phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng candida albicans từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành eleutherine subaphylla gagnep

--- ∞0∞--- NGUYỄN THỊ TRÚC LY PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG Candida albicans TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH Eleutherine subaphylla Gagnep.. --- ∞0∞--- NGUY

- ∞0∞ -

NGUYỄN THỊ TRÚC LY

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ KHẢ

NĂNG KHÁNG Candida albicans TỪ CAO CHIẾT

ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH

(Eleutherine subaphylla Gagnep.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

- ∞0∞ -

NGUYỄN THỊ TRÚC LY

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ KHẢ

NĂNG KHÁNG Candida albicans TỪ CAO CHIẾT

ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH

(Eleutherine subaphylla Gagnep.)

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC - Y DƯỢC Mã số chuyên ngành:

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS DƯƠNG NHẬT LINH TS NGUYỄN TẤN PHÁT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

LỜI CẢM ƠN

Khoảng thời gian hơn 2 năm gắn bó với phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh - Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh là khoảng thời gian vui vẻ và có ý nghĩa nhất đối với tôi Để lại trong tôi rất nhiều những kỉ niệm và nhiều cảm xúc khác nhau buồn vui đều có và cũng chính tại nơi đây đã cho tôi những bài học kinh nghiệm quý báu Để hoàn thành đề tài này tôi xin cảm ơn thầy cô, anh chị, bạn bè và cả gia đình

Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến cô ThS Dương Nhật

Linh Cô là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và chia sẻ cho em những kiến

thức bổ ích, không chỉ những bài học về kiến thức mà còn có những bài học về kinh nghiệm trong cuộc sống qua những bài học đó đã giúp em trưởng thành và tự tin hơn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Tấn Phát đang

công tác tại Viện Công nghệ Hóa học, thầy là người đồng hướng dẫn và là người đã giúp đỡ em rất nhiều về mặt trang thiết bị, cũng như chỉ dạy cho em hiểu rõ các phương pháp có trong đề tài của em

Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học - Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Quý thầy cô đã hết lòng giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng vững chắc để em có thể hoàn thành tốt công việc của mình

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni đã hết lòng giúp đỡ em giải quyết các vấn

đề gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài

Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn tất cả các bạn khóa K16 - Y dược cùng làm khóa

luận tốt nghiệp chung với tôi ở phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh - Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã bên cạnh giúp đỡ tạo điều kiện để mình hoàn thành tốt

đề tài Em xin cảm ơn các anh, chị Phòng 19, Viện Công nghệ hóa học, 01 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1 và Phòng 44, Viện Công nghệ hóa học, Thạnh Lộc, Quận 12 đã

giúp đỡ em khi gặp khó khăn và giải quyết những vấn đề em gặp phải khi thực nghiệm tại Viện

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba Mẹ và Chị những người đã nuôi

dưỡng, chăm sóc và dạy dỗ con khôn lớn đến ngày hôm nay Cũng là người đã động viên, ủng hộ và tạo cho con những điều kiện tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình

Kính chúc tất cả quý thầy cô, anh chị, bạn bè, các em, cả gia đình dồi dào sức khỏe, luôn luôn hạnh phúc và gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 08 năm 2020

Nguyễn Thị Trúc Ly

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ vi

DANH MỤC VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep.) 6

1.1.1 Phân loại khoa học 6

1.3.2 Tình hình nghiên cứu C albicans 13

1.4 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT 15 1.4.1 Khái niệm 15

1.4.2 Kỹ thuật chiết (Maceration) 15

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU……… 21

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU………21

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 21

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và môi trường………21

2.3 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM……… 23

2.4 THU NHẬN CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH BẰNG DUNG MÔI ETHYL ACETATE……….24

2.5 XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT……… 25

2.6 ĐIỀU CHẾ CÁC PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ CỘT……… 26

2.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG C albicans CỦA CAO CHIẾT………28

2.7.1 Khảo sát khả năng kháng C albicans của các cao chiết từ sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch……… 28

2.7.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi nấm C albicans……… 29

2.7.3 Khảo sát khả năng kháng C albicans của các hợp chất thu nhận được bằng phương pháp tự sinh đồ……… 30

2.8 KHẢO SÁT CAO CHIẾT PHÂN ĐOẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG……… 31

2.9 PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT THU ĐƯỢC……… 32

2.10 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT THU ĐƯỢC……… 32

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 34

3.1 THU NHẬN CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH BẰNG DUNG MÔI ETHYL ACETATE……….35

3.2 ĐÁNH GIÁ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT……….35

3.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C albicans CỦA CAO ETHYL

3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C albicans……… 41

3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C albicans CỦA CÁC HỢP CHẤT THU NHẬN ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TỰ SINH ĐỒ……… 44

3.8 SẮC KÍ CỘT CAO CHIẾT ………44

3.9 KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CAO ES - EA1……….47

3.10 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT ES08 ……….50

DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 3.1 Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn có trong cao chiết 35

Bảng 3.2 Hàm lượng thu nhận các cao phân đoạn của cao ethyl acetate 37

Bảng 3.3 Kết quả thử khả năng kháng C albicans của cao phân đoạn 39

Bảng 3.4 Kết quả MIC cao ethyl acetate 41

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát cao ES - EA1.2.2.2 49

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ 13C và 1H của ES08 và methylanthraquinone đo trong DMSO-d6 51

1,3,8-trihydroxy-6-Biểu đồ 3.1 So sánh kết quả kháng C albicans của các phân đoạn 43

DANH MỤC VIẾT TẮT

MRSA Staphylococcus aureus kháng methicillin

SKLM Sắc ký lớp mỏng (TLC)

DMSO Dimethyl sulfoxide

MIC Minimum Inhibitory Concentration

MHA Mueller Hinton Agar

TSA Trypticase Soya Agar

SDA Sabouraud Dextrose Agar

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình cây sâm đại hành 6

Hình 1.2 Công thức hóa học của eleutherol và methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester 7

anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-Hình 1.3 Công thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, 8-O-D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B, eleuthoside C, elecanacin và hongconin 8

eleutherinol-Hình 1.4 eleutherinol-Hình vi thể C albicans 12

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23

Hình 2.2 Sơ đồ chiết cao ethyl acetate 25

Hình 2.3 Sơ đồ tách các phân đoạn của cao ethyl acetate 28

Hình 3.1 Thiết bị máy cô quay 35

Hình 3.2 Cao ethyl acetate 35

Hình 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng C albicans của phân đoạn ethyl acetate 36

Hình 3.4 Kết quả MIC kháng C albicans cao ethyl acetate 38

Hình 3.11 Kết quả kháng vi nấm C albicans bằng phương pháp tự sinh đồ 44

Hình 3.12 Sắc kí bản mỏng phân đoạn thu được từ hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate (95:5) 45

Hình 3.13 Sắc kí bản mỏng phân đoạn thu được từ hệ dung môi n-hexane: ethyl

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, vấn đề sức khỏe ngày càng được quan tâm đặc biệt

là trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, vi nấm gây ra C albicans là

mầm bệnh đa kháng thuốc mới được tìm thấy ở các vị trí giải phẫu của người khỏe mạnh, gây nhiễm trùng toàn thân và bề mặt trong điều kiện môi trường tối ưu

(Federico và cs., 2001) C albicans là một trong những vi nấm gây bệnh nguy hiểm

nhất ở người, chiếm 6,8% các bệnh gây nhiễm trùng ở những bệnh nhân bị ức chế

miễn dịch (Mohamed và cs., 2015) Ở hệ tiêu hóa và miệng, C albicans chiếm khoảng 40-60% ở người lớn khỏe mạnh (Odds, 1988) C albicans là tác nhân gây

bệnh ở da, móng và niêm mạc

Vi nấm có thể xâm nhập vào máu và các cơ quan gây nhiễm khuẩn huyết và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm (Maheshwari và cs., 2010) Nấm gây bệnh ngày càng trở thành một vấn đề lớn và khó kiểm soát, làm phá vỡ hệ vi sinh vật, giảm khả năng miễn dịch (Sirirak và cs., 2011)

Hiện nay, với sự phát triển của y học, thực vật được xem là nguồn thảo dược thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, ít tác dụng phụ và ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs., 2002) Chiết xuất các thành phần có trong thực vật và chế phẩm thảo dược có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm có ý nghĩa lớn trong các phương pháp điều trị (Sasidharan và cs., 2011) Các loài thực vật này dễ tìm trong tự nhiên do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Đỗ Tất Lợi, 2006)

Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một dược liệu phổ biến ở

Việt Nam, có nhiều tác dụng dược lý trong đó có điều trị mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, vảy nến Nghiên cứu này đánh giá hoạt tính kháng vi nấm gây bệnh của cao chiết từ củ sâm đại hành (Insanua và cs., 2014) Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, sâm đại hành được sử dụng làm thuốc chống ung thư trong y học dân gian, tăng huyết áp, giảm cholesterol, điều trị các bệnh về da ở người (Padhi và cs., 2015)

Chiết xuất dichloromethane từ củ của Eleutherine bulbosa (Miller) cho thấy hoạt động kháng nấm Cladosporium sphaerospermum mạnh (Alves và cs., 2003)

Cao chiết bằng ethanol của củ Eleutherine americana có khả năng kháng với tất cả

6 chủng Gram dương thử nghiệm (đường kính vòng kháng khuẩn từ 13-20 mm),

kháng 1 trong 7 Gram âm thử nghiệm và các chủng nấm Aspergillus niger,

Rhizopus spp., Penicillium spp., tuy nhiên không kháng lại các chủng nấm da

(Ifesan và cs., 2010).

Keuk-Jun và cộng sự (2008), đã nghiên cứu tác dụng chống nấm của các hạt nano-bạc Cho thấy các hạt nano-bạc có tác dụng chống nấm, làm tan máu chống lại hồng cầu của người Sử dụng dòng chảy tế bào học để phân tích, lượng glucose được giải phóng và sự thay đổi của màng động lực học 1,6-diphenyl-1,3,5-

hexatriene (DPH) như một đầu dò plasma, được thực hiện dựa trên vi nấm C

albicans (Keuk-Jun và cs., 2008)

Theo nghiên cứu của Wahyuni và cộng sự (2016), chiết xuất của Eleutherine

palmifolia từ dung môi ethanol 70% và nước có tác dụng ức chế C albicans Hoạt

tính kháng nấm được thực hiện bằng phương pháp giếng thạch và cho kết quả khả năng ức chế của mỗi chiết xuất là 65,44% và 54,78% (Wahyuni và cs., 2016).

Mặc dù, sâm đại hành đã được sử dụng trong y học cổ truyền từ rất lâu nhưng hiện nay trong nước các nghiên cứu, bài báo khoa học về khả năng chữa bệnh trong các bộ phận của cây sâm đại hành còn rất hạn chế cũng như còn khá ít các nghiên cứu về khả năng kháng nấm da của cao chiết sâm đại hành Do đó, tôi tiến hành

khảo sát khả năng kháng C albicans từ các phân đoạn của cao ethyl acetate đồng

thời phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học nói trên Chính vì thế,

chúng tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ KHẢ

NĂNG KHÁNG Candida albicans TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep.)”

Mục tiêu:

Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng Candida albicans của cao chiết ethyl acetate từ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)

Nội dung:

− Thu nhận cao chiết sâm đại hành bằng dung môi ethyl acetate

− Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết

− Điều chế các phân đoạn cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc kí cột

− Khảo sát khả năng kháng C albicans của các phân đoạn cao ethyl acetate

− Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với C albicans

− Khảo sát khả năng kháng C albicans của các hợp chất thu nhận được bằng

phương pháp tự sinh đồ

− Khảo sát cao phân đoạn bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC)

− Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng C albicans

PHẦN 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla

Hình 1.1 Cây sâm đại hành

(Eleutherine subaphylla Gagnep.)

(https://amp.thaythuoccuaban.com/vithuoc/samdaihanh.htm)

Tên khoa học: Eleutherine subaphylla Gagnep

Tên đồng nghĩa: Eleutherine bulbosa (Mill.) Urban, E longifolia Gagnep

Còn gọi là: tỏi lào, sâm cau, sâm đại hành, hành lào (Hòa Bình), tỏi mọi, kiệu đỏ, cỏ nhọt (Lào), phong nhan, hom búa lượt (Thái)

Người ta dùng củ tươi hay phơi hoặc sấy khô của cây sâm đại hành làm thuốc

với tên khoa học Bul-bus Eleutherine subaphylla (Đỗ Tất Lợi, 2006)

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Sâm đại hành là một loại cây cỏ sống lâu năm, cao từ 30-60 cm, dò (củ) hình trứng dài 4-5 cm, đường kính 2-3 cm giống như củ hành nhưng dài hơn, ngoài phủ vảy màu đỏ nâu, phía trong màu nâu hồng đến đỏ nâu Lá hình mác, gân lá song song, chạy dọc, trong giống như lá cau non, củ lại có tác dụng bổ cho nên có tên sâm cau (lá như lá cau, bổ như sâm), lá có thể dài 40-50 cm, rộng 3-5 cm Từ củ

mọc lên một cán mang hoa dài 30-40 cm, trên cán có một lá dài 15-25 cm, hoa mọc thành chùm 3 lá đài, 3 cánh tràng màu trắng hay vàng nhạt, 3 nhị màu vàng Bầu hình trứng, 3 cạnh 3 ngăn dài 1 mm, vòi dài 2,5 mm, trên xẻ thành 3 trông như 3 mũi dùi (Đỗ Tất Lợi, 2006)

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến

Sâm đại hành mọc hoang và được trồng lấy củ (dò) làm thuốc tại nhiều nơi như Hà Tây, Hòa Bình, Nghĩa Lộ, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Đà Nẵng, Hà Nội cũng có một số nhà trồng Trồng sâm đại hành rất đơn giản: chỉ việc dùng củ vùi xuống đất như trồng hành, trồng tỏi

Mùa hoa: tháng 4-6 Quả ít gặp

Khi thu hoạch, đào lấy củ về, rửa sạch, bóc lớp vỏ bên ngoài, thái mỏng dùng tươi hoặc phơi hay sấy khô, rồi để nguyên hay tán bột mà dùng Nó có vị đắng, mùi hơi hắc (Đỗ Tất Lợi, 2006)

Hình 1.2 Công thức hóa học của eleutherol và 4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester

anthracene-9,10-dione-1,5-diol-Dựa theo thành phần hóa học đã được nghiên cứu của cây Eleutherine bulbosa

Mill Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn (1973) đã tiến hành nghiên cứu củ sâm đại hành đã chiết và xác định được 4 chất là eleutherin C16H16O4 độ chảy 175o, izoeleutherin C16H16O4 độ chảy 177o, eleutherola C14H12O4 độ chảy 202-203o và một chất chưa xác định được đặt tên là Ex Sắc kí lớp mỏng của dịch chiết còn cho biết có 16 vết trong đó 9 vết màu vàng đậm nhạt khác nhau, 6 vết phát quang lơ và

một vết màu hồng nhạt Cả 3 hoạt chất đều có tác dụng kháng sinh đối với chủng S

aureus (Lê Văn Hồng, Nguyễn Văn Đàn., 1973)

Theo một công bố mới và đầy đủ nhất năm 2010 về thành phần hóa học của cây sâm đại hành, 4 hợp chất polyketit mới được phân lập gồm (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside và isoeleuthoside C (dihydroisoeleutherin-5-O-D-gentiobioside) cùng với các chất đã được phân lập trước đó gồm eleutherin, isoeleutherin, eleutherinol, eleutherol, eleuthoside B (eleutherol-4-O-D-gentiobioside), eleuthoside C (dihydroeleutherin-5-O-Dgentiobioside), elecanacin và hongconin (4-oxodihydroisoeleutherin)

Hình 1.3 Công thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B,

eleuthoside C, elecanacin và hongconin

1.1.5 Tác dụng dược lý

Tác dụng kháng sinh: dịch chiết sâm đại hành tẩm giấy có đường kính 10 mm

đặt trên thạch có cấy vi khuẩn có tác dụng hạn chế sinh sản của vi khuẩn D

pneumoniae, S hemopyticus, Staphylococcus spp Tác dụng yếu hơn đối với Shigella flexneri, Shiga spp., Bacillus mycoides, Bacillus anthracis Không có tác

dụng đối với E coli

Tác dụng chống viêm: làm giảm phản ứng phù thực nghiệm trên chân chuột (thí nghiệm so sánh với hydrocortisone thấy gần tương tự)

Sâm đại hành còn được một số nước trên thế giới sử dụng làm thuốc diệt giun sán, thuốc chữa các bệnh về kinh nguyệt, các bệnh rối loạn hay nhiễm khuẩn đường ruột và làm thuốc chống sinh sản quá nhanh và đẻ non (Paramapojna và cs., 2008)

đắp lên vết cắn của cá độc, để nhổ gai ở chân, và đắp vào vết đốt của sâu bọ, vết thương, nhọt Rễ củ nướng, giã nát, xát vào bụng chữa đau bụng

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SÂM ĐẠI HÀNH

1.2.1 Trên thế giới

Alves và cộng sự (2003) đã nghiên cứu một loại nấm mới naphthoquinone từ

Eleutherine tubosa Kết quả đã cho thấy chiết xuất dichloromethane được chiết từ

các phần rễ của Eleutherine bulbosa cho thấy hoạt động mạnh mẽ trong hoạt tính sinh học trực tiếp với nấm Cladosporium sphaerospermum Khả năng này sử dụng

các phân đoạn chiết xuất và cho phép cô lập bốn hợp chất Các naphthoquinone eleutherinone mới và các hợp chất đã biết trước đây được phân lập từ loài này, eleutherine, isoeleutherine và eleutherol Tất cả các hợp chất quinonoid cho thấy hoạt tính kháng nấm mạnh trong việc xác định hoạt tính, trong khi eleutherol không hoạt động (Alves và cs., 2003)

Năm 2009, Ifesan và cộng sự đã nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn của sâm

đại hành Qua kết quả cho thấy, hoạt tính ức chế S aureus, MRSA và có sản sinh

thêm một số hoạt tính chống oxy hoá (Ifesan và cs., 2009) Năm 2010, Ifesan và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất thô hoạt tính kháng khuẩn có trong sâm đại hành

Qua nghiên cứu cho thấy, sâm đại hành có hoạt tính kháng khuẩn Aspergillus niger,

B cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus spizizenii, Candida utilis, C albican, Citrobacter (Ifesan và cs., 2010)

Ieyama và cộng sự (2011) đã nghiên cứu tách chiết chất có hoạt tính ức chế Glucosidase từ sâm đại hành Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính ức chế 50% của chất eleutherinoside A cao nhất so với eleuthoside B và eleutherol trong 3 hợp chất được chiết xuất từ cây sâm đại hành, ngay cả khi ở nồng độ 1mM, mở ra một hướng mới thay thế trong điều trị bệnh tiểu đường (Ieyama và cs., 2011)

α-Babula và cộng sự (2009) đã nghiên cứu E americana có chứa carotenoids và

polyphenol, đặc biệt là flavonoid có thể điều chế dưới dạng chất chống oxy hóa tự

nhiên ở dạng thuốc uống như vitamin, có chức năng chống ung thư cũng như chống oxy hóa (Babula và cs., 2009)

1.2.2 Tại Việt Nam

Năm 2010, Trương Minh Lương và cộng sự đã nghiên cứu thành công dẫn xuất amin và amit từ sâm đại hành Kết quả cho thấy, từ eleutherine đã tổng hợp được bốn hợp chất mới 6-aminoeleutherin và các amit N-thế Hợp chất 6-aminoeleutherin, 6-benzoamiteleutherin và 6-phtalamiteleutherin đã được nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm Hợp chất 6-benzoamiteleutherin có hoạt

tính kháng khuẩn với chủng B subtilis ở nồng độ IC50 64,0 (μg/mL) (Trương Minh Lương và cs., 2010)

Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu đã nghiên cứu về sự thuần chủng và tính kháng

chia làm 11 dòng, tính kháng khuẩn của các dòng trên vi khuẩn được thử nghiệm có

sự khác nhau, nhưng tất cả đều tác động rất tốt trên S aureus (MIC = 256-512 µg/mL), kế đến Streptococcus faecalis (MIC = 512-1024 µg/mL), yếu hơn trên P

aeruginosa và Aeromonas hydrophila (MIC = 2048-4096 µg/mL), kháng khuẩn yếu

nhất trên E coli và Salmonella spp (MIC = 4096 µg/mL) (Huỳnh Kim Diệu, 2011)

Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự (2013) đã nghiên cứu quy trình tách chiết

hợp chất eleutherin và isoeleutherin từ củ sâm đại hành (Eleutherine bulbosa), đánh

giá tác dụng kháng sinh của chúng trên động vật thực nghiệm Kết quả đã phân lập được 10 hợp chất sạch và xây dựng được quy trình phân lập hỗn hợp eleutherin và isoeleutherin quy mô pilot, đồng thời đánh giá được chế phẩm từ củ có tác dụng kháng khuẩn mạnh ở các mức nồng độ thấp trên những chủng vi khuẩn đã thử là tụ

cầu vàng (Staphylococcus aureus), Bacillus subtilis, Shigella flexneri DT 112,

Proteus mirabilis BV 108 và Bacillus pumilus (Nguyễn Thị Hồng Vân và cs.,

2013)

1.3 TỔNG QUAN VỀ VI NẤM C albicans

1.3.1 Vi nấm C albicans

C albicans là một loại nấm đa hình có thể phát triển thành nấm men hình

trứng, như các tế bào elipsoid kéo dài với sự co thắt tại vách ngăn (pseudohyphae)

hoặc là sợi nấm có vách song song (Berman và cs., 2002) C albican là tác nhân

gây bệnh ở da, móng, niêm mạc Vi nấm có thể xâm nhập vào máu và các cơ quan gây nhiễm khuẩn huyết và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm (Sudbery và cs., 2011)

C albicans là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm trùng bệnh viện, nó chiếm 15%

trong tất cả các trường hợp nhiễm trùng huyết và là nguyên nhân của 40% các ca nhiễm trùng máu trong môi trường lâm sàng (Nobile và cs., 2015)

Phân loại khoa học Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota Lớp : Saccharomycetes Bộ : Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae

Chi: Candida Loài: C albicans

Hình 1.4 Hình vi nấm C albicans

(https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=929)

Ở người khoẻ mạnh, nấm Candida tìm thấy được 30% ở miệng, 38% ở ruột,

39% ở âm đạo, 17% ở phế quản Trong các loại nấm phân lập được, hay gặp nhất

là loại C albicans, có thể gặp các loài khác như Candida tropicalis, Candida

parapsilopsis, Candida glabrata (Maheshwari, 2010)

Đa số trường hợp, Candida nhiễm trên miệng, da hoặc âm đạo Thường dùng kháng sinh để tiêu diệt một cách an toàn Candida spp cũng gây ra một số bệnh

nhiễm trùng cơ hội, vi nấm xâm nhập vào máu gây nhiễm trùng huyết hoặc lan tỏa

gây bệnh ở các cơ quan nội tạng Nấm Candida có ở khắp nơi, bất cứ lúc nào cũng

có thể theo thức ăn nhiễm vào đường ruột, song chỉ khi có điều kiện thuận lợi, sinh

sôi nảy nở nhiều mới gây bệnh Nhiễm nấm Candida đường ruột có các triệu chứng đặc hiệu Nếu triệu chứng lâm sàng rõ, kết quả xét nghiệm có nhiều nấm Candida

mới dùng thuốc kháng nấm (Maheshwari, 2010)

1.3.2 Tình hình nghiên cứu C albicans

1.3.2.1 Trên thế giới

Nhiễm nấm là nguyên nhân quan trọng gây ra các bệnh và tử vong ở bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch Bên cạnh đó, sự phát triển của các loại thuốc kháng nấm mới, sự gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi những loài nấm

men khác với C albicans và các báo cáo về khả năng kháng nấm đã làm tăng nhu

cầu thử nghiệm tính nhạy cảm kháng nấm in-vitro và được thể hiện qua các nghiên cứu của Chen và cộng sự (Chen và cs., 1996)

Năm 2000, Kim đã tách chất ức chế β-lactamase từ vi khuẩn sống trong mô

thực vật Tác giả đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô của 25 loài thực vật khác nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn Trong đó đã tìm ra được

10 chủng có hiệu lực cao và có khả năng chống lại hoạt động của nấm C albicans

(Kim và cs., 2000)

Dữ liệu mới nhất từ việc nhiễm nấm Candida trong năm khu vực của Tây Ban

Nha với tổng dân số hơn 7 triệu người, trong đó cho thấy một tỷ lệ hàng năm của

bệnh nhiễm nấm Candida là 10,7 trên 100.000 dân và 0,78 trên 1000 trường hợp

nhập viện Trong số này, 89% số ca bệnh là bệnh nhân điều trị nội trú và 38% có khối u ác tính Tổng cộng có 76% bệnh nhân có phẫu thuật thông ống tĩnh mạch trung tâm và 51% đã trải qua phẫu thuật trong vòng 3 tháng trước khi nhiễm nấm

Candida Tại Tây Ban Nha, 46% các trường hợp là do C albicans, và do Candida parapsilosis là thường gặp nhất chiếm khoảng 25% (Sinko và cs., 2012)

1.3.2.2 Tại Việt Nam

Tình hình nhiễm vi nấm trong nước tiểu từ đầu tháng 2 đến 15/6/2009 tại bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh: khảo sát 626 bệnh nhân nhập viện thì tỉ lệ ca cấy nấm dương tính ở các bệnh phẩm cấy nước tiểu là 3,67% (23/626) Trong đó

tỷ lệ giữa C albican và Candida tropicalis là tương đương 47,8%, các loài Candida sp khác chiếm rất ít: 4,4% (chỉ có 1 ca trong 23 ca dương tính) Có thể thấy bệnh do Candida spp gây ra ở đường niệu là khá phổ biến (Trần Phủ Mạnh Siêu và cs,

2004)

Bên cạnh đó, theo báo cáo nghiên cứu tình hình bệnh nấm ở da và cơ quan trên các bệnh nhân đến xét nghiệm nấm tại khoa Ký sinh trùng Bệnh viện trường Đại học Y Dược Huế từ tháng 8/2011 đến tháng 8/2012, 415 bệnh nhân được chẩn đoán theo dõi bệnh nấm ở da, tóc, móng dựa trên các triệu chứng lâm sàng và được chỉ định làm xét nghiệm trực tiếp trong môi trường KOH 20% tìm nấm cho thấy: tỷ lệ bệnh có tổn thương lâm sàng ở da, tóc và móng của các đối tượng nghi nhiễm nấm chung là 51,81% Các thể bệnh lâm sàng: nấm thân 33,02%, nấm bẹn 29,30%, nấm da bàn chân 6,05%, viêm quanh móng - móng 5,58%, chốc đầu 3,72%, nấm móng 3,72%, da bàn tay - viêm kẽ tay 3,72%, thể bệnh phối hợp 14,88% (Tôn Nữ Phương Anh và cs, 2012)

1.4 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT

1.4.1 Khái niệm

Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được tinh chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ cao dược liệu thực vật hay động vật với dung môi thực vật Các dược liệu khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp)

Cao dược liệu được chia thành ba loại:

Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trò dung môi chính Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 mL cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế

Cao đặc: là khối đặc Hàm lượng dung môi còn lại trong cao không quá 20% Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng Trong thực nghiệm việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn - lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method),…(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2 Kỹ thuật chiết (Maceration)

Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép không rỉ có nắp đậy Rót dung môi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Sau đó dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp tục rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý tránh nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Phương pháp làm ở nhiệt độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung môi và thời gian chiết (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.3 Phương pháp chiết lỏng - lỏng

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan vào nước hoặc loại có thể hỗn hợp được vào nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung

môi phân cực thí dụ như: n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol… với mỗi

loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.4.4 Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao dược liệu, thường phải tiến hành bốc hơi dung môi Có thể dùng nhiều thiết bị cô, sấy khác nhau, nhưng tốt nhất là tiến hành ở áp suất giảm và ở nhiệt độ cao cho sự phân hủy hoạt chất là tối thiểu (thường không quá 600C) Tránh cô hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ cao

Cao dược liệu phải đạt các chỉ tiêu chất lượng cao thuốc được quy định trong dược điển Việt Nam IV năm 2009:

- Cảm quan: cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định, có mùi, vị của dược liệu tương ứng,

- Độ tan: cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao

- Mất khối lượng do làm khô: thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%

- Các chỉ tiêu khác: độ nhiễm khuẩn, giới hạn thuốc bảo vệ thực vật, kim loại nặng, chất bảo quản, định tính, định lượng

Các chế phẩm có chứa các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật, động vật không thể xử lý theo quy trình làm giảm lượng vi khuẩn: tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 5x104 CFU/g (CFU/mL), nấm và mốc không quá 500

trong 1 g (mL), không được có Salmonella trong 10g (mL), mẫu không có E coli, P

aeruginosa, S aureus trong 1 g (mL), tổng số enterobacteria không quá 500 trong 1

g (mL)

1.4.5 Phương pháp sắc kí bản mỏng

Sắc kí bản mỏng còn được gọi là sắc kí phẳng (Planar Chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thụ, trong đó pha động là một dung môi hay hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như silica gel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này được tráng bằng một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic

Bình sắc kí: chậu, hũ hay lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, ví dụ như silica gel, alumin… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 microlit (1 μL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với các vận tốc khác nhau, đi phía sau mức của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.4.6 Phương pháp sắc kí cột

Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck pha thường Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Từ cao chiết có hoạt tính mạnh nhất tiến hành sắc kí cột pha thường, kết hợp với sắc kí bản mỏng (TLC) để chia ra nhiều phân đoạn nhỏ có hệ dung môi rửa giải khác nhau

- Chuẩn bị cột:

• Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô cột

• Cho một ít bông gòn ở đáy cột (ngay phía dưới vòi nhỏ giọt) để silica gel không chảy ra ngoài

• Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung môi ít phân cực và trộn đều

• Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung môi, mở cột cho dung môi nhỏ giọt để ổn định cột

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo

trên máy Avance 500, 1H - (500 MHz)và 13C - (125 MHz) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

PHẦN 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu củ cây sâm đại hành được thu mua ở Đồng Tháp được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh

- Vi nấm C albicans được cung cấp bởi Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ

2.2.2.3 Môi trường - hóa chất

Môi trường nutrient agar (NA), môi trường potato dextrose agar (PDA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA), cồn 70oC

- Dung môi để chiết cao từ bột củ sâm đại hành: Petroleum ether (60-90),

n-hexane, chloroform (CHCl3), ethanol và methanol

- Dung môi hòa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxide (DMSO) Ống mẫu Mc Farland 0,5:

- Dung dịch H2SO4 1% 9,95 mL - Dung dịch BaCl2 1% 0,05 mL

- Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1 - 1,5 x 108 vi khuẩn/mL

Bột dược liệu Chiết với các dung

Chạy cột sắc kí thu phân đoạn

Khảo sát khả năng

kháng C albicans của

các phân đoạn bằng phương pháp khuếch

C albicans

Sắc kí bản mỏng (TLC)

Khảo sát khả năng

kháng C albicans của

hợp chất thu được bằng phương pháp tự sinh đồ

2.4 THU NHẬN CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH BẰNG DUNG MÔI ETHYL ACETATE

Thừa kế quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi n-hexane từ công trình

nghiên cứu trước, tiếp tục thực hiện quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi ethyl acetate để thực hiện tiếp các thí nghiệm

Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:5, nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 72 giờ

theo tỉ lệ 1:10 và đem chiết lỏng - lỏng qua các hệ dung môi n-hexane, ethyl acetate

và nước Sau khi chiết lỏng - lỏng dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách phương pháp tương tự như trên Đem cân các cao phân đoạn này bằng cân phân tích (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức: H(%) = A/B x 100

Hình 2.2 Sơ đồ chiết cao sâm đại hành

2.5 XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT

Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn có trong cao thuốc theo dược điển Việt Nam IV

❖ Chuẩn bị mẫu

Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO theo tỉ lệ 1 mg/mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng

❖ Đếm tổng số nấm men - nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí

Phơi khô dưới nắng hoặc sấy 50oC/72

giờ Xử lý mẫu

Ngâm chiết với ethanol 96o

Chiết lỏng - lỏng với ethyl acetate Chiết lỏng - lỏng với

n-hexane

Bột dược liệu

Đối với mẫu đếm tổng số nấm men - nấm mốc: dùng môi trường Sabourard dextrose agar

Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng môi trường NA

Từ dung dịch mẫu thử 10-1, pha loãng bằng dung dịch NaCl 0.85% để được nồng độ pha loãng thấp hơn 10-2, 10-3,…

Đun chảy môi trường, để nguội khoảng 40-45oC Dùng pipet vô trùng hút vào mỗi đĩa petri 1 mL mẫu thử Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15-20 mL môi trường Sau đó, xoay đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để mẫu thử được trộn đều trong môi trường cấy

Để thạch đông tự nhiên, sau đó lật ngược đĩa lại và ủ trong tủ ấm 37oC/ 24-48 giờ đối với mẫu đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, 28-30oC/ 5 ngày đối với mẫu đếm tổng số nấm nem - nấm mốc

N: tổng số tế bào vi khuẩn trong 1g (mL) mẫu (CFU/g hay CFU/mL)

∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn

ni: số đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ i di: hệ số pha loãng thứ i

v: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa petri (mL)

2.6 ĐIỀU CHẾ CÁC PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ CỘT

Sắc kí cột (SKC) được tiến hành trên cột thủy tinh, tùy vào lượng cao và chất hấp thu mà chọn cột phù hợp, làm khô cột và cân silicagel cần dùng, pha dung môi giải ly

Nhồi một ít bông gòn dưới đáy cột để silica gel không chảy ra ngoài Sau đó, cho silica gel vào dung môi giải ly, rồi rót nhẹ vào cột Để một cốc thủy tinh nhỏ (50 mL) phía dưới cột, sau khi rót hết silica gel vào thì xả cột để cố định silica gel, rót thêm dung môi vào cột để ổn định hệ Với chất nhồi cột là silica gel pha thường Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Hòa mẫu vào dung môi chạy cột trong cốc thủy tinh lớn 500 mL sau đó dùng một lượng silica gel cho vào cốc thủy tinh để hấp thụ mẫu, trộn mẫu và silicagel cho đến khi được một hỗn hợp khô Cho hết hỗn hợp đó vào cột và rót dung môi giải ly vào Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu cho một ít bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định, tiếp tục châm dung môi giải ly vào (Trương Minh Lương và cs., 2009) Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng mẫu cần sắc kí (tính theo trọng lượng) Tuy nhiên, với những hỗn hợp các chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Các hệ dung môi được sử dụng để chạy cột dành cho cao ethyl acetate lần lượt

theo tỉ lệ là hexane : ethyl acetate (75 : 25), hexane : ethyl acetate (50 : 50), hexane : ethyl acetate (25 : 75), n-hexane : ethyl acetate (0 : 100) và ethyl acetate :

n-methanol (90: 10), tỉ lệ về thể tích Sau đó sẽ thu được 5 phân đoạn, mỗi hệ dung môi được sử dụng để chạy cột tương ứng với 1 phân đoạn: ES-EA1, ES-EA2, ES-EA3, ES-EA4, ES-EA5 Các phân đoạn sau khi thu được sẽ đem đi khảo sát khả

năng kháng C albicans Sau đó, lựa chọn phân đoạn có khả năng kháng C albicans

tốt nhất tiếp tục đem đi tiến hành chạy sắc kí cột để thu các hợp chất

Hình 2.3 Sơ đồ tách các phân đoạn từ cao ethyl acetate

2.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG C albicans CỦA CAO

CHIẾT

2.7.1 Khảo sát khả năng kháng C albicans của các cao chiết từ

sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Chuẩn bị huyền dịch nấm C albicans

+ Vi nấm C albicans được cung cấp bởi Khoa Dược, Đại học Y Dược

TP Hồ Chí Minh được cấy ria nấm trên môi trường thạch Sabouraud, ủ 37oC trong 48 giờ

+ Lấy khuẩn lạc riêng lẻ cấy vào Sabouraud lỏng, ủ 37oC trong 24 giờ + Đo OD600 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng 0,08 - 0,1 tương ứng với 0,5 McFarland, mật độ tế bào đạt 106 CFU/mL

Các bước thực hiện:

+ Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi nấm, dùng một que gòn vô trùng nhúng vào huyền dịch rồi lấy lên ép và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm

+ Trải đầy vi khuẩn từ que gòn lên mặt thạch Sabouraud đã hong khô trước đó Trải bằng cách cấy vạch que gòn lên mặt thạch, xong lại xoay ES - EA1

(3,2 g)

ES - EA2 (3,7 g)

ES - EA5 (18,5 g) ES - EA4

(16,9 g) ES - EA3

(7,6 g) Cao ethyl acetate

(58 g)

mặt thạch 60o rồi cấy vạch 1 lần nữa, tiếp tục như vậy để đảm bảo trải đầy được vi nấm lên mặt thạch

+ Hòa tan cao chiết với dimethyl sulfoxide (DMSO) theo tỉ lệ 1 : 5, hút 70 µL dịch chiết bơm vào lỗ 6 mm đã đục bằng dụng cụ vô trùng (trong đó có một giếng không bơm dịch chiết mà bơm dung môi DMSO làm giếng đối chứng)

+ Đặt đĩa petri vào tủ lạnh, để yên trong 15 phút cho huyền dịch khuếch tán vào lớp thạch và ủ ở 4oC

- Nguyên tắc: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory

Concentration – MIC) là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng nấm ở đó nấm không phát triển hoặc phát triển ít hơn 3 khuẩn lạc

- Mục đích: Nhằm xác định sự kìm hãm tăng trưởng của vi nấm thử

nghiệm khi được ủ chung với cao chiết, khảo sát trong 72 giờ (Espinel Ingroff và cs., 2002)