phân lập và tinh chế hoạt chất sinh học có khả năng kháng staphylococcus aureus atcc 43300 mrsa từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành eleutherine subaphylla gagnep

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- HÀ LONG PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG Staphylococcus aureus ATCC 43300 MRSA TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- ∞0∞ -

HÀ LONG

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT SINH HỌC CÓ

KHẢ NĂNG KHÁNG Staphylococcus aureus ATCC

43300 (MRSA) TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH

(Eleutherine subaphylla Gagnep.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- ∞0∞ -

HÀ LONG

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT SINH HỌC CÓ

KHẢ NĂNG KHÁNG Staphylococcus aureus ATCC

43300 (MRSA) TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH

(Eleutherine subaphylla Gagnep.)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Y dược Mã số chuyên ngành

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS Dương Nhật Linh

TS Nguyễn Tấn Phát

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

LỜI CẢM ƠN

Khoảng thời gian học việc và làm đề tài khóa luận tốt nghiệp tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh - Trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh là khoảng thời gian đáng nhớ nhất trong bốn năm đại học của tôi Tôi đã được học hỏi được rất nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu tại đây Cũng nơi đây, tôi có nhiều người bạn mới, dần lại trở thành gia đình lúc nào không hay, gắn bó với nhiều kỷ niệm vui buồn khác nhau Để hoàn thành được đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, các anh chị, các bạn và cả gia đình

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Văn

Minh và cô Dương Nhật Linh Thầy cô đã tận tình dạy bảo cách làm người, chia sẻ

những giá trị bổ ích, hướng dẫn những kiến thức chuyên ngành cũng như kĩ năng sống Thầy cô cũng luôn tiếp động lực cho chúng em trong những lúc khó khăn để hoàn thành tốt đề tài của mình

Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Tấn Phát và các anh chị tại Viện Công

nghệ Hóa học - số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh, đã luôn hết mình hỗ trợ và giúp đỡ em rất nhiều để em có thể hoàn thành đề tài một cách tốt nhất

Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Quý thầy cô đã hết lòng giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng vững chắc để em có thể hoàn thành tốt công việc của mình

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni và các anh chị trong phòng thí nghiệm đã nhiệt

tình ủng hộ và giúp đỡ em giải quyết những vấn đề xảy ra trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn tất cả các bạn thành viên phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã bên cạnh giúp đỡ tạo điều kiện để tôi

hoàn thành tốt đề tài Cảm ơn bạn Nguyễn Thị Trúc Ly và ba em Trần Thanh Trí,

Nguyễn Thị Thanh Nguyệt, Huỳnh Thị Ánh Xuân đã hỗ trợ tôi hoàn thành tốt đề tài

Cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn Cha Mẹ, những người đã sinh thành, nuôi nấng

và dạy dỗ con Cảm ơn gia đình đã luôn bên cạnh con, luôn yêu thương và động viên những lúc con khó khăn, thậm chí là tồi tệ nhất, giúp con vững bước trên con đường mình đã chọn Cảm ơn vì đã luôn tôn trọng và ủng hộ những quyết định của con

Kính chúc tất cả quý thầy cô, anh chị, bạn bè, các em, cả gia đình dồi dào sức khỏe, luôn luôn hạnh phúc và gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống Xin chân thành cảm ơn!

Bình Dương, tháng 08 năm 2020

Hà Long

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) 6

1.2 Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) 8

1.2.1 Phân loại khoa học 8

1.2.7 Các bài thuốc chữa bệnh từ sâm đại hành 15

1.2.8 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 17

1.3 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu 20

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu nghiên cứu 25

2.3 Môi trường – hóa chất 25

2.4 Thiết bị và dụng cụ 25

SVTH: Hà Long

2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 26

2.6 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 29

2.7 Khảo sát hoạt tính kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 30

kháng methicillin (MRSA) các loại cao chiết 30

2.8 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) 31

2.9 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) 31

2.10 Phương pháp sắc ký cột 32

2.11 Phương pháp hiện hình sinh học 33

2.12 Phương pháp xác định cấu trúc 34

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả giám định tên khoa học của cây 36

3.2 Thu nhận cao chiết ethyl acetate từ cây sâm đại hành 36

3.3 Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 37

3.4 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao tổng 37

3.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn Staphyloccoccus aureus ATCC 43300 (MRSA) 38

3.6 Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột 40

3.7 Kết quả khảo sát khả năng kháng MRSA 42

3.7.1 Phương pháp khuếch tán đĩa giấy 42

3.7.2 Phương pháp hiện hình sinh học 44

3.8 Sắc ký cột cao chiết 45

3.9 Khảo sát các phân đoạn cao ES-EA1 49

13.10 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ES06 52

SVTH: Hà Long

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 1 Tài liệu tiếng Việt 65 2 Tài liệu tiếng Anh 66

SVTH: Hà Long

DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 1.1 Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn sống có trong cao chiết 37 Bảng 1.2 Kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với vi khuẩn MRSA từ cao chiết sâm đại hành 39 Bảng 1.3 Hàm lượng thu nhận các cao phân đoạn từ cao phân đoạn ethyl acetate 40 Bảng 1.4 Kết quả thử khả năng kháng MRSA của các phân đoạn từ cao ethyl acetate 42 Bảng 1.5 Kết quả khảo sát cao ES-EA1.4.1.1 50 Bảng 1.6 Dữ liệu phổ 13C (125 Hz) và 1H (500 Hz) của ES06 và chất rhein đo trong

DMSO-d6 54 Biểu đồ 1.1 So sánh kết quả kháng MRSA của các phân đoạn từ cao ethyl acetate 44

SVTH: Hà Long

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình vi thể MRSA 6

Hình 1.2 Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) 9

Hình 1.3 Công thức hóa học của eleutherin và isoeleutherin 10

Hình 1.4 Công thức hóa học của eleutherol và anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4 methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester 11

Hình 1.5 Công thức hóa học của eleutherinone 11

Hình 1.6 Công thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B, eleuthoside C, elecanacin và hongconin 12

eleutherinol-8-O-Hình 3.1 Thiết bị máy cô quay 36

Hình 3.2 Cao ethyl acetate 36

Hình 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao tổng 38

Hình 3.4 Kết quả MIC kháng MRSA của cao ethyl acetate 40

Hình 3.5 Cột sắc ký thu phân đoạn 1 41

Hình 3.6 Cột sắc ký thu phân đoạn 2 41

Hình 3.7 Cột sắc ký thu phân đoạn 3 41

Hình 3.8 Cột sắc ký thu phân đoạn 4 41

Hình 3.9 Cột sắc ký thu phân đoạn 5 42

Hình 3.10 Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy 43

Hình 3.11 Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp hiện hình sinh học

Hình 3.18 Tinh thể của hợp chất ES06 51 Hình 3.19 SKLM hợp chất ES06 ở 254 nm và sau khi tác dụng với acid và nhiệt 51

Hình 3.20 Sơ đồ phân lập phân đoạn ES-EA1 52

Hình 3.21 Cấu trúc hóa học của ES06 53

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 26 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ chiết cao sâm đại hành 29

MIC Minimum Inhibitory Concentration

SVTH: Hà Long

ĐẶT VẤN ĐỀ

SVTH: Hà Long

Trong các thập kỷ qua, các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ tử vong do nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh tăng đáng kể và lan truyền rộng rãi trên toàn thế giới do việc lạm dụng kháng sinh ngày càng phổ biến Khoảng 11,000 ca tử vong liên quan đến MRSA bao gồm viêm phổi hoại tử, viêm tủy xương và nhiễm trùng huyết đã được báo cáo hàng năm (Mohammad H và cs., 2015) Tỷ lệ MRSA ở Đông Nam Á dao động từ 7% ở Philippines, ở Malaysia đến 25% và 39% ở Singapore (Lestari và cs., 2012) Từ

293 chủng Staphylococcus aureus phân lập từ mẫu bệnh phẩm tại Khoa Sinh học Lâm

sàng, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh đã xác định được 49,7% chủng MRSA (Phan Nữ

Đài Trang và cs., 2016) S aureus kháng methicillin (MRSA) đã trở thành nguyên nhân

phổ biến của kháng kháng sinh Tình trạng kháng methicillin gia tăng đáng kể ở các

chủng S aureus lâm sàng ở các nước châu Âu lên tới 20% Vấn đề kháng thuốc đang gia

tăng và việc khám phá ra các tác nhân mới có hiệu quả chống lại MRSA là hết sức cần thiết Do đó việc tìm nguồn thuốc mới ngày càng cấp thiết, thực vật là nguồn quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu trong các năm gần đây

Hiện nay, cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật cho mục đích chữa bệnh ngày càng nhiều Việc sử dụng dược liệu đã tăng vượt bậc trong thập kỷ vừa qua Thực vật được xem như là một trong những nguồn thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, không hoặc ít phản ứng phụ và có nhiều đích tác động khác nhau lên tế bào vi khuẩn nên ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs., 2002) Dược liệu đóng một vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khỏe với khoảng 80% dân số thế giới sử dụng thuốc y học cổ truyền chủ yếu dựa vào thực vật (Owolabi và cs., 2007) Theo WHO, cây thuốc sẽ là nguồn tốt nhất để có được nhiều loại thuốc Thuốc có nguồn gốc thực vật đã đóng góp lớn cho sức khỏe con người (El-Astal và cs., 2005) Sự phong phú của cây thuốc trong tự nhiên và kiến thức truyền thống làm tăng sự hiểu biết về tính chất, tính an toàn và hiệu quả của cây thuốc (Nascimento và cs., 2000) Mối quan tâm về tính chất, tính an toàn và hiệu quả của cây thuốc đã được thể hiện do sự kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh trên lâm sàng đối với các kháng sinh đã được sản xuất trong những

SVTH: Hà Long

thập kỷ qua (Cohen và cs., 1992; Nascimento và cs., 2000) Hiện nay, các bài báo nghiên cứu về chiết xuất hợp chất từ các loài thực vật có hoạt tính sinh học cho mục đích làm thuốc gia tăng nhanh chóng (Nascimento và cs., 2000; Rios và cs., 2005)

Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một loại thảo mộc trong họ La

dơn, một họ thực vật bao gồm 90 chi và 1200 loài (Schultes và cs., 1990) Sâm đại hành có tác dụng điều trị một số bệnh như kinh nguyệt không đều (Hodge và cs., 1956), rối loạn đường ruột (Van den Berg, 1984; Lin và cs., 2002) Thân rễ của sâm đại hành được sử dụng như một tác nhân cầm máu và kháng khuẩn (Dam và cs., 1990) Các loại thực vật thuộc chi này đã phân lập và xác định được một số hợp chất bao gồm elecanicin, eleutherol, isoeleutherol, eleutherin, isoeleutherin (Hara và cs., 1997), hongconin (Zhengxiong và cs., 1984) và anthraquinones (Komura và cs., 1983) Đồng thời, củ của

Eleutherine americana từ lâu đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị

bệnh tim, bệnh tiểu đường, ung thư vú, đột quỵ, tăng huyết áp và rối loạn tình dục đặc biệt là rối loạn mạch vành ở đảo Hải Nam, Trung Quốc (Ieyama và cs., 2011; Chen và cs., 1981; Mahabusarakam và cs., 2010; Han và cs., 2008) Theo nhiều báo cáo, củ của

E americana chứa anthraquinones, naphthoquinones, các dẫn xuất của naphtalene và

các hoạt tính sinh học quan trọng, chẳng hạn như giãn mạch vành, giảm prothrombin, chống đông máu, chữa lành vết thương, ức chế topoisomerase II, ức chế HIV, kháng nấm và chống ung thư (Alves và cs., 2003; Shibuya và cs., 1997; Francesca và cs., 2010; Chen và cs., 1986; Qiu và cs., 2005; Xu và cs., 2005)

Hiện nay các nghiên cứu, bài báo khoa học trong nước về khả năng chữa bệnh trong các bộ phận của cây sâm đại hành còn rất hạn chế cũng như còn khá ít các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cao chiết sâm đại hành Kế thừa kết quả từ đề tài

nghiên cứu trước “Phân lập và tinh chế hoạt chất kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)” cho thấy

kết quả cao ethyl acetate có khả năng kháng mạnh với MRSA (25,67 ± 0,86 mm) Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA ở người từ các phân đoạn của cao

SVTH: Hà Long

ethyl acetate đồng thời phân lập và tinh chế các hoạt chất khác có hoạt tính sinh học nói

trên Chính vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và tinh chế hoạt chất sinh học

có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)”

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết sâm đại hành:

+ Khảo sát khả năng kháng khuẩn của sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy

+ Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với MRSA

- Xác định cấu trúc của hợp chất ES06.

SVTH: Hà Long

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

MRSA đề kháng penicillin M chủ yếu qua trung gian gen mecA mã hóa cho protein 2A gắn penicillin (PBP 2A hoặc PBP 2’) Khi được tạo ra, PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với kháng sinh β-lactam, nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được không chỉ penicillin M mà còn với tất cả các kháng sinh β-lactam (Phạm Hùng Vân, 2013)

Kể từ những năm 1960, MRSA trở nên phổ biến trên toàn cầu và là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn ở bệnh viện và cộng đồng Các chủng MRSA mang gen mã hóa protein làm cho vi khuẩn kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm β-lactam (như methicillin) (Lee và cs., 2018)

Phân loại khoa học

SVTH: Hà Long

methicillin được đưa vào sử dụng rộng rãi nhưng chỉ 1 năm sau, chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin được phân lập (Jevons và cs., 1961)

Kể từ lần đầu tiên xuất hiện vào năm 1960 (Jevons và cs., 1961) tình trạng kháng

methicillin ở các chủng S aureus đã trở nên phổ biến trong các bệnh viện Hệ thống

giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia (NNISS) đã ghi nhận sự gia tăng MRSA tại các bệnh viện lớn ở Hoa Kỳ, từ 4% vào những năm 1980 lên 50% vào cuối những năm 1990 Ở một số bệnh viện, đã ghi nhận được tỷ lệ kháng thuốc cao tới 80% (Wenzel và cs., 1991) Sự gia tăng các trường hợp nhiễm khuẩn MRSA khởi phát tại bệnh viện, với ước tính khoảng 18.900 trường hợp trong năm 2005 (Klevens và cs., 2007)

Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra:

Đông Nam Á hơn 25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, Châu Âu 60%, Châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, Châu Mỹ 90% (WHO, 2018) MRSA là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác Tần suất tử vong hàng năm từ MRSA đang gia tăng nhanh chóng và vượt qua những người gây ra bởi virus suy giảm miễn dịch ở người/hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS) (Bancroft và cs., 2007), từ năm 1999 đến 2005, số ca nhập viện liên quan đến nhiễm trùng MRSA tăng 119%, hay 14% mỗi năm (Klein và cs., 2007), khoảng 1.650 trường hợp nhiễm dòng máu và 500 trường hợp tử vong hàng năm ở Úc (Turnidge và cs., 2009), 11.000 người chết mỗi năm tại Hoa Kỳ (Dantes và cs., 2011) và một chi phí vượt quá hàng năm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của châu Âu là 380 triệu euro (Köck và cs., 2010)

Đứng trước tình hình S aureus kháng với penicillin do gần 100% có khả năng tiết

được enzyme penicillinase phá huỷ được penicillin, các nhà lâm sàng phải chỉ định

penicillin M để điều trị các nhiễm khuẩn do S aureus Tuy nhiên hiện nay các bác sĩ điều trị phải đối phó với thách thức là tác nhân S aureus kháng được penicillin M

(MRSA) với tỷ lệ ngày càng gia tăng Tại Việt Nam, một nghiên cứu đa trung tâm thực

hiện năm 2005 trên 235 chủng S aureus phân lập được từ các trường hợp lâm sàng

SVTH: Hà Long

nhiễm khuẩn do S aureus cho thấy tỷ lệ MRSA là 47% Tổng kết tại Bệnh Viện Chợ

Rẫy và Bạch mai cũng cho thấy tỷ lệ MRSA là 57% và 43% Tổng kết của GARP:VN cho thấy tỷ lệ MRSA ghi nhận từ 15 bệnh viện tại VN vào năm 2008 là từ 30% đến 64% Bệnh viện Thống Nhất TP HCM từ năm 2005 đến 2007 đã ghi nhận có đến 79%

Staphylococcus saprophyticus và 40% S aureus phân lập từ nhiễm khuẩn đường tiết

niệu kháng methicillin Chỉ định kháng sinh dành cho MRSA là vancomycin, tuy nhiên hiện nay chỉ định này đang phải đối diện với một thách thức mới, không phải là do xuất

hiện đề kháng vancomycin mà là do MIC của vancomycin đối với S aureus bị tăng vượt

quá 1,5 μg/mL gây thất bại điều trị vancomycin trên lâm sàng Thách thức này hiện nay đã được ghi nhận tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Chợ Rẫy với ghi nhận 46% các chủng MRSA là có MIC của vancomycin ≥ 2 μg/mL và 93% có MIC ≥ 1,5 μg/mL (Phạm Hùng Vân, 2016)

Một nghiên cứu tương đối rộng ở 3 tỉnh (Đà Nẵng, Cần Thơ và Tp Hồ Chí Minh) của Phạm Hùng Vân và Phạm Thái Bình cho thấy MRSA kháng lại hầu hết các loại kháng sinh thông dụng, kể cả kháng sinh thế hệ mới (gentamycin: 42%, erythromycin: 63%, azithromycin: 68%, ciprofloxacin: 39%, cefuroxime: 38%, amoxillin-acid clavuanic: 30%, chloramphenicol: 38%, methicillin: 47%) (Phạm Hùng Vân và cs., 2005)

1.2 Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)

1.2.1 Phân loại khoa học Giới: Plantae

SVTH: Hà Long

Loài: Eleutherine subaphylla Gagnep

Hình 1.2 Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)

Tên khoa học: Eleutherine subaphylla Gagnep

Tên đồng nghĩa: Eleutherine bulbosa (Mill.) Urban, E longifolia Gagnep

Còn gọi là: tỏi lào, sâm cau, sâm đại hành, hành lào (Hòa Bình), tỏi mọi, kiệu đỏ, co nhọt (Lào), phong nhan, hom búa lượt (Thái)

Người ta dùng củ tươi hay phơi hoặc sấy khô của cây sâm đại hành làm thuốc với

tên khoa học Bul-bus Eleutherinis subaphyllae (Đỗ Tất Lợi, 2006)

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Là cây thảo sống lâu năm, cao trung bình từ 30-60 cm Dò hình trứng dài 4-5 cm, đường kính 2-3 cm, giống như củ hành nhưng dài hơn, bên ngoài phủ vẩy màu đỏ nâu, phía bên trong màu nâu hồng đến đỏ nâu Lá hình mác, gân lá song song, dài 40-50 cm, rộng 3-5 cm Từ đó mọc lên một cán mang hoa dài 30-40 cm Hoa mọc thành chùm, 3

SVTH: Hà Long

lá đài, 3 cánh hoa màu trắng hay vàng nhạt, 3 nhị màu vàng Bầu hình trứng, 3 cạnh 3 ngăn dài 1 mm, vòi dài 2,5 mm trên xẻ thành 3 trông như 3 mũi dùi (Đỗ Tất Lợi, 2006)

1.2.3 Phân bố, thu hái và chế biến

Sâm đại hành thường mọc hoang ở các sườn đồi, bìa rừng hoặc dưới tán rừng Cây còn được trồng để lấy củ làm thuốc ở nhiều nơi như: Hòa Bình, Hà Tây, Nghĩa Lộ, Nghệ An, Hà Tĩnh,… Ở Hà Nội và một số địa phương cũng có nhà trồng, trồng (tỏi đỏ) rất đơn giản, chỉ việc vùi cây xuống đất như trồng hành, trồng tỏi

Thân hành thu hái ở cây đã trồng được 1 năm trở lên, vào lúc thân lá đã tàn úa Nếu chưa dùng ngay, tách ra từng nhánh, rũ sạch đất, để nguyên cả rổ và lớp vỏ khô ở ngoài, cắt bỏ phần thân lá, để trong cát ẩm hay chỗ mát cho củ lâu khô Với cách này, có thể bảo quản dược liệu dược vài tháng Khi dùng, rửa sạch thân rễ, thái mỏng phơi khô, để nguyên miếng hoặc tán bột

Vị thuốc có màu đỏ, dùng ngâm rượu mùi vị rất thơm ngon

1.2.4 Thành phần hóa học

Năm 1951, lần đầu tiên cây sâm đại hành được nghiên cứu bởi Schmid và cộng sự, hai hợp chất là eleutherin và isoeleutherin đã được cô lập (Schmid và cs., 1951)

Hình 1.3 Công thức hóa học của eleutherin và isoeleutherin

Năm 1975, Bianchi và cộng sự đã cô lập từ củ của cây sâm đại hành hai hợp chất là eleutherin và eleutherol (Bianchi và cs., 1975)

SVTH: Hà Long

Năm 1982, từ củ Sâm đại hành người ta đã cô lập được một anthraquinon mới là anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester (Weniger B và cs., 1982)

Hình 1.4 Công thức hóa học của eleutherol và diol-4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester

anthracene-9,10-dione-1,5-Năm 2003, Helmut Kloos và cộng sự đã công bố kết quả cô lập được hợp chất eleutherinone cũng từ thân rễ của cây sâm đại hành

Hình 1.5 Công thức hóa học của eleutherinone

Thành phần hóa học của cây sâm đại hành, 4 hợp chất polyketit mới được phân lập gồm (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside và isoeleuthoside C (dihydroisoeleutherin-5-O-D-gentiobioside) cùng với các chất đã được cô lập trước đó gồm eleutherin, isoeleutherin, eleutherinol, eleutherol, eleuthoside B (eleutherol-4-O-D-gentiobioside), eleuthoside C (dihydroeleutherin-5-O-Dgentiobioside), elecanacin và hongconin (4-oxodihydroisoeleutherin) (Francesca và cs., 2010)

SVTH: Hà Long

Hình 1.6 Công thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B,

eleuthoside C, elecanacin và hongconin

Ở Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học của loài sâm đại hành, ngoài công bố cô lập được 4 hợp chất là eleutherin C16H16O4 độ chảy 175o, izoeleutherin C16H16O4 độ chảy 177o, eleutherola C14H12O4 độ chảy 202-203o và một chất chưa xác định được đặt tên là Ex của Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn SKLM của dịch chiết còn cho biết có 16 vết trong đó 9 vết màu vàng đậm nhạt khác nhau, 6 vết phát quang lơ và một vết màu hồng nhạt Cả 3 hoạt chất đều có tác dụng kháng sinh đối

với chủng S aureus (Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn, 1973)

SVTH: Hà Long

Như vậy, trên thế giới đã có các nghiên cứu về cây sâm đại hành từ rất sớm Các nghiên cứu cho thấy thành phần hoá học chủ yếu của sâm đại hành là các hợp chất quinone và dẫn xuất

1.2.5 Tác dụng dược lý

Dịch chiết toàn phần củ sâm đại hành có tác dụng ức chế rõ rệt in vitro đối với

phế cầu khuẩn, liên cầu tan máu, tụ cầu vàng, tác dụng yếu với Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, có tác dụng chống viêm cấp tính và

mãn tính; không gây biểu hiện độc tính; không ảnh hưởng đến thành phần máu và chức phận gan, thận, trong thử nghiệm độc tính bán cấp (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)

Sâm đại hành có tác dụng làm tăng hồng cầu và huyết sắc tố chuột cống trắng được gây mô hình thiếu máu bằng acetate chì Có tác dụng an thần, làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột nhắt trắng, làm giảm sự khéo léo, nhanh nhẹn của chuột nhắt trắng trong thí nghiệm chuột leo ống và có tác dụng kéo dài thời gian giấc ngủ gây bởi thuốc ngủ evipan, đồng thời có tác dụng ức chế sự hưng phấn gây bởi cafein và co giật gây bởi strychnin (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)

Các hợp chất: eleutherin, isoeleutherin, eleutherol, isoeleutherol là những thành phần trong sâm đại hành có hoạt tính kháng khuẩn và làm tăng lưu lượng tuần hoàn ở tim cô lập chuột lang Thuốc viên và mỡ từ cao khô sâm đại hành dùng điều trị cho 20 bệnh nhi (8 ca nhọt, 4 ca chốc, 4 chốc chàm hóa, 2 chàm tiếp xúc, 1 viêm da mủ, 1 chàm vi khuẩn), đã chữa khỏi 80% Làm kháng sinh đồ thấy 7/9 trường hợp có tụ cầu vàng hoặc liên cầu týp B, hầu hết vi khuẩn kháng với tất cả các kháng sinh Thuốc không gây tác dụng không mong muốn (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)

Viên sâm đại hành điều trị 53 cháu bị viêm nhiễm đường hô hấp trên do nhiễm vi khuẩn nhẹ, hoặc nhiễm siêu vi khuẩn (cảm cúm nhẹ và vừa) có kết quả tốt thay thế được kháng sinh Thuốc đã chữa khỏi nhanh các triệu chứng và đạt số ngày nằm điều trị tương tự như với thuốc kháng sinh Thuốc không gây tác dụng phụ Viên sâm đại hành dùng

SVTH: Hà Long

phối hợp với INH và pyrazinamid điều trị lao phổi, đã có tác dụng làm giảm sốt, giảm khạc đờm, giảm ho ra máu, làm cho dễ ngủ và ăn ngon Viên Đại can gồm sâm đại hành và xạ can có tác dụng tốt đối với viêm họng cấp tính nhẹ (85% kết quả khá và tốt); đối với viêm họng mạn tính, tỷ lệ khỏi và khá thấp hơn, khoảng 63,8% Có thể dùng viên Đại can cho mọi lứa tuổi, ngậm hoặc uống Thuốc có tác dụng chống viêm rõ rệt, đồng thời có tác dụng long đờm, có thể dùng điều trị chứng ho thông thường, không gây tác dụng không mong muốn (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)

Viên sâm đại hành còn dùng điều trị cho 25 trường hợp sau phẫu thuật ruột thừa chưa có biến chứng, dùng thuốc từ ngày thứ 2 sau mổ trong 7 ngày, các vết mổ tiến triển tốt, không có mủ Thuốc không gây tác dụng phụ Viên sâm đại hành có tác dụng tốt khi áp dụng để phòng nhiễm khuẩn sau đặt vòng tránh thai Sâm đại hành cũng có tác dụng tốt đối với các vết thương có mủ, vết bỏng Viên sâm vông gồm sâm đại hành và lá vông có tác dụng gây ngủ, tác dụng tốt với chứng mất ngủ do bệnh mạn tính như viêm đại tràng, loét dạ dày; tác đụng hạn chế đối với những bệnh nhân có hội chứng nhiễm khuẩn gây mất ngủ và đối với suy nhược thần kinh Tác dụng tốt với bệnh nhân mất ngủ đầu giờ, ngủ không sâu (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)

1.2.6 Công dụng

Thuốc bổ máu chữa thiếu máu, vàng da, xanh xao, hoa mắt, choáng váng, nhức đầu, mệt mỏi Thuốc cầm máu dùng trong băng huyết, ho ra máu, bị thương chảy máu (dùng củ tươi, giã đắp) Còn dùng chữa ho gà, viêm họng, mụn nhọt, chốc lở

Ở Indonesia, rễ sâm đại hành được dùng theo kinh nghiệm dân gian làm thuốc lợi tiểu, trị lỵ, viêm và sa trực tràng Ở Philippine, nhân dân dùng rễ củ giã nát đắp lên vết cắn của cá độc, để nhổ gai ở chân, và đắp vào vết châm đốt của sâu bọ, vết thương, nhọt Rễ củ nướng, giã nát, xát vào bụng chữa đau bụng, ở Peru, thổ dân vùng Amazon dùng sâm đại hành trị rối loạn tiêu hóa và bệnh ngoài da Ở vùng trung Hải, rễ sâm đại hành trị vô kinh dưới dạng thuốc sắc hoặc ngâm rượu uống

SVTH: Hà Long

1.2.7 Các bài thuốc chữa bệnh từ sâm đại hành

1.2.7.1 Bài thuốc chữa thiếu máu và sa trực tràng

Bài thuốc từ sâm đại hành chữa thiếu máu và sa trực tràng cần tích hợp thêm một số vị thuốc khác Trong đó chẳng hạn như đẳng sâm 15 g, xuyên khung 6 g, huỳnh kỳ 15 g và sâm đại hành 15 g Sau đó đem toàn bộ thuốc tạo thành 1 thang và sắc uống với liều lượng vừa đủ

Mỗi ngày nên uống khoảng 2-3 bát thuốc Duy trì điều độ liều lượng như vậy trong vòng 1 tháng là có thể cải thiện bệnh Đặc biệt nếu trong vòng 1 tháng tình trạng bệnh có phần thuyên giảm thì có thể giảm liều lượng thuốc lại

1.2.7.2 Bài thuốc chữa mụn nhọt và sưng tấy

Sâm đại hành 4 g vừa đủ sắc với 16 g bông trang, 16 g sài đất Đi kèm với đó là 16 g đơn tướng quân, bồ công anh Sắc chung các vị thuốc trong một cái nồi với lượng nước vừa đủ và dùng trong 1 ngày Với những thành phần dưỡng chất trong các vị thuốc, mụn nhọt sẽ giảm sưng tấy và lành dần

Mặt khác cũng có thể áp dụng cách 2 để chữa mụn nhọt Chỉ cần sắc 20 g sâm đại hành cùng 12 g ké đầu ngựa và 12 g đơn đỏ, 12 g bạch chỉ Sắc nồi thuốc cho đến khi chỉ còn 3-4 bát là có thể dừng

Mỗi lần uống thuốc cần đắp thêm hỗn hợp lá táo chua và rễ cau lên mụn nhọt Cần giã nát lá táo chua và rễ cau để các thành phần trong thuốc có thể phát huy tác dụng

1.2.7.3 Bài thuốc cải thiện giấc ngủ

Mỗi giấc ngủ ngon luôn giúp cho cơ thể khỏe mạnh và tràn đầy sức sống Vì thế để có thể chữa trị bệnh mất ngủ và stress thì có thể áp dụng bài thuốc từ kiệu đỏ Từ những dưỡng chất trong kiệu đỏ có thể giúp cơ thể điều hòa và cải thiện giấc ngủ tốt

Ngoài ra cũng có thể chế tạo thành từng viên thuốc để dùng cũng được Phương pháp này có thể giúp bạn tiết kiệm tối đa thời gian khi thực hiện sắc thuốc Cách đơn giản là bạn chỉ cần nấu thành cao và nén chúng thành viên rồi bảo quản tốt là ổn

1.2.7.4 Bài thuốc chữa ho và viêm phế quản

Để trị ho và viêm phế quản cần chuẩn bị khoảng 20 g sâm đại hành Đi cùng với đó là 12 g cam thảo nam, 20 g lẻ bạn, 12 g lá chanh và 20 g rễ dâu Đem rửa sạch các thảo dược rồi đem cho vào nồi và sắc uống mỗi ngày 1 thang

Tuy nhiên đối với trẻ nhỏ thì bài thuốc chữa ho và viêm phế quản lại khác Cần chuẩn bị 100 g sâm đại hành đem sắc chung với 50 g xạ can, sắc theo dạng cô đặc hỗn hợp còn lại 300 mL là được Mỗi ngày cho bé uống khoảng 12-30 mL là được

Bên cạnh đó đối với trường hợp viêm phế quản có chứa nhiều đờm thì cần áp dụng cách khác Để áp dụng bài thuốc này cần 100 g sâm đại hành tươi, 20 g phèn phi, 50 g gừng khô Đi kèm với đó là 20 g trần bì, 200 g hạt đinh lịch và 30 g bán hạ Sau đó thực hiện như sau:

+ Đầu tiên, thái sâm đại hành tươi thành từng lát mỏng và phơi khô

+ Tiếp đó đem hạt đinh lịch sao đen, bán hạ chế Còn các vị khác đem tán nhỏ

+ Sau đó, đem gừng và các nguyên liệu trộn chung và sắc lên với lượng nước vừa đủ

SVTH: Hà Long

+ Cuối cùng, chia đều thuốc thành từng phần bằng nhau và dùng trong ngày

1.2.7.5 Bài thuốc chữa bệnh về gan

Bài thuốc chữa bệnh gan từ sâm đại hành rất dễ dàng Dùng khoảng 12 g sâm đại hành, 12 g lá vọng cách, 30 g cây bìm bịp, 12 g lá quao Sau đó đem sắc chung với 20 g rau ngô, 10 g trần bì và 1000 mL nước

Một khi sắc nồi thuốc, đun với lửa vừa và nhỏ để tránh nước thuốc trào ra ngoài Đun như vậy khoảng 30 phút để cho lượng nước cạn dần đi là có thể dùng được Mỗi ngày chia thành 3 lần cho người bệnh uống là có thể chữa được bệnh

1.2.7.6 Bài thuốc chữa rắn cắn

Sâm đại hành có tác dụng chữa vết rắn cắn rất tốt Dùng một lượng nhỏ sâm đại hành đem rửa sạch rồi đập dập và vắt lấy nước Tiếp đó dùng bã của cây đắp vào vết thương còn phần nước thì uống Công đoạn này sẽ giúp cho các thành phần trong kiệu đỏ rút hết phần độc của rắn

1.2.8 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

1.2.8.1 Trên thế giới

Sâm đại hành có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Mỹ, củ màu đỏ thuôn dài đã được người dân địa phương sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị bệnh tim mạch, đặc biệt là rối loạn mạch vành (Ding và cs., 1983) Ngoài ra, sâm đại hành còn được sử dụng như một thuốc truyền thống để tống hơi trong ruột ra Củ sâm đại hành kết hợp với riềng để điều trị tình trạng cảm lạnh và tắc nghẽn mũi ở trẻ em (Saralamp và cs., 1996) Các chiết xuất dichloromethane từ sâm đại hành: eleutherinone, eleutherin,

isoeleutherin, và eleutherol cũng đã được chứng minh chống lại Cladosporium sphaerospermum Tất cả các hợp chất cô lập được đều cho thấy các hoạt tính kháng nấm

mạnh mẽ trừ eleutherol (Alves và cs., 2003)

SVTH: Hà Long

Sirirak và cộng sự (2011) đã báo cáo sâm đại hành là một ứng cử viên cho việc

kiểm soát loài Campylobacter Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol của cây sâm đại hành chống lại Campylobacter spp đã được nghiên cứu Sáu mươi lăm chủng Campylobacter, bao gồm 39 chủng phân lập từ người và 26 chủng phân lập từ gà đã

được thử nghiệm Các chiết xuất ethanol của củ sâm đại hành chứng minh hoạt tính kháng khuẩn chống lại tất cả các chủng thử nghiệm Các vùng ức chế dao động trong khoảng 10-37 mm

Subramaniam và cộng sự (2012) tiến hành xác định thành phần hóa học của củ sâm đại hành đã tìm thấy sự hiện diện của phenol, sterol, phlobatannins, protein, steroids, tannin và đường Chiết xuất ethanol của củ sâm đại hành đã được thử nghiệm chống lại mầm bệnh kháng đa thuốc và cho thấy đó là một nguồn tiềm năng của tác nhân kháng

khuẩn chống lại Methicillin resistant S aureus và Acinetobacter baumannii, với hoạt

tính kháng khuẩn cao hơn so với thuốc kháng sinh tiêu chuẩn

Theo nhóm nghiên cứu của Fitri và cộng sự (2014), đã nghiên cứu về tác dụng ức chế chu kỳ tế bào và thúc đẩy sự chết theo chương trình của chiết xuất sâm đại hành trên tế bào ung thư vú Kết quả kiểm tra gây độc tế bào trong điều trị với tế bào T47D (tế bào T47D là một dạng của các tế bào ung thư vú đã bị đột biến p53 có khả năng kháng với cơ chế chết theo chương trình − cơ chế sinh lý của tế bào cắt giảm để sửa chữa các mô

và để xử lý các tế bào bị hư hỏng mà có thể nguy hiểm cho cơ thể) Các chiết xuất

n-hexane, ethyl acetat và chiết xuất ethanol của sâm đại hành cho các giá trị IC50 (nồng độ gây chết 50% tế bào) tương ứng là 265,023 µg/mL, 147,124 µg/mL và 3782,29 µg/mL Đối với chu kỳ tế bào, kết quả là ức chế chu kỳ tế bào trên phase G0-G1 với một tỷ lệ 40,88%

Năm 2018, Harlita và cs đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của Eleutherine palmifolia L (Merr) đối với vi khuẩn gây bệnh kết quả từ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ n-hexane, ethyl acetate và ethanol 96% ức chế tích cực sự tăng trưởng của MRSA, Bacillus cereus, Shigella spp., và Pseudomonas

SVTH: Hà Long

aeruginosa Các loại chiết xuất và nồng độ khác nhau có các hoạt động ức chế khác

nhau Do đó, nồng độ của chiết xuất được sử dụng càng cao thì hoạt tính ức chế càng cao

1.2.8.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam theo Đỗ Tất Lợi (2006), sâm đại hành (Eleutherine subaphylla

Gagnep.) có tác dụng kháng sinh, chống viêm,…đã được sử dụng phổ biến trong dân gian.

Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu đã nghiên cứu về sự thuần chủng và tính kháng khuẩn của sâm đại hành kết quả cho thấy sâm đại hành không thuần chủng, được chia làm 11 dòng, tính kháng khuẩn của các dòng trên vi khuẩn được thử nghiệm có sự khác

nhau, nhưng tất cả đều tác động rất tốt trên S aureus (MIC = 256-512 µg/mL), kế đến Streptococcus faecalis (MIC = 512-1024 µg/mL), yếu hơn trên P aeruginosa và Aeromonas hydrophila (MIC = 2048-4096 µg/mL), kháng khuẩn yếu nhất trên Escherichia coli và Salmonella spp (MIC = 4096 µg/mL)

Nghiên cứu về hợp chất eleutherine trong sâm đại hành Việt Nam (E subaphylla

Gagnep.) của tác giả Trương Minh Lương và Trần Văn Huy (2012) đã xác định cấu trúc, mô tả tính chất vật lý và tổng hợp các dẫn xuất của eleutherine (Trương Minh Lương và cộng sự, 2012)

Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự (2013) đã nghiên cứu quy trình tách chiết hợp

chất eleutherin và isoeleutherin từ củ sâm đại hành (Eleutherine bulbosa), đánh giá tác

dụng kháng sinh của chúng trên động vật thực nghiệm Kết quả đã cô lập được 10 hợp chất sạch và xây dựng được quy trình phân lập hỗn hợp eleutherin và isoeleutherin quy mô pilot, đồng thời đánh giá được chế phẩm từ sâm đại hành có tác dụng kháng khuẩn

mạnh ở các mức nồng độ thấp trên những chủng vi khuẩn đã thử là S aureus, Bacillus subtilis, S flexneri DT 112, Proteus mirabilis BV 108 và Bacillus pumilus (Nguyễn Thị

Hồng Vân và cộng sự, 2013)

Cao dược liệu được chia thành ba loại:

Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trò dung môi chính Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 mL cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế

Cao đặc: là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi còn lại trong cao không quá 20%

Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng Trong thực nghiệm việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn - lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method),… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007)

1.3.2 Kỹ thuật chiết ngâm chiết (Maceration)

Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép không rỉ có nắp đậy Rót dung môi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

SVTH: Hà Long

Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp tục rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý tránh nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Phương pháp làm ở nhiệt độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung môi và thời gian chiết (Từ Minh Koóng, 2007)

1.3.3 Phương pháp chiết lỏng - lỏng

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung

môi phân cực thí dụ như: ester dầu hỏa và n-hexane, ether ethyl, chloroform, ethyl

acetate, butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

SVTH: Hà Long

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (solvent extraction) Cao alcol thô ban đầu (ví dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (ví dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (ví dụ ester dầu hỏa ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (ví dụ các alcol béo, ester béo ), dung môi phân cực trung bình ( ví dụ dietyl ester, chlorofrom ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp chất có chứa nhóm chức ester –O–, aldehyd –CH=O, ceton –CO–, ester –COO– ) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ methanol ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH ) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.3.4 Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao dược liệu, thường phải tiến hành bốc hơi dung môi Có thể dùng nhiều thiết bị cô, sấy khác nhau, nhưng tốt nhất là tiến hành ở áp suất giảm và ở nhiệt độ cao cho sự phân hủy hoạt chất là tối thiểu (thường không quá 60oC) Tránh cô hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ cao (Từ Minh Koóng, 2007)

Cao dược liệu phải đạt các chỉ tiêu chất lượng cao thuốc được quy định trong dược điển Việt Nam IV năm 2009:

+ Cảm quan: cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định; có mùi, vị của dược liệu tương ứng,

+ Độ tan: cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao

500 trong 1 g (mL), không được có Salmonella trong 10 g (mL), mẫu không có E coli, P aeruginosa, S aureus trong 1 g (mL), tổng số enterobacteria không quá

500 trong 1 g (mL)

SVTH: Hà Long

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

SVTH: Hà Long

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 07 năm 2020- Địa điểm:

+ PTN Công nghệ Vi Sinh - cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương + Phòng 19, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, 01 Mạc Đĩnh Chi, Bến Nghé, Quận 1, TP Hồ Chí Minh

+ Phòng 4.4, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, TL29, Thạnh Lô ̣c, Quận 12, TP Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu củ cây sâm đại hành được thu mua ở Đồng Tháp được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM

Chủng S aureus ATCC 43300 (MRSA) được cung cấp bởi công ty Nam Khoa

Biotek

2.3 Môi trường – hóa chất

- Nutrient Broth (NB), Nutrient Agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA) - Cồn 96o, 70o, NaCl, HCl, NaOH, H2SO4 10%

- Các dung môi : n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol và nước

- Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất - Silica gel 60 (0.063 – 0.200 mm)

2.4 Thiết bị và dụng cụ

SVTH: Hà Long

Thừa kế quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi n-hexane từ công trình

nghiên cứu trước, tiếp tục thực hiện quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi ethyl acetate để thực hiện tiếp các thí nghiệm

Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:5, nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 72 giờ

- Cách thực hiện:

Tiến hành sấy khô củ sâm đại hành 50oC trong 72 giờ và xay nhuyễn sau khi định danh tên khoa học được Bột dược liệu thu được được chiết xuất bằng phương pháp ngâm dầm với các dung môi có độ phân cực khác nhau Tiến hành ngâm phân đoạn bột dược liệu với ethanol 96o trong bình ngâm chiết ở nhiệt độ phòng Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách cô quay ở 50oC và bốc hơi

SVTH: Hà Long

hết dung môi để thu cao thô Đem cân số cao này bằng cân phân tích Cao thô được hòa

tan với nước theo tỉ lệ 1:10 và đem chiết lỏng - lỏng qua các hệ dung môi n-hexane, ethyl

acetate và nước với tỉ lệ 1:1 Sau khi chiết lỏng - lỏng dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách phương pháp tương tự như trên Đem cân các cao phân đoạn này bằng cân phân tích (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Khi có cao chiết ethyl acetate tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC Sau đó sắc ký cột cao chiết ethyl acetate thu các phân đoạn, khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy để chọn ra phân đoạn kháng mạnh nhất với MRSA Tiến hành khảo sát kháng MRSA của phân đoạn kháng mạnh nhất bằng phương pháp hiện hình sinh học Sau đó tiến hành sắc ký cột phân đoạn kháng mạnh nhất với MRSA để thu nhận chất Khi chất được tinh sạch thì tiến hành gửi giải phổ 13C-NMR, 1H-NMR để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất thu được

Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức: H(%) = A/B x 100

SVTH: Hà Long

Sâm đại hành Định danh tên khoa học

Sấy khô và xay

Bột dược liệu

Chiết với các dung môi

Cô thành cao dược liệu

Khảo sát khả năng kháng MRSA Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Chạy cột sắc ký thu phân đoạn

Khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy và hiện hình sinh học

Chọn phân đoạn kháng MRSA tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận chất

Xác định cấu trúc của các hợp chất thu được

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

SVTH: Hà Long

2.6 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết

Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn có trong cao thuốc theo dược điển Việt Nam IV (Bộ y tế, 2009)

- Chuẩn bị mẫu

Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO 1% theo tỉ lệ 1 mg/mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng

- Đếm tổng số nấm men – nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí

Đối với mẫu đếm tổng số nấm men - nấm mốc: dùng môi trường Sabouraud dextrose agar Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng môi trường NA

Từ dung dịch mẫu thử 10-1, pha loãng bằng dung dịch NaCl 0,85% để được nồng độ pha loãng thấp hơn 10-2, 10-3,…

Đun chảy môi trường, để nguội khoảng 40-45oC Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi đĩa petri 1 mL mẫu thử Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15-20 mL môi trường Sau đó, xoay đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để mẫu thử được trộn đều trong môi trường cấy

Để thạch đông tự nhiên, sau đó lật ngược đĩa lại và ủ trong tủ ấm 37oC/ 24-48 giờ đối với mẫu đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, 28-30oC/5 ngày đối với mẫu đếm tổng số nấm men – nấm mốc