phân lập sàng lọc hoạt tính probiotic và khả năng kiểm soát sinh học vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng litopenaeus vannamei của các dòng vi khuẩn bacillus thu thập tại ao n

NGUYỄN VĂN MINH Học viên thực hiện: TRẦN HỒNG NGỌC HUYỀN Lớp: NN71 Ngày sinh: 19/09/1999 Nơi sinh: Lâm Đồng Tên đề tài: PHÂN LẬP, SÀNG LỌC HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH

THẺCHÂNTRẮNG(Litopenaeus vannamei)

CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨNBACILLUS

'AI

THẺCHÂNTRẮNG(Litopenaeus vannamei)

CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨNBACILLUS

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : TRẦN HỒNG NGỌC HUYỀN

Ngày sinh: 19/09/1999 Nơi sinh: Lâm Đồng

Chuyên ngành: Nông nghiệp – Môi trường Mã học viên : 1753010090 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN VĂN MINH

Học viên thực hiện: TRẦN HỒNG NGỌC HUYỀN Lớp: NN71

Ngày sinh: 19/09/1999 Nơi sinh: Lâm Đồng

Tên đề tài: PHÂN LẬP, SÀNG LỌC HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ KHẢ NĂNG KIỂM

SOÁT SINH HỌC Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN

BACILLUS THU THẬP TỪ MỘT SỐ AO NUÔI TÔM TẠI TỈNH TRÀ VINH

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

- Đồng ý cho sinh viên bảo vệ luận văn trước hội đồng báo cáo tốt nghiệp

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 21 tháng 01 năm 2022

Người nhận xét

Nguyễn Văn Minh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại công ty cổ phần Mỹ Lan đã để lại cho em nhiều bài học, kinh nghiệm quý giá về kiến thức cũng như con người ở nơi đây mà em sẽ không bao giờ quên

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Thanh Mỹ chủ tịch tập đoàn Mỹ Lan và trường đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện môi trường tốt nhất có thể để em có thể hoàn thành khoá luận tốt nghiệp

Tiếp theo, em xin cảm ơn tất cả quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho em những kiến thức quý giá Đặc biệt em xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh, cô Nguyễn Thị Tú Trinh đã hướng dẫn em hoàn thành thực tập một cách trọn vẹn

Cảm ơn các anh chị ở phòng thí nghiệm vi sinh ứng dụng, sinh học phân tử, các anh chị của công ty đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên em trong suốt những ngày tháng qua

Cuối cùng cảm ơn gia đình đã luôn ở bên lắng nghe, cổ vũ tinh thần con Cám ơn Thùy Linh, Bé Bổng những người bạn quý giá đã luôn đồng hành, hỗ trợ mình trên chặng đường này

Chúc tất cả mọi người nhiều điều tốt đẹp nhất, sức khỏe và thành công!

Trà Vinh, ngày 12 tháng 8 Năm 2021 Sinh viên

Trần Hồng Ngọc Huyền

1.2 Sơ lược về tôm Thẻ Chân Trắng 6

1.2.1 Sơ lược về tôm Thẻ Chân Trắng 6

1.2.2 Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm Thẻ Chân Trắng 7

1.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus 9

1.4 Đặc điểm sinh học của Vibrio 11

1.5.2 Chọn lọc vi sinh vật làm probiotic cho tôm 13

1.6 Tình hình nghiên cứu 14

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 15

1.7 Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự 15

1.7.1 Nguyên lý chung của PCR 15

1.7.2 Phần mềm phân tích trình tự DNA 16

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Địa điểm nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2.2 Môi trường – hóa chất 19

2.2.3 Thiết bị - dụng cụ 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu chính 20

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 20

2.3.2 Phân lập vi khuẩn Bacillus và làm thuần 22

2.3.3 Kiểm tra đặc tính sinh hóa 23

2.3.4 Sàng lọc Bacillus cereus 28

2.3.5 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 28

2.3.6 Khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus 29

2.3.7 Khảo sát khả năng chịu mặn 29

2.3.8 Khảo sát khả năng chịu pH 29

2.3.9 Khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 30

2.3.10 Định danh các dòng vi khuẩn đã chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA 30

2.3.11 Phương pháp xử lí số liệu 31

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả phân lập 33

3.2 Kiểm tra đặc tính sinh hóa 37

3.3 Đánh giá sơ bộ tính an toàn của chủng vi khuẩn phân lập được 38

3.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 38

3.5 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng phân lập được với Vibrio parahaemolyticus 40

3.6 Kết quả khả năng tương thích của hai chủng tuyển chọn 43

3.7 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn 44

3.8 Kết quả khảo sát khả năng chịu pH 47

3.9 Kết quả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AHPND

ĐC G (-) G (+) LB NA SNA TSB TSA mL µm BLAST

Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND - Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) Đối chứng

Vi khuẩn Gram dương Vi khuẩn Gram âm Luria - Bertani Nutrient Agar Salt nutrient agar Trypton soy broth Trypton soy agar mililit

microlit

Basic Local Alignment Search Tool

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được 32

Bảng 3.2 Các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được (%) 33

Bảng 3.3 Đặc điểm vi thể của vi khuẩn phân lập 35

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra sinh hóa 36

Bảng 3.5 Kết quả khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng phân lập 38

Bảng 3.6 Kết quả kháng Vibrio parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn 40

Bảng 3.7 Mật số vi khuẩn ở các nồng độ muối và thời gian khác nhau 43

Bảng 3.8 Mật số vi khuẩn ở các khoảng pH và thời gian khác nhau 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh Tôm Thẻ Chân Trắng (Hình chụp ngày 26/2/2021) 6

Hình 1.2 Dấu hiệu tôm bị bệnh hoại tử gan tụy (Bùi Quang Tề, 2016) 7

Hình 1.3 Bacillus subtilis spizenni tạo váng trên TSB (Hình chụp ngày 31/3/2021) 8

Hình 1.4 Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (nguồn Kozo Mkino et al., 2003) 11

Hình 2.1 Hình sơ đồ bố trí thí nghiệm 20

Hình 3.1 Hình thái một số khuẩn lạc đặc trưng phân lập trên môi trường LB agar 34

Hình 3.2 Khả năng phân giải enzyme protease, amylase, cellulase 38

Hình 3.3 Hình biểu đồ cột thể hiện đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng đã phân lập với Vibrio parahaemolyticus 41

Hình 3.4 Vòng đối kháng của các chủng vi khuẩn đã phân lập 41

Hình 3.5 Sự tương thích giữa hai chủng vi khuẩn R7 và A09 42

Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện khả năng chịu mặn của chủng R7 sau 96 giờ nuôi cấy 44

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện khả năng chịu mặn của chủng A09 sau 96 giờ nuôi cấy 45

Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện khả năng chịu pH của chủng R7 sau 96 giờ nuôi cấy 48

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện khả năng chịu pH của chủng A09 sau 96 giờ nuôi cấy 48

Hình 3.10 Kết quả blast trình tự chủng vi khuẩn R7 50

Hình 3.11 Kết quả Blast trình tự chủng vi khuẩn A09 51

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loài chủng R7 bằng phương pháp Neigbour-Joining 52

Hình 3.13 Cây phát sinh chủng loài chủng R7 bằng phương pháp Maximum Likelihook 53

Hình 3.14 Cây phát sinh chủng loài chủng A09 bằng phương pháp Neigbour-Joining 54

Hình 3.15 Cây phát sinh chủng loài chủng A09 bằng phương pháp Maximum Likelihook 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Với điều kiện tự nhiên thuận lợi, Việt Nam là một nước có tiềm năng lớn về nuôi trồng thủy sản Theo Tổng cục Thống kê, sản lượng nuôi trồng thủy sản hai tháng đầu năm 2021 đạt 600.5 nghìn tấn trong đó sản lượng tôm các loại đạt 80.4 nghìn tấn (Tổng cục thủy sản, 2021) Tuy nhiên, việc nuôi tôm vẫn gặp không ít khó khăn khi tôm rất dễ mắc các bệnh lý khác nhau Để tăng năng suất và chất lượng tôm người nông dân đã không ngừng tăng mật độ thả giống, sử dụng thuốc, hóa chất, đặc biệt là kháng sinh, dẫn đến kháng thuốc ở tôm và làm giảm sản lượng, phẩm chất của tôm Việc phòng trị bệnh không hợp lí đã làm xáo trộn môi trường sống, mất cân bằng sinh thái ở ao tôm tạo điều kiện gây bùng phát dịch bệnh làm ảnh hưởng đến sức khỏe của tôm và gây ô nhiễm môi trường Một trong những bệnh khó kiểm soát đó là hội chứng tôm chết sớm (EMS) hay còn gọi là hoại tử gan tụy Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome

(AHPNS) do chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra (Flegel et al., 2012 ) Theo báo cáo của Han và cộng sự (2015) đã xác định 7 chủng Vibrio parahaemolyticus

phân lập từ mẫu tôm bệnh hoại tử gan tụy ở Việt Nam kháng kháng sinh và đó là bằng chứng cho thấy loài vi khuẩn này có khả năng đề kháng kháng sinh rất nhanh, nguy cơ dẫn đến thất bại trong việc điều trị bệnh hoại tử gan tụy là rất cao Chủng vi khuẩn này xâm chiếm đường tiêu hóa của tôm và sinh ra độc tố gây phá hủy các mô và gây rối

loạn chức năng của gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm (Lightner et al., 2012; FAO,

2013) Độc tố PirABvp, tương đồng với độc tố tiêu diệt côn trùng (Pir) của

Phorotorhabdus, được chứng minh là yếu tố độc lực chính gây nên hội chứng gan tụy

cấp tính ở tôm Các gen tương ứng của chúng (được đặt tên là pirAvp và pirBvp) nằm

trên một plasmid có kích thước lớn hơn (69 - 70 kb) ở các chủng Vibrio

parahaemolytius gây bệnh gan tụy cấp (Han JE et al., 2015)

Bacillus spp là dòng trực khuẩn có dạng hình que, gram dương bắt màu tím khi nhuộm

gram và một số loài không gây độc cho người cùng động vật Chúng có khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, sinh kháng sinh hay các chất ức chế các loài

vi sinh vật khác mà ghi nhận nhiều nhất là khả năng đối kháng với Vibrio spp (Domrongpokkaphan et al., 2006; Ravi et al., 2007) Đã có rất nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng kiểm soát sinh học của các chủng Bacillus đối với Vibrio như Balcazar và Tyrone (2007) Chính vì vậy mà chi Bacillus được sử dụng nhiều để sản xuất chế

phẩm sinh học giúp các sản phẩm thủy sản vừa an toàn vừa không gây ảnh hưởng đến

sức khỏe con người đang được quan tâm (Moriarty et al., 1997; Verschuere et al.,

2000) Năm 2019 Werasan Kewcharoen cũng đã thử nghiệm sản xuất một số chế phẩm

sinh học từ Bacillus subtilis AQAHBS001 cho hiệu quả ức chế rộng rãi các chủng

Vibrio parahaemolytius sp., đã được đánh giá trên quy mô phòng thí nghiệm trong các

ứng dụng chế phẩm sinh học có thể hòa tan trong nước và thức ăn chăn nuôi Do đó đề

tài được thực hiện với mong muốn tìm ra được một số chủng Bacillus có khả năng đối kháng với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thể ứng dụng dùng làm

probiotic, vì vậy đề tài “PHÂN LẬP, SÀNG LỌC HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ

KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus

vannamei) CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN BACILLUS THU THẬP TỪ MỘT SỐ

AO NUÔI TÔM TẠI TỈNH TRÀ VINH” được thực hiện hi vọng góp phần đa dạng

hóa bộ sưu tập chủng vi khuẩn có lợi dành cho tôm

Sàng lọc Bacillus làm probiotic cho tôm Thẻ Chân Trắng

- Phân lập một số chủng Bacillus ở các ao nuôi Tôm tại Tỉnh Trà Vinh

- Sàng lọc Bacillus cereus

- Sàng lọc khả năng sinh enzyme protease, amylase, cellulase

- Sàng lọc khả năng kháng Vibrio parahemolyticus của chủng tiềm năng

- Khảo sát khả năng chịu mặn, chịu pH của chủng tiềm năng - Thử khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn tiềm năng

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về ngành nuôi tôm

1.1.1 Tình hình nuôi tôm

Trên thế giới, trước năm 2000, các nước ở khu vực Đông Nam Á nuôi tôm Thẻ Chân Trắng vẫn chưa phổ biến Năm 2003, các nước có sản lượng tôm nuôi lớn nhất thế giới (như Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia, Ấn Độ) đã phát triển mạnh đối với tôm Thẻ Chân Trắng Năm 2003, sản lượng tôm Thẻ Chân Trắng của Trung Quốc đạt 600 nghìn tấn (chiếm 76 % tổng sản lượng tôm nuôi tại nước này); đến năm 2008 tôm Thẻ Chân Trắng đạt sản lượng 1,2 triệu tấn (trong tổng số 1,6 triệu tấn tôm nuôi) Năm 2004, tôm Thẻ Chân Trắng dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi, đóng góp trên 50 % tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới Năm 2007, tôm Thẻ Chân Trắng chiếm 75 % tổng sản lượng tôm nuôi toàn cầu và là đối tượng nuôi chính ở 3 nước châu Á (Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia) Ba nước này cũng chính là những quốc gia dẫn đầu thế giới về nuôi tôm (Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013)

Ở Việt Nam, theo Tổng cục thủy sản tháng 11 năm 2020 về nuôi trồng thuỷ sản, diện tích tôm thả nuôi ước đạt 725.900 ha (Đạt 99,43 % so với kế hoạch năm 2020) Trong đó tôm Thẻ Chân Trắng là 109.093 ha (Đạt 99,1 % so với kế hoạch năm 2020).Cùng với sự gia tăng diên tích nuôi trồng thì gia tôm nguyên liệu tại các vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long tiếp tục ở mức cao Gía tôm Thẻ Chân Trắng tăng cụ thể tôm có kích cỡ 20 và 30 con/kg có giá là 206.000 đồng/kg và 169.000 đồng/kg (Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam, 2020)

Tại Trà Vinh, Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Trà Vinh, đến hết ngày 15/8/2018, toàn tỉnh đã thả nuôi 5,28 tỷ con tôm giống, tổng diện tích thả nuôi tôm mặn lợ trên toàn tỉnh Trà Vinh đạt 30.611 ha, tăng 4,9 % so với năm 2017 Sản lượng thu hoạch tôm nuôi mặn lợ ước đạt 36.010 tấn, tăng 23 % so với cùng kỳ Trong đó, sản lượng thu hoạch tôm Thẻ Chân Trắng đạt 28.075 tấn, tăng 30,4 % so với cùng kỳ Tuy nhiên trong tháng 7 và 8 năm 2018 do mưa nhiều dẫn đến môi trường ao nuôi biến động gây thiệt hại ở các xã nuôi tôm huyện Cầu Ngang, Duyên Hải, và thị xã

Duyên Hải ở giai đoạn 20 – 60 ngày tuổi tôm có dấu hiệu của bệnh đốm trắng, hoại tử gan tuỵ cấp (Tổng cục Thuỷ sản 2018)

1.1.2 Tình hình dịch bệnh tôm

Việc phát triển nghề nuôi tôm, nhất là các nước ở khu vực Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại trong nghề nuôi tôm là điều không tránh khỏi Tùy theo điều kiện canh tác mà dịch bệnh sẽ xuất hiện

Đến tháng 10/2019, diện tích tôm nuôi bị bệnh 56,45 ha, chiếm xấp xỉ 3% tổng diện tích thả nuôi tôm nước lợ, giảm hơn 10% so với diện tích tôm nuôi bị bệnh cùng kỳ năm 2018 Các loại bệnh xảy ra chủ yếu là hoại tử gan tụy cấp 29,3 ha đốm trắng 6,15 ha do môi trường 21 ha (Chi cục Thủy Sản, 2020) Hội chứng hoại tử gan tuỵ cấp tính gây chết tôm ở giai đoạn 15 - 40 ngày sau khi thả nuôi Tôm ngừng ăn, bơi chậm, vỏ mỏng, màu tôm nhợt nhạt Gan tuỵ có biểu hiện sưng, nhũn, teo (Bùi Quang Tề, 2006) Như vậy, về nuôi trồng thuỷ sản, tôm Thẻ Chân Trắng đang gặp khá nhiều khó khăn

1.2 Sơ lược về tôm Thẻ Chân Trắng

1.2.1 Sơ lược về tôm Thẻ Chân Trắng

Tên tiếng Anh: Tên khoa học: Tên thường gọi: Tên của FAO: Tên Việt Nam:

Giống: (Tôm he) Penaeus

Hình 1.1 Hình ảnh Tôm Thẻ Chân Trắng (Hình chụp ngày 26/2/2021)

Tôm Thẻ Chân Trắng (Litopenaeus vannamei) có nguồn gốc từ vùng biển xích

đạo Ðông Thái Bình Dương (biển phía Tây Mỹ La tinh), chúng phân bố chủ yếu ở ven biển Tây Thái Bình Dương, châu Mỹ, từ ven biển Mexico đến miền trung Pêru, nhiều nhất ở biển gần Ecuador Tôm thẻ Chân Trắng hiện nay có mặt hầu hết ở các khu vực ôn và nhiệt đới bao gồm Đài Loan, Trung Quốc và các nước ven biển thuộc khu vực Đông Nam Á.Tôm Thẻ Chân Trắng có thể sống ở độ sâu 7,2 m đáy bùn, nhiệt độ nước ổn định từ 25 - 32°C, độ mặn từ 28- 34 ‰, pH từ 7,7 - 8,3 giai đoạn tôm con sống ở

vùng cửa sông, giai đoạn trưởng thành sống ở biển sâu (Nguyễn Trọng Nho, 2006)

1.2.2 Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm Thẻ Chân Trắng

Theo Lightner et al., (2012) bệnh hoại tử gan tụy trên tôm lần đầu tiên phát hiện

vào năm 2009 gọi là “Hội chứng tôm chết sớm - EMS (Early Mortality Syndrome)” Năm 2011, một tên mới được đặt ra dựa trên mô tả bệnh tích cấp tính, gọi là “Hội chứng hoại tử cấp” (AHPNS – Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) Năm 2013, tên gọi “Bệnh hoại tử gan tụy cấp” (AHPND - Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) được dùng khi đã xác định rõ tác nhân gây bệnh Bệnh gây ra nhiều tác hại nghiêm trọng trên tôm Thẻ Chân Trắng Bệnh AHPND ban đầu phân loại không rõ

nguyên nhân song kể từ đầu năm 2013, phòng nghiên cứu Bệnh học Thủy sản Trường

đại học Arizona (UAZ-APL) tìm ra nguyên nhân gây bệnh AHPND là Vibrio

parahaemolyticus phân lập tại Việt Nam và Me-xi-co đều cho kết quả cùng một nhân

tố gây bệnh Chủng vi khuẩn này xâm chiếm đường tiêu hóa của tôm và sinh ra độc tố gây phá hủy các mô và gây rối loạn chức năng của gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm

(Lightner et al., 2012; FAO, 2013) Độc tố PirABvp, tương đồng với độc tố tiêu diệt

côn trùng (Pir) của Phorotorhabdus, được chứng minh là yếu tố độc lực chính gây nên

hội chứng gan tụy cấp tính ở tôm Các gen tương ứng của chúng (được đặt tên là pirAvp

và pirBvp) nằm trên một plasmid có kích thước lớn hơn (69 - 70 kb) ở các chủng Vibrio

parahaemolytius gây bệnh gan tụy cấp (Han JE et al., 2015)

Một số triệu chứng dễ nhận thấy bệnh hoại tử gan tụy cấp có thể quan sát bằng mắt thường như gan tụy teo, dai, có màu nhợt nhạt như trắng vàng hoặc vàng nhạt, có những đốm màu đen hoặc sọc đen Vỏ tôm mềm, ruột rỗng mất chức năng, có tế bào nhân lớn bất thường, biểu bì của ống thận bị bong tróc Bệnh chỉ lây nhiễm qua đường

tiêu hóa của tôm (Loc Tran et al., 2013) Tôm mắc bệnh sẽ bỏ ăn, lờ đờ, tấp mé và tỉ lệ chết cao sau 10 ngày thả giống (Lightner et al., 2012)

Hình 1.2 Dấu hiệu tôm bị bệnh hoại tử gan tụy (Bùi Quang Tề, 2016)

Hình 1.3 Bacillus subtilis spizenni tạo váng trên TSB (Hình chụp ngày

31/3/2021)

1.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus

Chi Bacillus là một chi lớn rất phổ biến và đa dạng về loài Đặc điểm chung của

chi này là những vi khuẩn có hình que, bắt màu tím khi nhuộm Gram, có bào tử, hình

thái đa dạng (Trần Linh Thước, 2002) Chi Bacillus thường phân bố nhiều trong tự nhiên như đất, nước, nội sinh trong thực vật, cỏ khô hoặc rơm rạ Bacillus spp., thuộc

vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi từ 5 - 50°C, tối ưu 35 - 40°C Tăng trưởng thích

hợp ở pH từ 4,5 - 9,3 Bacillus spp., là một loài dễ mọc, thích nghi được trên các loại

môi trường nuôi cấy có thành phần dinh dưỡng cơ bản trên môi trường LB agar, NA, TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì Trên canh LB, TSB đục, tạo váng, sau cặn lợn cợn Tạo dung huyết máu thạch (Trần Linh Thước, 2002)

Phân loại khoa học

Loài: Bacillus spp.,

Việc phân loại ban đầu dựa vào đặc điểm nuôi cấy, như phát triển trong điều kiện hiếu khí và khả năng hình thành nội bào tử trong điều kiện bất lợi, đã xếp ra nhiều vi khuẩn có các đặc tính sinh lý khác nhau Do tính không đồng nhất về sinh lý học,

sinh thái học di truyền học làm cho việc phân loại Bacillus gặp khó khăn Bacillus có

khả năng tồn tại và chịu đựng ở các điều kiện môi trường khắc nghiệt trong một thời gian dài nên đa số các chủng phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn (Mai Nguyệt Thu Hồng, 2006), (Trần Linh Thước, 2002)

Một số loài Bacillus spp gây bệnh cho người và thủy sản như Bacillus anthracis và Bacillus cereus Bên cạnh đó vẫn có nhiều nhóm vi khuẩn có lợi, được sử dụng

nhiều trong sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, nông nghiệp và

công nghiệp Như là nhóm Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus

megarium,… được ứng dụng rộng rãi

⮚ Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được tìm thấy hầu hết ở môi trường tự nhiên Gram dương, hình

que, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn có khả năng di

động, hình thành bào tử hình bầu dục nhỏ kích thước từ 0,8 - 1,8 µm Bào tử Bacillus

subtilis chịu được pH thấp, có khả năng chịu nhiệt ở 100 C trong 180 phút, chịu ẩm,

tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng, bào tử có thể tồn tại vài năm đến vài chục năm (Ferdinand Cohn, 1872)

Bên cạnh đó Bacillus subtilis có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản

Theo nghiên cứu của Vaseeharan et al., 2003 đã phân lập được chủng Bacillus subtilis

BT 23 có khả năng khống chế các loài Vibrio spp đối với tôm sú ⮚ Bacillus licheniformis

Đây là loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dương, kích thước tế bào 3,2 - 3,9 µm x 0,9 - 1 µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc nối dài thành sợi, có khả năng sinh nội bào tử (Võ Hồng Phượng, 2018)

Theo nghiên cứu của Gopalarishnan et al., 2013, chủng Bacillus lichenformis (DAB1) có sự đối kháng với Vibrio parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn 14 – 16

mm sau 24 giờ ủ Tiếp đó, kết quả nghiên cứu của Võ Hồng Phượng (2018) đã phân

lập được chủng Bacillus licheniformis có khả năng đối kháng với Vibrio

parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch với đường kính vòng kháng

khuẩn là 15 mm

Từ những kết quả đó cho thấy tìm năng ứng dụng của loài Bacillus spp rất lớn

trong việc hỗ trợ phòng trừ bệnh cho thủy sản

⮚ Khả năng kháng khuẩn của Bacillus

Bacillus spp được phổ biến rộng là nhóm vi khuẩn được dụng nhiều do có các

đặc tính tốt: Khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh qua cơ chế miễn dịch,

cạnh tranh vị trí bám dính và sản sinh ra chất kháng khuẩn (bacteriocins) (Barbosa et

al., 2005)

Có nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng kiểm soát sinh học của chi Bacillus

spp rất khả quang Theo Nguyễn Văn Phúc 2014, đã phân lập được hai chủng có khả

năng kháng Vibrio parahaemolyticus và sinh ra enzyme mạnh được định danh thuộc

Bacillus subtilis BT23 có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp đối với tôm sú

Năm 2019, Nguyễn Văn Minh cùng với cộng sự đã phân lập được chủng Bacillus

polyfermenticus F27 từ giun quế có khả năng ức chế Vibrio parahemolyticus bảo vệ

tôm Thẻ Chân Trắng khi lây nhiễm nhân tạo

1.4 Đặc điểm sinh học của Vibrio

1.4.1 Hình dạng

Vibrio là vi sinh vật có hình que, ngắn, mảnh, bắt màu hồng khi nhuộm Gram

(Gram âm), kích thước khoảng 0,5 x 3 µm, hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy khi quan sát dưới kính hiển vi, qua nhiều lần cấy truyền thì dấu phẩy biến mất

Vibrio không sinh bào tử, không tạo giáp mô, di động nhờ một tiên mao ở đầu (Trần

Linh Thước, 2002)

Hình 1.4 Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (nguồn Kozo Mkino et al., 2003)

1.4.2 Đặc điểm nuôi cấy

Thuộc vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, sống được ở nhiệt độ 16 – 42 °C, nhiệt độ tối ưu là 37 °C Là vi khuẩn ưa kiềm, tăng trưởng nhanh trong môi trường có tính kiềm pH từ 8,5 – 9 Ưa môi trường có muối, từng loài khác nhau thích nghi với nồng độ muối khác nhau Trên môi trường chuyên biệt TCBS (Thiosulfat Citrat Bile Saccarose) tạo khóm màu vàng nếu sử dụng được đường sucrose, nếu không thì khuẩn mọc tạo khóm màu xanh.Trên môi trường Chromagar khóm vi khuẩn tròn màu tím, biên đều, phẳng hoặc lồi Chết nhanh trong môi trường acid, dễ bị tiêu diệt bởi các chất tẩy uế, không bền với nhiệt chỉ tồn tại 10 phút ở 55 °C (Trần Linh Thước, 2002)

1.4.3 Phân loại

Giới Ngành Lớp Bộ Họ Chi Loài

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Vibrionales

Vibrionaceae

Vibrio

Vibrio parahaemolyticus

Vibrio parahaemolyticus có khả năng gây dịch bệnh trên người và động vật thủy

sản như tôm, cua, nhuyễn thể đặc biệt là tôm rất nhạy cảm với vi khuẩn này trong tất cả

các giai đoạn phát triển (Lightner et al., 2012) Trên tôm, Vibrio parahaemolyticus thường được phân lập trong máu và gan tụy của tôm (Lighner et al., 1996) Các chủng

Vibrio parahaemolyticus cùng với Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus gây chết hàng loạt

trên tôm nuôi ở Thái Lan (Nash et al., 1992) có liên quan đến một số bệnh nhiễm khuẩn cục bộ và nhiễm khuẩn trên gan tụy trên tôm sú (Lightner et al., 1996) Ở loài

Vibrio parahaemolyticus tồn tại ba gen độc tố hemolysin chính gồm tdh và th mã hóa

cho hemolysin không bền nhiệt, cả hai gen này đều nằm trên operon độc tố Vp – toxRS,

được điều hòa bởi gen toxR có trình tự bảo tồn cao Độc tố hemolysin làm phân giải tế bào hồng cầu và giải phóng hemolysin (Hoàng Tấn Quảng, 2020)

1.5 Sơ lược về probiotic

1.5.1 Khái niệm và định nghĩa

Probiotic là những vi khuẩn có lợi có khả năng tăng cường sức khỏe và bảo vệ vật chủ và ổn định chức năng hệ tiêu hoá Những vi sinh vật này hiện diện tự nhiên trong ống tiêu hoá giúp tiêu hoá thức ăn thành những chất cơ thể dễ hấp thu như các acid amin,chất béo, hydrocacbon, vitamin,…

Các chế phẩm sinh học gọi chung là probiotic, là các vi sinh vật sống hữu dụng

gồm một số loài trong các chi (giống) Lactobacillus, Bacillus, Streptococcus,

Saccharomyces và Bacillus subtilis mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả

năng bám vào tế bào biểu mô ruột, tồn tại và tăng trưởng với vật chủ; đồng thời ngăn chặn hoặc giảm sự bám vào của các tác nhân gây bệnh, cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh, kích thích hệ miễn dịch cho vật chủ và ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh (Reid, 1999)

1.5.2 Chọn lọc vi sinh vật làm probiotic cho tôm

Khi chọn lọc chủng vi khuẩn làm probiotic cho tôm ngoài những lợi ích mà chúng mang lại cho sức khoẻ vật chủ phải đáp ứng được các tiêu chí như: Vi sinh vật phải đảm bảo an toàn, không có khả năng gây bệnh, gây độc đối với kí chủ, cây trồng và con người Chúng phải là những vi sinh vật tồn tại và phát triển được ở nơi sử dụng,

chẳng hạn như các probiotic dùng làm chế phẩm sinh học ở dạng phun xử lý phải sống được trong đất và nước ao nuôi, còn ở dạng thức ăn bổ sung thì bắt buộc phải sống được trong hệ tiêu hoá của vật chủ Các sinh vật probiotic phải gắn kết được với tế bào biểu mô của ruột hay màng nhầy ruột, có khả năng gắn vị trí mạnh hơn vi khuẩn gây bệnh, sinh các chất kháng khuẩn Chúng không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm, tồn tại và đi đến nơi tác động để thực hiện được chức năng của mình và phải có tính di truyền ổn định không mang các gen đề kháng kháng sinh (Klaenhammer T.R al

et., 1999), (Lee Yuan – Kun et al., 1999)

Sử dụng chế phẩm probiotic mang lại rất nhiều lợi ích cho vật nuôi như hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, cân bằng hệ vi sinh đường ruột bằng cách cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh (Kabir, 2009), do đó giảm chi phí trong phòng bệnh và tăng năng suất cho vật nuôi (Reuter, 2001)

1.6 Tình hình nghiên cứu

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo Nguyễn Văn Phúc 2014, đã phân lập được hai chủng có khả năng kháng

Vibrio parahaemolyticus và sinh ra enzyme mạnh được định danh thuộc Bacillus subtilis BT23 có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp đối với tôm sú Kết quả

nghiên cứu Võ Hồng Phượng (2018) đã phân lập được chủng Bacillus licheniformis có khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán đĩa

thạch với đường kính vòng kháng khuẩn là 15 mm

Năm 2019, Nguyễn Văn Minh cùng với cộng sự đã phân lập được chủng

Bacillus polyfermenticus F27 từ giun quế có khả năng ức chế Vibrio parahemolyticus

bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch với đường kính lớn nhất là 18,50 mm và có

bảo vệ tôm Thẻ Chân Trắng khi lây nhiễm nhân tạo Từ đó cho thấy tiềm năng của chủng vi khuẩn này rất lớn, hầu hết sản phẩm probiotic được sử dụng ngày nay ở dạng

sinh bào tử đều thuộc chi Bacillus (Hong et al., 2005)

Tuy nhiên, kết quả kháng sinh đồ 47 chủng V parahaemolyticus (AHPND) trên

kháng sinh và 70% số chủng có hiện tượng đa kháng thuốc (Lê Hồng Phước et al.,

2017)

1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Kết quả nghiên cứu của Balcázar et al (2007), đã phân lập được B subtilis UTM 126 có hoạt động ức chế chống lại ba chủng Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus và Vibrio parahaemolyticus phân lập từ tôm bị bệnh với vòng kháng khuẩn khoảng 10

- 15 mm

Bên cạnh đó, B subtilis BT23 có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp đối với tôm sú (Verschuere et al., 2003) Trong số 80 chủng vi khuẩn phân lập từ tôm hoang dã, Vibrio P62, Vibrio P63 và Bacillus P64 cho thấy tác dụng ức chế chống lại

V harveyi (S2) lần lượt là 54 %, 19 % và 34 % Hơn nữa, Bacillus P64 thể hiện đặc

tính của một probiotic và hoạt tính kích thích miễn dịch, trong khi Vibrio P62 chỉ cho thấy tính chất probiotic tốt (Gullian et al., 2004) Bào tử Bacillus đã được sử dụng như là tác nhân sinh học để giảm sự phát triển của Vibrio trong các cơ sở nuôi tôm (Skjermo and Vadstein et al., 1999)

1.7 Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự

1.7.1 Nguyên lý chung của PCR

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA trên mạch khuôn từ một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của một đoạn DNA thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer): mồi xuôi (sense primer hay forward primer) và mồi ngược (antisense primer hay reverse primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của mồi chuyên biệt Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ (cycle) kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90 – 95 °C làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau và toàn bộ phản ứng enzyme dừng lại Đoạn DNA khuôn có các đoạn dài gồm nhiều nucleotide giống nhau, hoặc tỷ lệ G - C càng cao, có nhiệt độ biến tính (Tm) cao hơn Do vậy cần căn cứ đặc điểm của DNA khuôn để lựa chọn nhiệt độ biến tính phù hợp Thời gian biến tính kéo dài trong khoảng 15 giây đến 1 phút

Giai đoạn gắn mồi: bắt cặp ở nhiệt độ khoảng 40 – 70 °C, thấp hơn nhiệt độ Tm của mồi Nhiệt độ tối ưu thường nằm khoảng 50 – 65 °C Các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lí Chargaff Thời gian bắt cặp trong một phản ứng PCR thường kéo dài trong khoảng 15 giây – 1 phút

Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 72 °C thích hợp với điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lí Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymer hóa (polymerization) Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA Chu kỳ gồm ba bước này sẽ được lặp lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tùy vào ứng dụng chuyên biệt) Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72 °C trong 5 phút, sau đó cho ngừng hẳn bằng cách lưu trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 °C (tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Lê Huyền Ái Thuý, 2016)

1.7.2 Phần mềm phân tích trình tự DNA

Trong những năm gần đây lượng thông tin liên quan đến trình tự DNA được xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lý dưới dạng ngân hàng dữ liệu (EMBL ở Châu Âu, GenBank ở Mỹ), có thể dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thông tin trên internet BLAST là một trong những chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học BLAST cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein xem đoạn mà ta quan tâm có tương đồng với đoạn của sinh vật nào trong ngân hàng gen không,

khi được cung cấp một thư viện hay dữ liệu các chuỗi đó Để chạy BLAST cần đầu tư hai chuỗi: chuỗi đích và cơ sở dữ liệu chuỗi Chuỗi đích nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu (Lê Huyền Ái Thuý, 2016)

Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N, TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide-Nucleotide BLAST) cho phép so sánh cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Tháng 11/2021 đến tháng 6/2021

Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi Sinh của công ty Cổ Phần Mỹ Lan tỉnh Trà Vinh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ các mẫu nước ao tôm ở huyện

Duyên Hải tại tỉnh Trà Vinh

Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được cung cấp bởi phòng thí nghiệm

vi sinh công ty cổ phần Mỹ Lan

2.2.2 Môi trường – hóa chất

- Môi trường LB (Lysogeny Broth) - Môi trường NA ( Nutrient agar) - Cồn tuyệt đối, cồn 96°, cồn 70°

- Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm kết tinh (crytal violet), Lugol, Safranin O - Thuốc thử: Kowac’s, H2O2, Methy red, đỏ Congo

2.2.3 Thiết bị - dụng cụ

⮚ Thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2 - Nồi khử trùng nhiệt ướt - Cân kĩ thuật

- Kính hiển vi - Máy khuấy từ - Tủ sấy

- Lò vi sóng - Tủ ủ

⮚ Dụng cụ - Ống nghiệm - Bình bi - Đĩa petri

- Pipet (thủy tinh và micropipet) - Erlen

- Becher - Ống đong - Lame - Bình serum - Que cấy - Đũa thủy tinh

2.3 Phương pháp nghiên cứu chính

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, thí nghiệm được bố trí ở sơ đồ sau:

2.3.2 Phân lập vi khuẩn Bacillus và làm thuần

Mẫu nước ao và mẫu ruột tôm được thu nhận tại thị xã Duyên Hải tỉnh Trà Vinh Mẫu nước ao, các mẫu được loại bỏ tế bào sinh dưỡng, vi sinh vật không bền với nhiệt bằng cách gia nhiệt trong bể ổn nhiệt ở 80 °C trong 10 phút Pha loãng mẫu đến 10-2, hút 100 µl dịch gốc và dịch đã pha loãng trải trên môi trường LB - agar Ủ ở 37 °C trong 24 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus và tiến

hành làm thuần bằng cách cấy ria trên môi trường LB - agar đến khi quan sát thấy chỉ có một dạng khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng và màu sắc trên môi trường

- Thực hiện

Các bước thực hiện như sau:

+ Nhỏ giọt nước lên phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm và cố định mẫu

+ Nhỏ dung dịch Crystal violet lên toàn bộ mẫu Để từ 1 - 2 phút Rửa nước, thấm khô

+ Nhỏ dung dịch lugol trong 1 phút Rửa nước, thấm khô

+ Tẩy cồn 960 từ 15 – 30 giây, rửa nước thấm khô Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin O và để yên trong 30 giây Rửa với nước, thấm khô

- Đọc kết quả

Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím Tế bào vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng

Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu

2.3.3 Kiểm tra đặc tính sinh hóa (Phạm Văn Ty, 2016)

- Cách thực hiện

Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn trên đĩa thạch đã nuôi cấy, phết lên giấy tẩm thốc thử Đọc kết quả trog vòng 30 giây – 1 phút

- Đọc kết quả

Phản ứng oxydase dương (+): giấy tẩm thuốc thử chuyển sang màu tím đen Phản ứng oxidase âm (-): giấy tẩm thuốc thử vẫn giữ nguyên màu trắng đục

- Đọc kết qủa

Di động (+) vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu

Di động (-) vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy

⮚ Xác định khả năng sinh Indol

- Nguyên tắc

Vi sinh vật tiết enzyme Trytophanase, chuyển hóa Trytophan thành Indol Indol sẽ kết hợp với para – dimethylaminobenzaldehyd trong thuốc thử Kowac’s, tạo thành phức chất Rosindol màu đỏ

Một số loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme gelatinase ngoại bào thủy phân gelatin thành polypeptide và axit amin làm phá hủy đặc tính đông đặc của gelatin ngay khi ở nhiệt độ dưới 25 °C và hóa lỏng ở nhiệt độ trên 25 °C

⮚ Phản ứng Voges – Proskauer (VP)

- Nguyên tắc

Thử nghiệm VP dựa trên sự phát hiện acetoin, là sản phẩm biến dưỡng cuối cùng

từ glucose Vi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic Acid pyruvic tiếp tục chuyển hóa thành AMC (acetyl methyl carbinolverdine) AMC trong môi trường kiềm sẽ kết hợp với α - naphtol, NaOH và oxy trong không khí (lắc) tạo thành diacetyl Diacetyl kết hợp với nhân guanidine trong pepton tạo thành màu hồng đỏ

- Cách thực hiện:

Cấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lub ủ 37 °C trong 24 giờ Sau đó nhỏ trực tiếp 5 – 10 giọt NaOH 40 % hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó nhỏ tiếp 5 – 10 giọt thuốc thử α - naphtol Đọc kết quả từ 5 – 10 phút

- Đọc kết quả:

Dương tính (+): môi trường có màu hồng đỏ

Âm tính (-): môi trường có màu vàng cam hoặc nâu đất

⮚ Khả năng sử dụng Nitrat

- Nguyên tắc

Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng nguồn nitrate làm nguồn nhận hydro cơ chất trong quá trình hô hấp kị khí đồng thời sử dụng nitrat làm nguồn nito do có khả năng tổng hợp enzyme Nitratreductase Nitrat bị khử thành nitrit, tiếp tục khử thành NH3 hoặc N2

Cơ chế: Acid sulfanilic không màu trong Gress A sẽ kết hợp với nhóm NO2- tạo thành muối diazonium, acid sulfanilic bị diazo hóa

+ Trường hợp 1 (-): NO3- không chuyển thành NO2

-+ Trường hợp 2 (-+): NO3- chuyển thành NO2- rồi tiếp tục chuyển thành NH3

hay N2 nên thuốc thử Gress A và Gress B không phát hiện được

Tiếp tục cho bột kẽm vào phản ứng nếu xuất hiện màu đỏ thì âm tính, nếu không đổi màu là dương tính

⮚ Xác định khả năng sử dụng Citrat

- Nguyên tắc

Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh enzym citrat permease có khả năng sử dụng citrat trong môi trường có chứa Na.Citrat làm nguồn cacbon duy nhất Khi sử dụng citrat chúng giải phóng ra môi trường Na+ làm tăng pH của môi trường Đồng thời những vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat làm nguồn cacbon thì cũng có khả năng sử dụng muối amonium vô cơ NH4H2PO4 làm nguồn nito, giải phóng NH3 làm kiềm hóa môi trường, sự thay đổi Ph này được nhận biết nhờ chỉ thị màu Bromothymol blue có khoảng đổi pH từ 6 – 7,6 tương ứng với khoảng màu từ vàng - xanh lục – xanh dương

môi trường được vi sinh vật sử dụng oxi hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O để thu năng lượng Để đáp ứng nhu cầu năng lượng trong tăng trưởng vi sinh vật tiếp tục dị hóa peptone qua đó giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm Phần sâu trong môi trường có điều kiện oxi không đầy đủ, glucose lên men kị khí sinh các acid hữu cơ làm pH môi trường giảm Sử dụng cả glucose và lactose: sau 18 - 24 giờ toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cả hai loại đường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà chưa cần sử dụng đến peptone Khi thời gian nuôi cấy quá dài bề mặt môi trường sẽ trở nên kiêm do vi sinh vật sử dụng hết nguồn Carbon trong môi trường và phải sử dụng đến peptone Không sử dụng glucose và lactose: Bề mặt môi trường sẽ trở nên kiềm hóa do vi sinh vật biến dưỡng nguồn peptone chỉ trong điều kiện kị khí Khả năng sinh H2S vi sinh vật khử sufate có thể khử sodium thiosufate nhờ có enzyme thiosunfat reductase để giải phóng H2S, H2S phản ứng với Fe2+

của chỉ thị ferric amonium citrate tạo kết tủa màu đen FeS - Cách thực hiện

Dùng que cấy thẳng vi sinh vật vào môi trường KIA cấy thẳng sâu vào ống nghiệm, không chạm đáy, sau đó ria lên bề mặt thạch nghiêng, ủ 24 giờ ở 37 °C và đọc kết quả

Vi khuẩn được cấy trên môi trường MYP để loại bỏ chủng vi khuẩn Bacillus cereus Vi

khuẩn mọc trên môi trường này có kết tủa màu đỏ hồng có quầng kết tủa bao quanh và có hiện tượng làm tan máu trên môi trường thạch máu cừu (TCVN 7903:2008)

2.3.5 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào dựa trên phương pháp của Trần Thị Bích Quyên và cộng sự (2012) có hiệu chỉnh để phù hợp với điều kiện thí nghiệm như sau: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường TSB lỏng ở 37 °C trong 24 giờ, sau đó cấy nhỏ giọt lên đĩa môi trường NA có bổ sung từng loại cơ chất 1% tinh bột, 1 % casein, 1 % CMC tương ứng cho khảo sát sinh các enzyme amylase, protease, cellulase Ủ các đĩa khảo sát ở 30 °C trong 24 giờ và quan sát vòng phân giải trên đĩa

2.3.6 Khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus

Phương pháp khuếch tán giếng thạch: Trải dịch Vibrio parahaemolyticus (mật

độ 108

CFU/mL) lên đĩa môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl Các chủng vi

khuẩn Bacillus spp được nuôi cấy trong môi trường canh TSB sau 24 giờ được li

tâm 6000 rpm trong 15 phút Thu dịch nổi, hút 70 µl bổ sung vào giếng có đường

kính 6mm trên đĩa môi trường NA đã trải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Đo

đường kính vòng kháng khuẩn tạo thành sau 24 giờ ủ ở 30 oC Thí nghiệm được

thực hiện với 3 lần lặp lại (Chythanya et al., 2002)

2.3.7 Khảo sát khả năng chịu mặn

Chuẩn bị môi trường LB được bổ sung NaCl ở các nồng độ 1,2,3,4,5 % (w/v) Các chủng vi khuẩn thử nghiệm đã tuyển chọn được tăng sinh trong 10 mL môi trường LB ở 37 °C trong 24 giờ Sau 24 giờ tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật số vi khuẩn, điều chỉnh mật số về 108

tế bào/ mL Đem li tâm 2000 vòng/ phút để thu sinh khối vi khuẩn Hòa tan sinh khối bằng 1 mL môi trường LB được bổ sung các nồng độ muối khác nhau đã được chuẩn bị ở trên, sau đó chuyển dịch huyền phù vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường LB với thành phần muối tương ứng ủ lắc 37 °C trong 24 giờ Sau 24 giờ, tiến hành xác định mật số vi khuẩn trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp pha loãng mẫu và

đếm sống (Hoben and Somasegaran et al., 1982) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.8 Khảo sát khả năng chịu pH

Chuẩn bị môi trường LB được thay đổi pH về các mức 4, 5, 6, 7, 8, 9 Các chủng vi khuẩn thử nghiệm đã tuyển chọn được tăng sinh trong 10mL môi trường LB ở 37 oC trong 24 giờ Sau 24 giờ tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm để xác định mật số vi khuẩn, điều chỉnh mật số về 108 tế bào/ mL Đem li tâm 2000 vòng/ phút để thu sinh khối vi khuẩn Hòa tan sinh khối bằng 1 mL môi trường LB được điều chỉnh các mức pH khác nhau đã được chuẩn bị ở trên, sau đó chuyển dịch huyền phù vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10mL môi trường LB với pH tương ứng ủ lắc 37 oC trong 24 giờ Sau 24 giờ, tiến hành xác định mật số vi khuẩn trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp pha loãng mẫu và đếm sống (Hoben and Somasegaran, 1982) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.9 Khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn

Sử dụng phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc: Tăng sinh các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trường lỏng LB sau đó dùng tăm bông vô trùng cấy vi khuẩn theo đường vuông góc lên môi trường thạch NA để kiểm tra độ tương

thích giữa các chủng vi khuẩn (Chythanya et al., 2002)

2.3.10 Định danh các dòng vi khuẩn đã chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA

Xác định các dòng vi khuẩn phân lập có các đặc tính có lợi như khả năng sinh enzyme amylase, protease, cellulase, khả năng kháng khuẩn, chịu mặn, chịu pH bằng phương pháp giải trình tự vùng 16S (phương pháp Sanger - công ty trách nhiệm hữu hạn dịch vụ và thương mại Nam Khoa) Sau đó, trình tự các đoạn gen được so sánh với trình tự gen trên GenBank và định danh các dòng vi khuẩn bằng chương trình BLAST/NCBI

Dựng cây phả hệ bằng phần mềm Mega 6.0

Phương pháp BLAST (Basic Local Aligment Sequence Tool) định danh trên NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) với trình tự đã được giải ở các thông số sau: