nhân giống in vitro thông ba lá pinus kesiya royle ex gordon

Nó cung cấp một lượng lớn gỗ phục vụ cho các ngành xây dựng và công nghiệp giấy, phần nhựa thông là nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến cao su, vật liệu cách điện, keo d

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – MÔI TRƯỜNG

CBHD: TS HỒ BẢO THÙY QUYÊN

SVTH: MAI NGUYỄN NGUYỆT HẠNH MSSV: 1553010047

Khóa: 2015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – MÔI TRƯỜNG

SVTH: MAI NGUYỄN NGUYỆT HẠNH MSSV: 1553010047

Khóa: 2015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và các Thầy Cô phụ trách các phòng thí nghiệm sinh hóa, tế bào, công nghệ vi sinh đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài

Cuối cùng với lòng biết ơn sâu sắc, con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình đã nuôi dạy, tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ con trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em xin trân trọng cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019

Sinh viên thực hiện đề tài

Mai Nguyễn Nguyệt Hạnh

Phần I: Tổng quan tài liệu 11

1 Tổng quan về thông ba lá (Pinus kesiya) 11

1.6.3 Ứng dụng của nuôi cấy mô 16

1.6.4 Các yếu tố và điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 16

1.6.4.1 Sự lựa chọn mẫu cấy 16

1.6.4.2 Khử trùng mẫu cấy 17

1.6.4.3 Môi trường nuôi cấy 17

1.7.1 Nghiên cứu trong nước 22

1.7.2 Nghiên cứu ngoài nước 24

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 26

1 Vật liệu 26

2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.1 Vô trùng mẫu nuôi cấy 26

2.2 Nuôi cấy hạt thông ba lá in vitro 26

2.3 Nhân chồi thông ba lá in vitro 27

2.4 Tăng trưởng chồi thông ba lá in vitro 27

2 Kết quả nuôi cấy hạt thông ba lá in vitro 31

3 Kết quả nhân chồi thông ba lá in vitro 33

4 Kết quả tăng trưởng chồi thông ba lá in vitro 37

5 Kết quả tạo rễ - hình thành cây in vitro 40

Phần IV: Kết luận và kiến nghị 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 45

Tài liệu tham khảo 46

PHỤ LỤC 49

Bảng 3.4: Sự tăng trưởng của chồi thông ba lá trong các môi trường dinh dưỡng

Bảng 3.5: Tỷ lệ cảm ứng ra rễ của chồi thông ba lá sau khi được tiền xử lý với IBA, NAA ở các nồng độ và các khoảng thời gian khác nhau (Varjinia Kalita 1998)

8

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Hạt thông ba lá vô trùng khi mới cấy vào môi trường

Hình 3.2: Hạt thông ba lá nảy mầm trên môi trường WA + 0,5% glucose Hình 3.3: Hạt thông ba lá nảy mầm trên môi trường MS½

Hình 3.4: Chồi thông ba lá Pinus kesiya ban đầu (trái) và sau 4 tuần (phải) trong môi trường M0

Hình 3.5: Chồi thông ba lá Pinus kesiya ban đầu (trái) và sau 4 tuần (phải) trong môi

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

2,4D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid ABA: Abscisis acid

B: Bo

B1: Thiamine B2: Riboflavin B3: Niacin B4: Choline

B5: Pantothenic acid B5: Môi trường Gramborg B6: Pyridoxine

BAP: Benzylaminopurine Ca: Canxi

Cl: Clo Co: Coban Cu: Đồng

DCR: Môi trường Gupta & Durzan Fe: Sắt

MS: Môi trường Murashige & Skoog N: Nito

NAA: α-Naphthaleneacetic acid P: Photpho

PEG: Polyethylene glycol PP: Niconitic acid

S: Lưu huỳnh

SH: Môi trường Schenk & Hildebrandt WA: Water Agar

10

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thông là loài cây lá kim trong chi Pinus thuộc họ Pinaceae và là cây chủ của

nhiều loài nấm cộng sinh Chúng được tìm thấy phần lớn ở Bắc bán cầu với phần lớn các loài trong khu vực ôn đới nhưng cũng được thấy ở khu vực nhiệt đới và hàn đới, giữ vai trò quan trọng về mặt sinh thái, kinh tế, thương mại … Ngoài ra còn được trồng để lấy gỗ, làm cây cảnh trong vườn hay trong các khu công viên, dọc các tuyến đường quốc lộ … Không những thế còn là nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp sơn, công nghiệp chất béo … một số loài còn được dùng như là vị thuôc dân tộc Các chất phân lập từ các loài thuộc chi Pinus thể hiện hoạt tính sinh học mạnh mẽ nhất như chống oxy hóa, kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng HIV … (Nguyễn Hoàng Sa 2017)

Thông ba lá (Pinus kesiya) là loài có sự phân bố khá rộng rãi ở Việt Nam, Ấn Độ, Philipines, Myanmar, Thái Lan Thông ba lá Pinus kesiya là loài cây lâm nghiệp được

trồng phổ biến ở Lâm Đồng với nhiều giá trị kinh tế cao Nó cung cấp một lượng lớn gỗ phục vụ cho các ngành xây dựng và công nghiệp giấy, phần nhựa thông là nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến cao su, vật liệu cách điện, keo dán … và tinh dầu thông được ứng dụng trong các ngành công nghệ dược để làm thuốc … Ngoài ra, rừng thông ba lá còn là nguồn cung cấp các loại nấm rễ cộng sinh với nhiều lợi ích khác nhau như làm thuốc chữa bệnh, hoặc sử dụng làm thức ăn thường ngày … (Trần Văn Mão 2004)

Bên cạnh đó việc trồng một cây mới từ hạt đến lúc trưởng thành theo phương

pháp truyền thống lại mất khá nhiều thời gian Phương pháp nhân giống vô tính in vitro

là phương pháp tiềm năng nhất cho quá trình sản xuất cây con với hệ số nhân giống cao

Vì những lý do đó, chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu đề tài “Nhân giống in

vitro thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon)” nhằm xây dựng quy trình gieo hạt và

nhân giống in vitro của thông ba lá (P kesiya)

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ THÔNG BA LÁ (PINUS KESIYA)

Chi Pinus Loài P kesiya

1.2 Phân bố

Ở Việt Nam, thông ba lá có vùng phân bố rộng, sinh trưởng ở các khu vực có độ cao từ 300 m đến 2700 m, song thích hợp nhất là ở các độ cao từ 1000 – 1500 m Thông ba lá có ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang (Yên Minh, Hòng Xu Phì, Xí Mần), Kon Tum, Gia Lai, Dak Lak, Dak Nông, Lâm Đồng … (Farjon 2013)

Trên thế giới, thông ba lá phân bố ở niềm Nam Trung Quốc, Lào, Bắc Thái Lan, Philippine, Myanmar và miền Đông Ấn Độ (Farjon 2013)

1.3 Đặc điểm thực vật học

1.3.1 Đặc điểm hình thái

Thông ba lá là cây gỗ lớn, thân thẳng đứng, cao 20 – 30 m, đường kính thân có thể tới 50 – 70 cm, vỏ dày, nứt thành những mảng sâu, màu nâu đen Cành nhỏ thường có màu vàng nhạt, màu phấn trắng Lá hình kim, họp thành từng túm ba lá (ít khi có hai hoặc bốn lá), mảnh, mềm, màu xanh sáng, mỗi lá thường dài 20 – 25 cm Đầu cành ngắn

12 đính lá thường có độ dài 1,5 cm, đính các vòng xoắn ốc trên cành lớn (Nguyen và cộng sự 2004)

1.3.2 Đặc điểm sinh thái

Thông ba lá thích hợp với các khu vực có nhiệt độ trung bình năm khoảng 15 – 20°C, tổng lượng mưa khoảng 2000 – 2500 mm và mùa khô ngắn Chúng ưa đất nhiều mùn, tương đối ẩm, chua (pH 4,8 – 5,5), phong hoá trên đá mẹ hoa cương, phiến thạch, phiến thạch mica, sa thạch … thoát nước tốt, quang đãng và được chiếu sáng đầy đủ, tuy nhiên lại không thích ứng với đất kiềm (Farjon 2013)

Thông ba lá bắt đầu ra nón vào tháng 2 – 3, chín từ tháng 12 đến tháng 1 năm sau Hạt giống thu hái từ các cây trội hoặc các lâm phần giống từ tháng 11 đến tháng 1 năm sau khi quả chuyển từ xanh sẫm sang vàng mơ hay cánh gián (Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam 2009)

1.4 Thành phần hóa học

Nhựa thông ba lá là một hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hữu cơ, trong đó chủ yếu là tùng hương (còn được gọi là colophan, resin) với hàm lượng thay đổi từ 65 – 75% và tinh dầu (turpentine oil) với hàm lượng thay đổi trong khoảng 18 – 20% Tùng hương là hợp chất rắn, trong suốt, ròn, dễ gãy, màu vàng, vàng nâu hay vàng sáng, vị đắng, không tan trong nước, nhưng lại hoà tan trong cồn, ether, chloroform, tinh dầu, chất béo và một phần trong benzen Tùng hương là một hỗn hợp hữu cơ gồm chủ yếu là các acid abietic, acid pimaric và một lượng nhỏ các chất trung tính Chất lượng của tùng hương được đánh giá chủ yếu dựa trên cơ sở các chỉ số acid và xà phòng hoá Chỉ số acid và chỉ số xà phòng hoá càng cao thì sản phẩm được coi là có chất lượng càng tốt Tùng hương đạt chất lượng cao khi chỉ số acid đạt 160 – 170 và sản phẩm có màu vàng nâu nhạt, bóng Tinh dầu thông ba lá từ Tây Nguyên là hỗn hợp không màu, trong suốt, nhẹ hơn nước, có mùi thơm hắc, với thành phần hoá học chính gồm α-pinen (chiếm khoảng trên dưới 60%) và β-pinen; các thành phần khác như ∆-3-caren, limonen, myrcen, longifolen … thường có hàm lượng nhỏ (Lã Đình Mỡi 2002)

1.5 Giá trị kinh tế

Thông ba lá là nguồn cung cấp nhựa và gỗ với năng suất khá cao, hầu hết ở khu vực Đông Nam Á và được trồng làm cây lâm nghiệp ở nhiều quốc gia như Châu Phi, Nam Mỹ, Châu Đại Dương … Chúng được sử dụng phổ biến nhất là làm nguyên liệu sản xuất bột giấy trong ngành sản xuất giấy

Nhu cầu về nhựa thông ba lá và các sản phẩm từ nhựa thông (tùng hương và dầu thông) trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng và cung không kịp cầu

Rễ được sử dụng để nghiên cứu và trong y học cổ truyền để chữa lo âu, mất ngủ, an thần …

1.6 Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.6.1 Định nghĩa

Theo Ngô Xuân Bình (2010), nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định, có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh

- Năm 1902, nhà khoa học Hebarlandt cho rằng: có thể tạo cá thể hoàn chỉnh từ việc nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên ông đã không thành công trong việc nuôi

14 cấy tế bào thực vật Những hạn chế về khoa học kĩ thuật, kiến thức khoa học thời bấy giờ đã không đưa ông đến thành công như mong đợi

- Năm 1922, Kotte – nhà khoa học người Mỹ lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ loài cây họ hòa thảo Trong môi trường lỏng có chứa dinh dưỡng khoáng và đường glucose, đầu rễ sinh trưởng rất mạnh tạo thành một hệ rễ bao gồm cả rễ phụ Tuy vậy, sinh trưởng của mẫu tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới

- Năm 1934, giai đoạn thứ hai trong nuôi cấy mô thực vật, White đã nuôi cấy thành công trên cây cà chua với môi trường lỏng chứa dinh dưỡng khoáng, đường và dịch chiết nấm men Sau đó, White đã chứng minh có thể thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamine (B1), pyridoxine (B6) và niconitic acid (PP) Từ đây, việc nuôi cấy đã được tiến hành ở nhiều loài cây khác nhau Đồng thời, Gautheret tiến hành các nghiên cứu và thành công nuôi cấy mô phân sinh (thượng tầng) một số cây thân gỗ Went và Thimann phát hiện chất điều hòa sinh trưởng hormone đầu tiên là IAA Gautheret xác định tác động của chất kích thích của IAA và nhóm 3 vitamin trên mô sẹo do White khởi xướng Cùng với Nobercourt, Gautheret thành công trong việc duy trì sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trên môi trường rắn có chứa thạch agar

- Năm 1941, nhà khoa học Overbeck chứng minh tác dụng của chất kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi từ mẫu cây họ Cà

- Năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt Sau đó kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công Hợp chất NAA và chất 2,4-D được bắt đầu sử dụng ở nồng độ cao để trừ cỏ trong sản xuất nông nghiệp

- Năm 1955, nhà khoa học Hoch Skoog phát hiện vai trò của một hợp chất có tác dụng kích thích sự phân bào, và đặt tên là kinetin Sau này các nhà khoa học nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vai trò của kinetin và xếp vào nhóm cytokinin

- Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ cytokinin/auxin đối với sự hình thành mô sẹo cây thuốc lá Khi giảm thấp tỉ lệ cytokinin/auxin, mô sẹo có xu hướng tạo rễ, ngược lại nếu tăng tỉ lệ này lên, mô sẽ phát sinh chồi Hiện tượng này cho kết quả giống nhau trên nhiều loại cây trồng Kết quả nghiên cứu góp phần quan trọng vào việc sử dụng chất điều hòa

sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro

- Năm 1958, Kerint và Sterward tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế bào tượng tầng cây cà rốt

- Năm 1960, Morelddax thành công trong nhân giống in vitro loài lan

Cymbidium từ mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy các đỉnh sinh trưởng hình thành dạng cụm chồi gọi là cái protocorm Khi tách các protocorm tiếp tục nuôi cấy trên môi trường phù hợp, mẫu nuôi cấy có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh

- Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh ra môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật MS

- Năm 1966, Guha và cộng sự đã thành công trong nuôi cấy tạo cây đơn bội ở cà độc dược từ bao phấn

- Năm 1967 – 1968, lần lượt Nichko Nakaro và cộng sự tạo được cây đơn bội từ bao phấn cây thuốc lá

- Năm 1971, Takebe tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần

- Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma hai loài khác nhau, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của hai loài thuốc lá Nicotiana glauca và Nicotiana langsdorfii

- Năm 1977, MLchers dung hợp thành công hai loại tế bào soma của cây cà chua và cây khoai tây đanh dấu bước ngoặc trong lịch sử chọn tạo giống cây trồng

- Năm 1980 đến 1992 nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật

16 - Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật đang ở giai đoạn thứ 4, nuôi cấy mô được ứng dụng khá phổ biến trong nhân giống cây trồng, chọn tạo giống, tạo đột biến, tạo sinh khối, sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học … Các ứng dụng về nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng và công nghệ tế bào nói chung đang trở thành công cụ có hiệu quả trong việc tạo ra sản phẩm đặc thù phục vụ con người

1.6.3 Ứng dụng của nuôi cấy mô

Theo Ngô Xuân Bình (2010) nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được ứng dụng vào:

- Nhân nhanh giống các loại cây trồng

- Tạo giống cây sạch bệnh virus bằng nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng - Chọn giống nhờ công nghệ tế bào

- Khắc phục hiện tượng bất hợp trong lai xa - Sản xuất các chất thứ cấp qua nuôi cấy tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật hiện nay đẫ được cũng cố vững chắc ở nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới Nhiều phương pháp đã được phát triển để nhân giống, chọn lọc các đặc điểm mong muốn khác nhau, tạo dòng tế bào, nhân nhanh các kiểu di truyền tạo ra các cây đơn bội từ nuôi cấy noãn và túi phấn, đa dạng hóa các kiểu di truyền bằng cách tạo đột biến và nhân dòng soma, tạo mô sẹo cô lập và nuôi cấy tế bào để nghiên cứu ảnh hưởng của khoáng, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào Nhiều kỹ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu và ứng dụng Trong tương lai, các mô được nuôi cấy sẽ được sử dụng như công cụ cơ bản và người ta đã sử dụng nhiều thuật ngữ chuyên biệt để phân biệt các kiểu nuôi cấy khác nhau: cấy cây, cấy phôi, cấy cơ quan, cấy mô, cấy tế bào, cấy tế bào trần, cấy túi phấn, hạt phấn (Dương Công Kiên 2006)

1.6.4 Các yếu tố và điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 1.6.4.1 Sự lựa chọn mẫu cấy

Theo Dương Công Kiên (2006); Vũ Quang Sáng và cộng sự (2007), khi lựa chọn đưa mẫu vào nuôi cấy cần đảm bảo các yêu cầu sau:

- Tỷ lệ nhiễm thấp - Tỷ lệ sống cao

- Tốc độ tăng trưởng nhanh

Việc lựa chọn nguồn mẫu cấy thích hợp là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả nuôi cấy mô Nói chung, mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây Chồi hoa non hay cụm hoa cũng thường có kết quả tái sinh rất tốt Mẫu cấy thích hợp phải có khả năng biểu hiện tính toàn thể (Dương Công Kiên 2006)

1.6.4.2 Khử trùng mẫu cấy

Cần thiết khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hóa chất khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật (nấm, khuẩn …) bám trên bề mặt mẫu cấy Vi khuẩn và vi nấm là hai nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy Bào tử nấm có trọng lượng nhẹ và hiện diện khắp nơi trong môi trường sống của chúng ta Khi bào tử nấm tiếp xúc với môi trường nuôi cấy thì đây là điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm của bào tử và từ đó phát triển nguồn lây bệnh (Dương Công Kiên 2006)

Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường sinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5 – 10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5 – 7% xử lý trong 15 – 20 phút hoặc H2O2, dung dịch Br … (Vũ Quang Sáng và cộng sự 2007)

1.6.4.3 Môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tang trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần nuôi cấy thay đổi tùy vào loài và bộ phận nuôi cấy Ngoài ra, thành phần môi trường còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa của mẫu và mục đích nuôi cấy như: nuôi cấy mô sẹo phôi hóa hoặc phôi vô tính, tạo rễ, vi nhân giống, tái tạo cây hoàn chỉnh…

18 Một số môi trường cơ bản dùng để nuôi cấy mô tế bào thực vật:

- Môi trường Murashige – Skoog (MS): Là một trong những loại môi trường được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô MS thích hợp cho cả cây 1 lá mầm và cây 2 lá mầm Đến nay có rất nhiều công thức cải tiến tuy nhiên môi trường MS trên cơ sở gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962 (Ngô Xuân Bình 2010) - Môi trường Gramborg (B5): Là một loại môi trường được thử nghiệm đầu tiên cho cây đậu tương, nhưng cũng được dùng nhiều trong nhân giống vô tính đặc biệt là tách và nuôi tế bào trần (Ngô Xuân Bình 2010)

Môi trường nuôi cấy mô thường gồm những thành phần cơ bản sau: - Đường làm nguồn cung cấp cacbon

- Khoáng đa lượng - Khoáng vi lượng - Các vitamin

- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

- Các chất hữu cơ bổ sung như nước dừa, dịch khoai tây, dịch nấm men … - Chất làm thay đổi trạng thái môi trường (rắn, lỏng …): Agar

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với các thành phân hóa học đặc trưng phụ thuộc vào các yếu tố sau:

- Đối tượng nuôi cấy

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương pháp nuôi cấy - Trạng thái môi trường nuôi cấy

1.6.4.3.1 Đường

Trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, đường cung cấp nguồn cacbon để mô tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối khi tế bào có khả năng quang hợp hoặc chưa đảm nhận hoàn toàn chức năng quang hợp Hai dạng đường hay sử dụng nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô Khi khử trùng, đường sucrose sẽ bị phân hủy một phần vì vậy thuận lợi hơn cho cây hấp thụ Tùy theo mục đích nuôi

cấy, nồng độ sucrose biến đổi 1 – 6% thông dụng nhất là 2 – 3% (Ngô Xuân Bình 2010) Trong một số trương hơp, ví dụ nuôi cấy mô cây một lá mầm, đường glucose sẽ tốt hơn sucrose Ngoài ra, mô thực vật còn có khả năng hấp thụ một số loại đường khác như là lactose, maltose, galatose … tuy nhiên ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật

1.6.4.3.2 Các khoáng đa lượng

Nguyên tố khoáng đa lượng gồm 6 nguyên tố: N, P, K, S, Mg và Ca tồn tại ở muối khoáng, sử dụng với nồng độ 30 mg/l môi trường nhằm cung cấp chất khoáng đến cấu tạo tế bào, mô thực vật Tất cả các nguyên tố này rất quan trọng cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật (Ngô Xuân Bình 2010)

1.6.4.3.3 Các khoáng vi lượng

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng rất nhỏ nhưng không thể thiếu đi trong quá trình sinh trưởng của mô và tế bào thực vật được gọi là các nguyên tố vi lượng gồm Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Mn …

Các yếu tố khoáng vi lượng được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 mg/l môi trường, các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Ngô Xuân Bình 2010)

1.6.4.3.4 Các vitamin

Theo Ngô Xuân Bình (2010), các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầu hết các vitamin cơ bản nhưng thường dưới số lượng yêu cầu, do đó phải bổ sung thêm một hay nhiều loại vitamin vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6 Các vitamin đặc biệt quan trọng như Myo-inositol … đóng vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào và thường được sử dụng với hàm lượng lớn từ 50 – 100 mg/l

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến 1000 lần dung dịch được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Dung dịch vitamin dễ hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì thế cần bảo quản trong điều kiện lạnh dưới 0°C hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng

20

1.6.4.3.5 Các chất điều hòa sinh trưởng

Theo Ngô Xuân Bình (2010), trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thành phần quan trọng trong việc quyết định kết quả nuôi cấy mô là chất điều hòa sinh trưởng Chúng là yếu tố quan trọng trong điều khiển sự phát sinh hình thái và tái sinh cây hoàn chỉnh

Các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng là: - Auxin:

 Còn được gọi là hormone sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện

 Có các tác dụng sinh lí sau: Tác dụng đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt, kìm hãm sự rụng lá, hoa quả

 Các loại Auxin được sử dụng trong nuôi cấy mô: IAA, NAA, 2,4-D, IBA - Cytokinin:

 Hiệu quả sinh lí đặc trưng nhất của Cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ Cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp axit nucleic, protein và có mặt trong ARN vận chuyển

 Ảnh hưởng đến sự phân hóa chồi, kìm hãm sự già hóa của cơ quan và của cây nguyên vẹn, có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn

 Các loại Cytokinin thường dùng: Kinetin, Zeatin, BAP … - Giberellin:

 Được phát hiện vào năm 1930

 Kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự vươn cao dài lóng cây họ lúa Kích thích sự nảy mầm của hạt và củ, kích thích sự ra hóa, ức chế phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực, tăng kích thước quả , tạo quả không hạt

 Một số Giberellin: AAB, GA

- Dịch chiết nấm men: White (1934) lần đầu tiên đã nuôi cấy thành công rễ cây cà chua trong môi trường có dịch nấm men Thành phần của dịch chiết nấm men gồm có đường, nucleic axit, amino axit, vitamin, Auxin, khoáng Dịch chiết tốt cho sinh trưởng của rễ nhưng không tốt với mô sẹo

- Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha) chứa chủ yếu một số đường, vitamin và một số chất có hoạt tính điều tiết sinh trưởng

- Dịch chiết một số loại rau, quả tươi (khoai tây, chuối, cà rốt ) với thành phần có đường, nucleic axit, amino axit, vitamin, khoáng

1.6.4.3.7 Ánh sáng

Đối với nuôi cấy mô, ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát

sinh hình thái của tế bào trong nuôi cấy in vitro Mỗi loài thực vật khác nhau có những

đáp ứng khác nhau với từng loại ánh sáng, cường độ và thời gian chiếu sáng khác nhau Cường độ chiếu sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng của chúng

Cường độ chiếu sáng yếu làm ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp (Dương Công Kiên 2006)

1.6.4.3.8 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro Nhiệt

độ phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định từ 22 – 25°C

22 Một số loài cần có nhiệt độ tối ưu để phát sinh hình thái (Dương Công Kiên 2006)

1.6.4.3.9 pH

Độ pH của môi nuôi cây thích hợp đa số các loại cây trồng giao động từ 5,5 – 5,8 Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng Khi pH < 4 hoặc pH > 7 thì sẽ kết tủa một số loại muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ làm chết cây Cần phải điểu chỉnh pH cho phù hợp từ 5,5 – 5,8 bằng NaOH hoặc HCL 1N (Vũ Quang Sáng và cộng sự 2007)

1.6.4.3.10 Sự thoáng khí

Quá trình quang tự dưỡng diễn ra một cách tự nhiên nhờ sự hiện diện của khí CO2

trong không khí như một nguồn cung cấp cacbon Trong nuôi cấy in vitro truyền thống,

nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy giảm trong quá trình quang hợp làm giảm khả năng quang tự dưỡng, thông thoáng khí giúp cây trong nuôi cấy mô hô hấp và quang hợp tốt (Dương Tấn Nhật 2007; Bùi Trang Việt 2000)

1.6.4.3.11 Agar

Agar là một loại polysaccharide của tảo (chủ yếu tảo hồng – Rodophyta) Agar khi ngậm nước ở 80°C sẽ chuyển sang dạng sol và 40°C thì sẽ trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của agar cao (6 – 12 g/l nước) Tuy ở trạng thái gel nhưng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng Vì vậy, thuận lợi cho sự hút dinh dưỡng của cây trong nuôi cấy mô

1.7 Những nghiên cứu trong nước và ngoài nước về quy trình nhân giống các loài thông

1.7.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 2009, quy trình nhân giống in vitro Pinus caribaea do Kiều Phương Nam

và cộng sự được thực hiện Tiến hành tiền xử lý mẫu với axit benzoic, axit citric sẽ gia tăng hiệu quả khử trùng (93,33%) Tạo các búp chồi ngủ là vật liệu phù hợp cho quá trình khởi đầu quy trình nhân giống trên môi trường Schenk & Hildebrandt (SH) bổ sung 30 g/l glucose, 10% nước dừa, 2 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA

Năm 2011, Vương Đình Tuấn và cộng sự ở phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm

nghiệp Nam Bộ thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii) trong điều kiện in vitro” Nghiên cứu tạo phát sinh phôi và phôi soma đã đạt được kết

quả tốt trên môi trường Litvary và cộng sự (LVM) có bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D và 3,0 mg/l BA Trọng lượng tươi của tế bào tiền phôi tăng hơn 3 lần ở tuần đầu trên môi trường có bổ sung 500 mg/l glutamine Đường maltose ở 90 g/l kết hợp 80 mg/l ABA và 10 g/l phytagel tạo phôi soma tốt hơn sucrose ở cùng nồng độ

Năm 2012, Phạm Chí Nhân đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một

số yếu tố hóa học đến tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de vries) trong điều kiện in vitro” Nghiên cứu tăng sinh khối tế bào tiền phôi đạt được kết quả tốt trên

môi trường LVM bổ sung L-glutamin 500 mg/l, BA 1 mg/L Đường maltose ở nồng độ 60 – 90 g/l phối hợp cùng 30 g/l polyethylene glycol (PEG) tốt hơn đường sucrose khi sử dụng trong thành thục tế bào tiền phôi và tạo phôi soma

Năm 2014, công trình “Nghiên cứu một số ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo phát sinh,

nhân nhanh khối tiền phôi và tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii) trong điều kiện

in vitro” được thực hiện bởi Phan Thị Mỵ Lan và Nguyễn Xuân Cường, viện Khoa học

Lâm nghiệp Nam Bộ Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo phát sinh và nhân nhanh khối tiền phôi soma thông nhựa đã được nghiên cứu Tỷ lệ hình thành khối tiền phôi 25,3 – 40% của phôi soma đạt được khi chưa trưởng thành nuôi cấy trên môi trường LVM bổ sung 2,4-D (2,0 mg/l) và BA (1,0 mg/l) Tỷ lệ này đã được cải thiện lên đến 37,6 – 58,3% khi thay thế BA (1,0 mg/l) bằng 24 – epibrassinolide 1,0 mg/l Môi trường tối ưu nhất cho hệ số tăng sinh khối ở tất cả các dòng là LVM kết hợp với 2,4-D (2,0 mg/l + BA (1,0 mg/l) Trọng lượng tươi tăng từ 2,58 đến 3,89 lần ở tuần đầu tiên sau cấy Số phôi soma tạo thành dao động 40 đến 58,33 phôi/1g trọng lượng tươi tùy theo các dòng khi nuôi cấy trên môi

Đối với thông ba lá Pinus kesiya, phương pháp nhân giống phổ biến hiện nay là

gieo hạt hoặc giâm trong bầu giá thể (viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 2009) Các

quy trình nhân giống in vitro vẫn chưa được công bố rộng rãi

24 Năm 2006, “Nhân giống một số loài cây rừng bằng phương pháp giâm hom và triển vọng trồng rừng của chúng” được viết bởi Trần Văn Tiến, viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Phương pháp giâm hom chủ yếu từ cành hoặc chồi được cắt thành đoạn từ 10 – 15 cm, sau đó được nhúng vào thuốc bột rồi cắm vào giá thể cát hay túi bầu Giâm hom là phương pháp dễ dàng thực hiện, ít tốn kém, thời gian ngắn, tỷ lệ ra rễ cao Giâm hom thông ba lá tốt nhất ở giai đoạn 2 – 7 tuổi, bằng chồi đã qua giai đoạn tạo chồi Khi được xử lý bằng IBA 0,5 – 1% tỷ lệ ra rễ từ 80 – 90%

Theo “Kỹ thuật trồng thông ba lá” (viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 2009, 2014) phương pháp gieo và trồng thông ba lá từ hạt cho thấy khả năng tái sinh bằng hạt của cây mạnh, cây thích hợp với đất có pH 4 – 5,0, có thể trồng ở nơi đất nghèo dinh dưỡng trừ những nơi đất kiềm hoặc mặn Hạt giống được thu trên các cây trội từ tháng 11 đến tháng 2 năm sau Hạt phải đạt tiêu chuẩn 04-TCN-41-2001 và tỷ lệ 14 – 17 g/1000 hạt hoặc 60000 – 70000 hạt/kg

1.7.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1977, Kathryn và Jenny đã nghiên cứu quá trình nhân giống Pinus radiata

bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Cây con được hình thành từ mô chưa phát triển Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường SH bổ sung 200 mg/l glutamine, 5 mg/l BAP không cần bổ sung Auxin và môi trường Gresshoff và Doy (GD) bổ sung 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l IBA

Năm 1993, McKellar đã thực hiện nghiên cứu vi nhân giống Pinus patula trong điều kiện in vitro Nghiên cứu này khảo sát các khả năng và khó khăn của ba hệ thống

in vitro khác nhau để nhân rộng P patula là nguồn vật liệu hiếm và quan trọng Kỹ thuật

nảy mầm và khử trùng hạt đã được phát triển cho thí nghiệm tạo phôi soma và chồi bất

định Chồi bất định được lấy từ phôi trưởng thành P patula và được nuôi cấy trên môi

trường LVM chứa 5 mg/l BA Nghiên cứu này cung cấp một số kiến thức cơ bản và các công việc nền tảng cho những người gây giống cây muốn thực hiện các kỹ thuật công

nghệ sinh học trong việc lựa chọn và cải tiến các kiểu gen P patula