiến hành nhân nuôi bằng cách để trái cây vào hộp nhựa có đục lỗ bên trên Ruồi đục trái sẽ trải qua các vòng đời và bắt đầu sinh sản, trong quá trình thành ấu trùng cho chúng ăn sáp mật ong và cần theo dõi vệ sinh hộp đựng sẽ tránh để nhiễm nấm mốc làm chết chúng Tiến hành quan sát sự phát triển của ruồi đục trái qua các tuổi, chụp hình chúng ở các giai đoạn

Hình 2.2 Hình ảnh nhân nuôi lấy nhộng ruồi đục trái từ khế

2.4.3 Quan sát đặc điểm hình thái sinh học của chủng nấm Isaria

mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm,…), màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới,…

Ghi nhận các đặc điểm của nấm kí sinh côn trùng như sau: - Mặt dưới đĩa petri

- Mặt trên đĩa petri

2.4.4.2 Quan sát trên kính hiển vi

Cách thực hiện: lấy một lame kính sạch, trong, đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2cm và có độ dày của cạnh khung là 0.3cm Đặt khung giấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch môi trường PDA bán lỏng ( khoảng 10µ) lên lam kính vào giữa khung giấy Tiếp đến cấy nấm vào giữa môi trường đã được bơm vào ( cấy đơn bào tử hay cấy đầu sợi nấm) Đậy lamen lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ấm ( ở đây sử dụng địa petri bên trong có chứa bông gòn ẩm bên trên có đặt thanh chữ U bằng sắt) Để trong hai ngày, sau đó lấy lam kính ra, bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát Quan sát đặc điểm vi thể: dạng bào tử, tơ nấm, cuống bào tử ở vật kính ×100 có dầu soi Chụp ảnh khóm nấm trên đĩa petri và vi thể nấm trên kính

Lưu ý:

- Cần chú ý thao tác vô trùng tránh nhiễm các vi sinh vật khác làm sai lệch kết quả - Buồng ẩm và nước cất bơm vào tạo môi trường ẩm đã được hấp khử trùng ở 121℃/1atm trong 20 phút

2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành bào tử

chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3

2.4.4.1 : Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng

Isaria fumosorosea Bb-V3

Mục đích: Để đánh giá ảnh hưởng của pH lên sự sinh bào tử của nấm kí sinh côn

trùng Isaria fumosorosea Bb-V3 tốt nhất trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)