nghiên cứu đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết dengue và chế tạo kháng nguyên ns1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút dengue bằng kỹ thuật elisa

ỉ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG ---*--- HOÀNG XUÂN CƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE

\ỉ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

-* -

HOÀNG XUÂN CƯỜNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG,

CẬN LÂM SÀNG NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE VÀ CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN NS1 TÁI TỔ HỢP GỘP 4 TÝP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ

KHÁNG VI RÚT DENGUE BẰNG KỸ THUẬT ELISA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

-* -

HOÀNG XUÂN CƯỜNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG,

CẬN LÂM SÀNG NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE VÀ CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN NS1 TÁI TỔ HỢP GỘP 4 TÝP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ

KHÁNG VI RÚT DENGUE BẰNG KỸ THUẬT ELISA

Chuyên ngành: Bệnh Truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới Mã số: 972 01 09

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Võ Thị Bích Thủy 2 TS Trần Tất Thắng

HÀ NỘI – 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi Một

phần số liệu sử dụng trong luận án thuộc đề tài nghiên cứu có tên “Nghiên

cứu chế tạo que thử sắc ký miễn dịch nano từ tính để phát hiện nhanh kháng nguyên NS1 của virut Dengue gây bệnh sốt xuất huyết trên địa bàn Hà Nội” Mã số: 01C-08/01-2020-3” Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của

tập thể mà tôi là Chủ nhiệm đề tài Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác./

Hà Nội, tháng 6 năm 2024 Tác giả

Hoàng Xuân Cường

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện quân y; Lãnh đạo, Chỉ huy Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương; cán bộ, nhân viên Phòng Khoa học và đào tạo, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương; Đảng ủy, Ban Giám đốc và cán bộ, nhân viên Khoa Truyền nhiễm, Khoa Vi sinh, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Phòng Khoa học Quân sự, Trung tâm đào tạo và huấn luyện Bệnh viện Quân y 175; Đảng ủy, Ban Giám đốc và cán bộ, nhân viên Khoa Truyền nhiễm, Khoa Vi sinh, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Ban Khoa học Quân sự Bệnh viện Quân y 103; Cán bộ, nhân viên Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam; Cấp ủy, Chỉ huy và cán bộ, nhân viên phòng Khoa học quân sự, Học viện Quân y; Đảng ủy, Ban Giám đốc và cán bộ, nhân viên Phân hiệu Phía Nam Học viện Quân y, đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thu thập số liệu, triển khai và hoàn thành số liệu luận án

Đặc biệt, Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy, Trưởng phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam; Trung tá PGS.TS Đỗ Như Bình, Phó Trưởng phòng Khoa học quân sự, Học viện Quân y, TS Trần Tất Thắng và PGS.TS Cao Bá Lợi, Trưởng phòng Khoa học và đào tạo, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, những người thầy cô đã tận tình, trực tiếp định hướng, chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án này

Em xin chân thành cảm ơn: Các thầy, cô, các GS, PGS, TS trong các Hội đồng đánh giá chất lượng luận án đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em sửa chữa và hoàn thiện luận án

Em xin gửi lời cảm ơn đến: PGS TS Hoàng Vũ Hùng – Nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Truyền nhiễm, Bệnh viện Quân y 103 và Trung tá TS Vũ Tùng Sơn, Phó Chủ nhiệm Khoa Dịch tễ học Quân sự, Học viện Quân y – là những người thầy đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án

Tôi xin cảm ơn chân thành tới Đề tài cấp Sở KH&CN Hà Nội “Nghiên

cứu chế tạo que thử sắc ký miễn dịch nano từ tính để phát hiện nhanh kháng nguyên NS1 của virut Dengue gây bệnh sốt xuất huyết trên địa bàn Hà Nội” Mã số: 01C-08/01-2020-3” đã tài trợ một phần kinh phí cho tôi thực

hiện luận án này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: Bạn bè, đồng chí, đồng đội, đồng nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều trong quá trình học tập Đặc biệt là Đại tá Lê Thế Hoạt (Cục Cán bộ, Tổng Cục Chính trị) – anh là người đầu tiên động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới Cha, Mẹ - người đã vất vả sinh thành và nuôi tôi khôn lớn để tôi có được kết quả như ngày hôm nay Cảm ơn toàn thể gia đình anh em, họ hàng đã luôn sát cánh, động viên, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn và truyền nhiệt huyết cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án; đặc biệt là vợ và các con tôi, là những người thân yêu nhất đã dành tất cả sự hy sinh chăm sóc, động viên, là động lực không nhỏ giúp tôi đạt được kết quả này

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 6 năm 2024 Tác giả

Hoàng Xuân Cường

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Phần viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AST Aspartate transaminase

thromboplastin time

Thời gian thromboplastin được hoạt hoá từng phần AIDS Acquired Immune Deficiency

BSA Bovine Serum Albumin Huyết thanh bò CRP C-reactive protein Protein phản ứng C

DNA Deoxyribonucleic Acid

ELISA Enzyme – linked Immunosorbent Assay

Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym

IFA Indirect Immunofluorescence Assay

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang

IPTG Isopropyl thiogalactopyranoside

β-D-1-Chất cảm ứng biểu hiện protein

LB Luria Bertani Broth Môi trường nuôi cấy vi

Phần viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

khuẩn

NS1 Nonstructural Protein 1 Protein không cấu trúc 1

PBS Phosphate – Buffered saline Dung dịch đệm

qRT-PCR

Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược định lượng

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh sốt xuất huyết Dengue 6

1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng sốt xuất huyết Dengue 7

1.2.1 Các triệu chứng lâm sàng thường gặp 7

1.2.2 Biểu hiện cận lâm sàng 12

1.3 Chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue 16

1.3.1 Diễn biến lâm sàng sốt xuất huyết Dengue 16

1.4.3 Cấu trúc của protein NS1 26

1.5 Sử dụng kháng nguyên trong chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue 27

1.5.1 Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp 27

1.5.2 Các kỹ thuật sử dụng kháng nguyên trong chẩn đoán 30

1.6 Tình hình ứng dụng kháng nguyên NS1 trong chẩn đoán xác định kháng thể IgM/IgG sốt xuất huyết Dengue và tiềm năng kết hợp NS1 và IgM trong chẩn đoán nhanh 33

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Mục tiêu 1 37

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 37

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.1.4 Nội dung nghiên cứu 38

2.1.5 Các tiểu chuẩn và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 38

2.2 Mục tiêu 2 43

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 43

2.2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 43

2.2.3 Thiết kế nghiên cứu 44

2.3 Các biến số trong nghiên cứu 56

2.4 Sai số trong nghiên cứu 60

2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 61

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 62

2.7 Sơ đồ nghiên cứu 63

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63

3.1.Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022 63

3.1.1.Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 63

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue643.1.3 Một số yếu tố liên quan với mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue 813.2 Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA 84

3.2.1 Thiết kế tạo kháng nguyên tái tổ hợp NS1 84

3.2.2 Tách dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp vi rút Dengue 1, 2, 3 và 4 trên vi khuẩn E.coli 90

3.2.3 Đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue của kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp bằng phương pháp ELISA 96Chương 4 BÀN LUẬN 1014.1 Đánh giá đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất

huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022 1014.1.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 1014.1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue 1024.2 Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá hiệu

quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA 1134.2.1 Về thiết kế kháng nguyên tái tổ hợp NS1 1134.2.2 Tách dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp vi rút Dengue 1, 2, 3 và 4 trên vi khuẩn E.coli 1164.2.3 Đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue của kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp bằng phương pháp ELISA 119KẾT LUẬN 125KIẾN NGHỊ 128TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI 129TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Số lượng axit amin và trọng lượng phân tử của các protein cấu trúc

và phi cấu trúc của vi rút Dengue 25

Bảng 2.1 Xây dựng đường chuẩn phát hiện màu braford 50

Bảng 2.2 Trình tự mồi khuếch đại các đoạn gen xác định týp huyết thanh của vi rút Dengue 56

Bảng 2.3 Các biến số trong nghiên cứu 56

Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi 63

Bảng 3.2 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, nghề nghiệp 64

Bảng 3.4 Số lượng triệu chứng cơ năng trên một người bệnh 66

Bảng 3.5 Tình trạng sốt ở đối tượng nghiên cứu trước khi vào viện 66

Bảng 3.6 Đặc điểm sốt từ khi khởi phát bệnh theo giới tính 67

Bảng 3.7 Đặc điểm sốt ở đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi 68

Bảng 3.8 Triệu chứng thực thể ở đối tượng nghiên cứu 69

Bảng 3.9 Đặc điểm xuất huyết theo giới tính 69

Bảng 3.10 Đặc điểm dạng xuất huyết theo nhóm tuổi 70

Bảng 3.11 Số lượng dạng xuất huyết kết hợp 71

Bảng 3.12 Đặc điểm tràn dịch trên siêu âm theo giới tính 71

Bảng 3.13 Đặc điểm tràn dịch trên siêu âm theo nhóm tuổi 72

Bảng 3.14 Xét nghiệm công thức máu theo giới tính 73

Bảng 3.15 Xét nghiệm chỉ số đông máu theo giới tính 74

Bảng 3.16 Xét nghiệm chỉ số đông máu theo nhóm tuổi 75

Bảng 3.17 Xét nghiệm chức năng gan theo giới tính 75

Bảng 3.18 Xét nghiệm chức năng gan theo nhóm tuổi 76

Bảng 3.19 Xét nghiệm điện giải đồ của đối tượng nghiên cứu 77

Bảng 3.20 Xét nghiệm sinh hóa khác của đối tượng nghiên cứu 78

Bảng 3.21 Mối liên quan giữa giới tính, tuổi, nghề nghiệp và mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue 81Bảng 3.22 Mối liên quan giữa số ngày mắc bệnh trước khi vào viện và mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue 81Bảng 3.23 Mối liên quan giữa tiền sử bệnh và mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue 82Bảng 3.24 Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số tiểu cầu 82Bảng 3.25 Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số Hematocrit 83Bảng 3.26 Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số Hemoglobin 83Bảng 3.27 Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số hồng cầu 83Bảng 3.28 Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số bạch cầu 84Bảng 3.29 Độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể kháng NS1 bằng rAgNS1-DENV1-4 98

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các giai đoạn lâm sàng của SXHD 18

Hình 1.2 Muỗi Ae aegypti – Trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết Dengue 22

Hình 1.3 Cấu trúc của hạt vi rút Dengue 23

Hình 1.4 Cấu trúc hệ gen và protein của vi rút Dengue 24

Hình 1.5 Cấu trúc 3D của dimer và hexamer NS1 DENV 27

Hình 1.6 Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp 29

Hình 2.1 Kít Dengue Duo phát hiện NS1và IgG/IgM của vi rút Dengue 41

Hình 2.2 Sơ đồ tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET-rNS1 ở tế bào E.coli DH5α 46

Hình 2.3 Sơ đồ tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pET22b+ và rNS1 ở tế bào E.coli BL21 47

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng miễn dịch ELISA gián tiếp 52

Hình 3.1 Tiền sử bệnh của đối tượng nghiên cứu 64

Hình 3.2 Mức độ sốt xuất huyết Dengue ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 79

Hình 3.4 Vị trí của 4 đoạn trình tự trên protein NS1 85

Hình 3.5 A: Cấu trúc mô phỏng của đoạn peptit 112-260 B 87

Hình 3.6 Kết quả docking giữa peptit 112-260 và kháng thể 1G5.3 A: 87

Hình 3.7 Kết quả docking giữa peptit 112-260 và kháng thể 2B 89

Hình 3.8 Sàng lọc tế bào E.coli BL21 sau biến nạp 90

Hình 3.9 Kết quả giải trình tự Sanger cho khuẩn lạc số 2 91

Hình 3.10 Kiểm tra sự biểu hiện của NS1 ở E coli BL21 trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau 92

Hình 3.11 Tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau 93

Hình 3.12 Tối ưu thời gian biểu hiện protein NS1 94

Hình 3.13 Phương trình đường chuẩn Bradford 95

Hình 3.14 Kết quả phản ứng Western blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 và kháng thể NS1 thương mại và kháng thể đơn dòng NS1 gộp 4 tự sản xuất 96

Hình 3.15 Tối ưu hóa ELISA gián tiếp sử dụng protein tái tổ hợp NS1 mang

các điểm epitop nhận biết bốn týp huyết thanh DENV1-4 97Hình 3.16 Kết quả ELISA xác định mẫu dương tính sốt xuất huyết Dengue trong 2 nhóm nghiên cứu Giá trị cut-off = 0,353 98Hình 3.17 Đường cong ROC đánh giá độ tin cậy của kháng nguyên tái tổ hợp NS1 trong xét nghiệm ELISA 99

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Dengue (DENV) gây ra Vi rút được truyền từ người sang người qua muỗi

Aedes spp Hiện nay, thế giới có hơn một phần ba dân số đang sống trong các

khu vực có nguy cơ lây nhiễm và SXHD đóng vai trò quan trọng trong gây bệnh và tử vong ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới [1], [2] Sốt xuất huyết Dengue đã trở thành một vấn đề sức khỏe toàn cầu nghiêm trọng Số ca nhiễm tăng lên 30 lần sau 50 năm và tỷ lệ tử vong chung khoảng 2,5% [3] Theo ước tính, có 390 triệu người bị ảnh hưởng bởi nhiễm vi rút Dengue với hơn 25.000 ca tử vong/năm trên toàn cầu, trong đó 96 triệu (67–136 triệu) có biểu hiện lâm sàng Khu vực Đông Nam Á trải qua dịch bệnh tái phát và mang tính chu kỳ sốt xuất huyết quanh năm Vị trí địa lý, thời gian cũng chỉ ra mức độ phổ biến của bệnh [4] Theo WHO, 10 trong số 11 quốc gia thành viên của Đông Nam Á là nơi lưu hành dịch SXHD Đặc biệt, Ấn Độ, Indonesia, Myanmar, Sri Lanka và Thái Lan nằm trong số 30 quốc gia có mức độ lưu hành cao nhất trên thế giới [5]

Tại Việt Nam, trước năm 2020, tình hình dịch SXHD diễn biến phức tạp theo chu kỳ 4 - 5 năm Năm 2016, cả nước có 109.399 trường hợp mắc SXHD tại 56 tỉnh thành phố, trong đó có 36 ca tử vong Năm 2019, có 335.056 ca, trong đó có 55 ca tử vong [6] Thống kê của Bộ Y tế cho thấy SXHD đứng thứ ba trong số các bệnh truyền nhiễm gây dịch của năm 2020, với 137.470 trường hợp mắc, 29 trường hợp tử vong [7] Năm 2022 cả nước ghi nhận 367.729 ca SXHD và 140 ca tử vong [8]; tính tới 17/12/2023, cả nước ghi nhận 166.619 ca nhiễm, trong đó có 42 ca tử vong [9]

Bệnh SXHD được gây ra bởi bốn týp huyết thanh là: DENV1, DENV2, DENV3 và DENV4 của vi rút Dengue, có sự lưu hành khác nhau trong các khu vực mà bệnh SXHD phổ biến [10] Bốn kiểu huyết thanh này có độ tương

đồng trong trình tự bộ gen từ 60 – 80%, chúng gây ra các bệnh có biểu hiện giống cúm hoặc nghiêm trọng hơn như xuất huyết dẫn đến sốc có thể gây tử vong [11] Bộ gen cấu trúc của vi rút Dengue mã hóa cho 3 protein cấu trúc (C, prM/M và E) và 7 protein phi cấu trúc (NS1, NS2A/B, NS3, NS4A/B và NS5) [12] Protein NS1 là protein phi cấu trúc duy nhất được phát hiện trong máu người bệnh SXHD trong giai đoạn cấp tính nhiễm trùng, thường là trước khi xuất hiện các triệu chứng Trong khi đó các protein khác chủ yếu ở nội bào hoặc liên kết với các hạt vi rút và thường không được giải phóng vào máu với số lượng có thể phát hiện được trong quá trình nhiễm trùng cấp tính Một yếu tố nữa cũng khiến NS1 trở thành mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học do khả năng tạo miễn dịch cao có thể phát hiện bằng các kháng thể đặc hiệu với độ nhạy và độ đặc hiệu tốt nhất Ngược lại, các protein khác được nhận định tạo ra các phản ứng miễn dịch kém hơn hoặc bị cô lập trong tế bào bị nhiễm bệnh hoặc các hạt vi rút khiến chúng khó được phát hiện trong máu [13]

Việc chẩn đoán phân biệt dựa trên các triệu chứng là một thách thức do các triệu chứng không đặc hiệu của bệnh sốt xuất huyết như sốt, đau nhức và mệt mỏi thường trùng lặp với các bệnh nhiễm trùng lưu hành khác Tỷ lệ tử vong liên quan đến sốt xuất huyết có thể giảm từ 20–30% trong các trường hợp nặng xuống dưới 1% nhờ chẩn đoán sớm, sử dụng thuốc hợp lý và chăm sóc hỗ trợ thích hợp [14] Các phương pháp truyền thống để chẩn đoán SXHD bao gồm sử dụng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) để phát hiện RNA của vi rút Dengue hoặc phân lập vi rút, và sau đó sử dụng xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) Cả hai phương pháp này đều hiệu quả trong năm ngày đầu tiên khi bị nhiễm mầm bệnh, nhưng độ nhạy của các xét nghiệm này giảm theo thời gian khi lượng vi rút trong máu giảm dần [15], [16] Hơn nữa, các phương pháp truyền thống này cần hệ thống phòng thí nghiệm chuyên sâu và kĩ thuật viên giàu kinh nghiệm để thực hiện nên khó triển khai rộng

rãi ra cộng đồng Trong số các protein tham gia cấu tạo hạt của vi rút Dengue và tham gia vào quá trình gây bệnh của của vi rút, protein NS1 là kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng nhất trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm vi rút, do vậy protein này thường được sử dụng như chỉ thị phân tử protein trong chẩn đoán sốt xuất huyết do nhiễm vi rút Dengue Một số xét nghiệm kháng nguyên NS1 khác cũng đã được báo cáo là có hiệu quả trong việc phát hiện vi rút Dengue trong quần thể Điều này đồng nghĩa với việc sử dụng xét nghiệm kháng nguyên NS1 không chỉ cải thiện khả năng chẩn đoán mà còn đóng vai trò quan trọng trong quản lý nguồn bệnh và giám sát véc tơ [17] Tuy nhiên, chưa có kháng nguyên NS1 gộp đủ cả 4 týp vi rút Dengue nào được sử dụng, điều này có thể bỏ sót một số trường hợp nhiễm vi rút Dengue Việc có thêm một phương pháp chẩn đoán SXHD vừa đảm bảo độ nhạy, độ

chính xác và tiện dụng là rất cần thiết, vì vậy đề tài “Nghiên cứu đặc điểm

lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA” được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022

2 Chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh sốt xuất huyết Dengue

1.1.1 Khái niệm

Sốt xuất huyết Dengue là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Dengue gây nên Vi rút truyền từ người bệnh sang người lành do muỗi đốt Muỗi

Aedes aegypti và Aedes albopictus là trung gian truyền bệnh chủ yếu [18]

Bệnh có đặc trưng bởi sốt, xuất huyết và thoát huyết tương có thể dẫn đến sốc

và tử vong nếu không được điều trị đúng và kịp thời [19]

1.1.2 Dịch tễ học

1.1.2.1 Trên thế giới

Sốt xuất huyết Dengue là bệnh truyền nhiễm cấp tính do muỗi có tốc độ lây truyền nhanh nhất thế giới, trong 50 năm qua diện tích vùng có dịch tăng lên 30 lần Các trường hợp được báo cáo cho WHO đã tăng từ 505.430 trường hợp vào năm 2000 lên 5,2 triệu vào năm 2019 Nghiên cứu cũng cho thấy ước tính có 390 triệu ca nhiễm SXHD mỗi năm, trong đó 96 triệu ca có biểu hiện lâm sàng [20] Hiện nay, vi rút Dengue lưu hành và gây dịch ở trên 100 quốc gia và vùng lãnh thổ, chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á Thái Bình Dương, Châu Phi, Châu Mỹ, Địa Trung Hải [21] Châu Á Thái Bình Dương là khu vực chịu ảnh hưởng của SXHD nhiều nhất, theo WHO, riêng tại khu vực này có khoảng 1,8 tỷ người sống trong vùng dịch tễ SXHD, tập trung nhiều tại vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương Từ năm 2001 đến 2008, 4 quốc gia có tỷ lệ mắc và tử vong do SXHD cao nhất khu vực Tây Thái Bình Dương là Việt Nam, Campuchia, Malaysia và Philippines với 1.020.333 ca bệnh [19] Năm 2023, tại Bangladesh, Thái Lan, Campuchia, Lào và Philippin với số mắc (tử vong) lần lượt là 308.167 (1598), 136.655 (147), 35.390 (99); 32.109 (20); 195.603 (657) [5], [9]

1.1.2.2 Tại Việt Nam

Vụ dịch sốt xuất huyết Dengue lần đầu tiên xảy ra tại miền Bắc vào năm 1958 và ở khu vực phía Nam năm 1960 với 68 bệnh nhi đã được ghi nhận tử vong Những đợt bùng phát của SXHD được ghi nhận ở nước ta thường xảy ra với chu kì khoảng 10 năm (1987, 1998, 2009, 2017) Các ca mắc thường gia tăng vào mùa mưa - mùa sinh sản của muỗi truyền bệnh, miền Bắc vào khoảng tháng 4 đến tháng 11, miền Nam vào khoảng tháng 6 đến tháng 11 [22] Theo báo cáo của Bộ Y tế, số ca mắc SXHD ở khu vực Miền Nam cao nhất chiếm 57%, tiếp theo là miền Trung chiếm 33% và chủ yếu ở đối tượng từ 15 tuổi trở lên chiếm từ 57%-85% tuỳ theo khu vực Số mắc tích luỹ chỉ trong 8 tháng đầu năm 2020 của thành phố Hồ Chí Minh là 13.322 ca, chiếm tỷ lệ cao nhất cả nước, đứng thứ hai là Phú Yên với 4.898 ca Hà Nội ở vị trí thứ 10 với 1.993 ca Giám sát huyết thanh trong 8 tháng đầu năm 2020 cũng cho thấy týp DENV2 chiếm 51%, týp DENV1 chiếm 39% và týp DENV4 chiếm 10% [23] Trong giai đoạn từ 1998 - 2020 tại miền Bắc Việt Nam, trung bình mỗi năm ghi nhận 8.683 trường hợp mắc, trong đó chỉ có từ 1 - 2 trường hợp tử vong Năm 2017 có số mắc cao nhất trong lịch sử ghi nhận của hệ thống giám sát với 55.531 trường hợp mắc, 7 trường hợp tử vong Số mắc và tử vong do SXHD chủ yếu tại khu vực Đồng bằng sông Hồng (chiếm 72,6% ca mắc toàn khu vực) [24] Từ năm 2001 đến 2020, tại khu vực phía Nam, số mắc SXHD trung bình hàng năm là 64.153 ca SXHD/năm; số ca tử vong trung bình hàng năm trong giai đoạn này là 53 ca/năm và giảm dần qua các năm [25]

Hà Nội là một trong các địa phương lưu hành bệnh SXHD có diễn biến phức tạp do sự ảnh hưởng của các yếu tố nguy cơ bao gồm đô thị hóa, mật độ dân số cao, vệ sinh môi trường kém, thời tiết khắc nghiệt Vào các năm 2009, 2015 và 2017 đã ghi nhận các đợt dịch lớn tại miền Bắc trong đó 90% các trường hợp tập trung tại Hà Nội Týp DENV1 là căn nguyên chính gây ra các vụ dịch sốt xuất huyết tại Hà Nội vào các năm 2009 và 2015 Đợt dịch SXHD gần

nhất xảy ra tại Hà Nội vào năm 2017 đã có 37.651 ca mắc và 7 ca tử vong [26] Giai đoạn 1999-2020 có tổng số 1.844.407 trường hợp mắc SXHD, trong đó có 1.250 trường hợp tử vong Tỷ lệ mắc SXHD/100.000 dân tại Việt Nam có xu hướng tăng lên, mức tăng trung bình hằng năm trong giai đoạn1999-2020 bằng 9,6% [27] Năm 2020, cả nước có 133.321 trường hợp mắc SXHD, trong đó có 27 trường hợp tử vong [28] Năm 2022 cả nước ghi nhận 367.729 ca SXHD và 140 ca tử vong [8]; so với cùng kỳ năm 2021 (72.880 ca mắc và 27 ca tử vong), số ca mắc cộng dồn cao gấp 5 lần Tính tới 17/12/2023, cả nước ghi nhận 166.619 ca mắc SXHD, trong đó có 42 ca tử vong [9]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh sốt xuất huyết Dengue

Sau khi muỗi đốt, vi rút Dengue xâm nhập vào cơ thể, nằm trong các tế

bào đơn nhân lớn Các đại thực bào này tập trung nhiều ở hạch bạch huyết khu vực, trong các tế bào Kupffer, hạch bạch huyết và mảng Payer [19] Có bằng chứng cho thấy các tế bào đích bao gồm các tế bào lưới đuôi gai, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho, tế bào gan và các tế bào nội mô mạch máu Sự sao chép của vi rút dường như xảy ra ở các tế bào gai, bạch cầu đơn nhân, và có thể lưu hành các tế bào bạch huyết và các tế bào đích khác xảy ra thông qua các cơ chế miễn dịch trung gian liên quan đến kháng thể chéo và cytokine được giải phóng bởi tế bào đuôi gai, bạch cầu đơn nhân và tế bào nội mô mạch máu

Có bằng chứng về sự kích hoạt tế bào đồng thời cũng ức chế miễn dịch trong quá trình nhiễm trùng Việc kích hoạt các tế bào T của bộ nhớ dẫn đến các chuỗi cytokine gây viêm, bao gồm yếu tố hoại tử khối u, interleukin (IL-2, IL-6, IL-8) và các chất trung gian hóa học khác làm tăng tính thấm nội mô mạch máu hoặc gây chết tế bào thông qua cơ chế apoptosis [29] Tình trạng giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch gây thoát huyết tương, chủ yếu là albumin qua thành mạch đến khoang gian bào Khi thoát huyết tương nhiều dẫn đến hiện tượng giảm protein trong huyết thanh, cô đặc máu, giảm khối

lượng tuần hoàn và nặng hơn là tình trạng sốc Nếu kéo dài sẽ dẫn đến thiếu oxy ở các mô, toan chuyển hóa và tử vong nếu không xử trí kịp thời Sốc kéo dài cũng sẽ dẫn tới nguy cơ đông máu nội quản rải rác [19] Tình trạng rối loạn đông máu xảy ra do 3 yếu tố tác động, gồm giảm tiểu cầu, biến đổi thành mạch và rối loạn yếu tố đông máu Hai rối loạn sinh bệnh học thoát huyết tương và rối loạn đông máu tạo thành một vòng xoắn bệnh lý Tình trạng thoát huyết tương tạo điều kiện cho tình trạng rối loạn đông máu nặng hơn và ngược lại Một số giả thuyết giải thích bệnh cảnh sốt xuất huyết Dengue nặng:

- Giả thuyết của Hammon cho rằng cơ thể bị nhiễm đồng thời 2 týp

huyết thanh khác nhau của vi rút Dengue [19]

- Giả thuyết của Leon Rose, nhận thấy các týp vi rút có khác nhau về

độc lực như khả năng ly giải tế bào sinh miễn dịch, khả năng nhân lên Giả thuyết về độc lực của vi rút cũng phù hợp trong một số vụ dịch gây nên do vi rút Dengue týp huyết thanh 2, tỷ lệ bệnh nặng và tử vong cao [19]

- Giả thuyết tăng cường miễn dịch của Halstead, cho rằng đó là kết quả của đáp ứng nhớ lại, do bị tái nhiễm với 1 týp huyết thanh vi rút Dengue khác

Đáp ứng miễn dịch của cơ thể ở lần nhiễm thứ 2 mạnh hơn nhiều so với lần nhiễm đầu, dẫn đến tình trạng tăng tính thấm thành mạch [19]

1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng sốt xuất huyết Dengue

1.2.1 Các triệu chứng lâm sàng thường gặp

Bệnh cảnh lâm sàng của nhiễm vi rút Dengue có nhiều dạng khác nhau, từ không biểu hiện triệu chứng đến các biểu hiện của hội chứng nhiễm vi rút, biểu hiện của sốt Dengue, biểu hiện bệnh cảnh của SXHD hay cả của hội chứng sốc Dengue Theo khuyến cáo của WHO năm 2009, để có thể dễ dàng

hơn cho việc đánh giá và chăm sóc người bệnh (NB), nhiễm vi rút Dengue

được phân chia làm thể nghiêm trọng và không nghiêm trọng Thể nghiêm trọng của nhiễm vi rút Dengue hay còn gọi là hội chứng sốc SXHD Sốt xuất

huyết không nghiêm trọng bao gồm SXHD có thể xảy ra, SXHD không có dấu hiệu cảnh báo và SXHD có dấu hiệu cảnh báo [1]

Có 80% người nhiễm vi rút Dengue không có biểu hiện triệu chứng, hoặc chỉ biểu hiện sốt nhẹ Mức độ biểu hiện của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: týp vi rút Dengue gây bệnh, số lần bị nhiễm Dengue của NB, thứ tự nhiễm các týp, thời gian giữa các lần nhiễm của NB và phụ thuộc cả vào các yếu tố khác như tuổi, tình trạng miễn dịch, bệnh nền của NB Tình trạng của bệnh cũng có thể chuyển biến nhanh chóng sang thể SXHD nặng, với các triệu chứng lâm sàng từ dạng nhẹ như sốt cao, đau đầu, đau cơ, phát ban, đến dạng nặng như suy đa tạng hay tình trạng sốc giảm thể tích [30] Các triệu chứng lâm sàng thường gặp gồm: sốt cao, đau đầu và đau mắt, đau cơ và đau khớp, phát ban và xuất huyết

1.2.1.1 Sốt cao

Sốt trong bệnh SXHD là kết quả của phản ứng miễn dịch của cơ thể đối phó với tình trạng nhiễm vi rút Sốt trong SXHD có thể cao đến 40 độ C và thường diễn tiến trong vòng 2-7 ngày khi vào giai đoạn toàn phát [3] Sốt thường khởi phát đột ngột, chủ yếu là sốt nóng, ít khi có gai rét và rét run Sốt liên tục, thường không có cơn Một số trường hợp ít chịu tác dụng của thuốc hạ sốt thông thường [31]

Khi vi rút Dengue xâm nhập vào tuần hoàn máu, nó bắt đầu nhân lên và xâm nhiễm các tế bào khác nhau trong cơ thể, đặc biệt là tế bào Langerhans Hệ thống miễn dịch nhận ra sự hiện diện của vi rút và khởi động phản ứng miễn dịch để tiêu diệt chúng, kích thích tiết các phân tử tín hiệu gọi là cytokine, bao gồm interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) Những cytokine này tác động lên trung tâm điều nhiệt ở vùng dưới đồi ở não, kích thích sản xuất prostaglandin, đặc biệt là prostaglandin E2 (PGE2) Kết quả là cơ thể tăng mức độ chuyển hóa, dẫn tới tăng mức thân nhiệt và gây ra sốt Sốt đóng vai trò như một cơ chế phòng vệ chống lại quá trình nhiễm vi rút Nó tạo môi trường không thuận lợi cho sự

phát triển của vi rút vì nhiệt độ cao có thể làm tác động lên quá trình nhân lên của vi rút và thúc đẩy hoạt động của các tế bào miễn dịch [31]

1.2.1.2 Đau đầu và đau mắt

Các biểu hiện thần kinh thường hiếm và xuất hiện nhiều ở NB mắc sốt Dengue hơn so với NB SXHD hay thậm chí NB sốc Dengue Mất tỉnh táo, buồn ngủ và co giật là những biểu hiện phổ biến nhất, đi kèm với đau đầu và đau mắt [32] Đau đầu ở NB nhiễm vi rút Dengue đã được mô tả là đau nghiêm trọng, lan tỏa từ trước ra sau và ở sau mắt Trong các nghiên cứu (NC) trước đây, đau đầu được tìm thấy ở hơn 95% NB [33] Biểu hiện đau mắt ngày càng được quan tâm là một biến chứng quan trọng của bệnh SXHD, đặc biệt là ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới nơi bệnh này phổ biến Các biến đổi quan sát được trong quá trình khám cơ bản bao gồm xuất huyết điểm vàng, bệnh võng mạc và quanh nhú, đốm Roth, phù võng mạc lan tỏa, tế bào thủy tinh thể, mờ ranh giới đĩa thị, bong võng mạc huyết thanh, tràn dịch màng đệm và các bệnh lý khác như thoái hóa hoàng điểm mắt [32]

Cơ chế bệnh lý thần kinh của nhiễm DENV vẫn chưa được hiểu rõ Các yếu tố vi rút và vật chủ mang có thể đóng vai trò quan trọng trong các rối loạn thần kinh liên quan đến Dengue Trong bối cảnh này, nhiễm trùng trực tiếp của vi rút trong hệ thống thần kinh trung ương, phản ứng tự miễn, các rối loạn chuyển hóa và xuất huyết có thể liên quan đến cơ chế gây bệnh [34]

Dưới đây là một số cơ chế có thể đóng vai trò trong việc gây đau đầu trong nhiễm vi rút Dengue [34]:

- Tác động trực tiếp của vi rút: Vi rút Dengue có thể xâm nhập vào các mô và tế bào trong cơ thể, bao gồm cả não Việc tác động trực tiếp lên các tế bào trong não có thể gây kích thích và gây ra đau đầu

- Phản ứng viêm: Nhiễm vi rút Dengue kích thích hệ thống miễn dịch và gây ra phản ứng viêm trong cơ thể Các phân tử tín hiệu gọi là cytokine, bao gồm interleukin-1 (IL-1) và interleukin-6 (IL-6) được sản xuất và giải phóng

trong quá trình này Sự gia tăng của các cytokine này có thể gây viêm nhiễm và tăng cường hoạt động của các tế bào viêm, gây ra đau đầu

- Thay đổi mạch máu và áp lực trong não: Các mô và mạch máu trong não có thể bị ảnh hưởng trong quá trình nhiễm vi rút Dengue Thay đổi này có thể gây ra sự co bóp mạch máu và thay đổi áp lực trong các khu vực não, góp phần vào cảm giác đau đầu

- Rối loạn nước điện giải: nhiễm vi rút Dengue có thể gây ra mất nước và mất điện giải trong cơ thể Hiện tượng mất nước và mất cân bằng điện giải có thể gây ra tình trạng khó chịu và đau đầu

Điều quan trọng là đau đầu trong nhiễm vi rút Dengue thường là một triệu chứng phổ biến, nhưng không đặc trưng Nó có thể xuất hiện đồng thời với các triệu chứng khác như sốt, đau nhức cơ xương, và có thể không cần phải coi là một biểu hiện nghiêm trọng [30], [42]

1.2.1.3 Đau cơ

Đau cơ được đặc trưng bởi đau, nhạy cảm và sưng cơ nhẹ Đau cơ lan tỏa là một trong những triệu chứng đặc trưng của bệnh SXHD và được ghi nhận trong giai đoạn đầu của bệnh Đau cơ thường ảnh hưởng đến các cơ ở lưng và chi gần NB có thể gặp khó khăn khi đi lại do đau cơ [35]

Đau cơ đã được xuất hiện ở 93% NB SXHD Trong một nghiên cứu từ Peru, Bolivia, Ecuador và Paraguay, trong số 1.716 trường hợp SXHD được xác nhận, 90,1% (n = 1.546) NB bị đau cơ [36] Chứng đau cơ ít xảy ra hơn ở những du khách phương Tây trở về từ các quốc gia lưu hành SXHD Người bệnh là người lớn có nhiều khả năng bị đau cơ hơn trẻ em [37], [38]

Sinh bệnh học của đau cơ trong SXHD chưa được biết chính xác Giả thuyết đặt ra có thể liên quan đến sự xâm nhập lan tỏa của vi rút vào cơ (tại thời điểm nhiễm vi rút trong máu) và những thay đổi viêm sau đó trong cơ dẫn đến đau cơ [39]

1.2.1.4 Phát ban và xuất huyết

Trong báo cáo của Idota và CS năm 2006, trong 62 trường hợp SXHD được nhập cảnh vào Nhật Bản từ 1985 – 2000 đã được xét nghiệm tại bệnh viện Komagome (Tokyo, Nhật Bản) có đến 82% có biểu hiện lâm sàng phát ban trên da [40] Đây là một trong những biểu hiện đặc trưng nhất của sốt Dengue và SXHD

Trong sốt Dengue, phát ban đầu tiên là ban đỏ thoáng qua trên mặt, thường xảy ra ngay trước hoặc trong vòng 24-48 giờ đầu tiên kể từ khi xuất hiện các triệu chứng và được cho là kết quả của sự giãn nở mao mạch Phát ban thứ hai thường xảy ra 3-6 ngày sau khi bắt đầu sốt và nó được đặc trưng bởi ban dát sẩn hoặc phát ban dạng sởi không có triệu chứng Trong một số trường hợp, các tổn thương riêng lẻ có thể liên kết với nhau và được coi là ban đỏ hợp lưu toàn thân với chấm xuất huyết và các đảo tròn không có lông - “các đảo trắng trong biển đỏ” Một số NB chỉ phát ban ban đầu và hồi phục hoàn toàn, nhưng có những NB khác có thể tiến triển ban đỏ toàn thân [41] Phát ban toàn thân bắt đầu ở mu bàn tay và bàn chân rồi lan ra cánh tay, chân và thân mình và kéo dài trong vài ngày và giảm dần mà không bong vảy Trong một số trường hợp, sự kết thúc của cơn sốt cũng được đánh dấu bằng những thay đổi ở da dưới dạng ban xuất huyết trên bàn tay, cẳng tay, bàn chân, cẳng chân, và trong miệng [42]

Các biểu hiện xuất huyết thường xảy ra vào thời kỳ giảm sốt Biểu hiện là xuất huyết dưới da, niêm mạc hoặc xuất huyết tạng [43]

+ Xuất huyết dưới da: dưới dạng chấm, nốt hoặc mảng bầm tím Thường thấy ở lưng, bụng và mặt trong hai cánh tay, đùi, khi căng da không mất Đây là biểu hiện tương đối phổ biến ngay cả ở các trường hợp SXHD không nghiêm trọng; xảy ra trong khoảng một phần ba các trường hợp mắc bệnh

+ Xuất huyết niêm mạc: chảy máu mũi, lợi; nôn ra máu, đi ngoài phân đen hoặc máu; tiểu ra máu, xuất huyết âm đạo

+ Xuất huyết tạng: xuất huyết trong cơ, phổi, não, gan, lách thường là biểu hiện của bệnh nặng

1.2.1.5 Một số các triệu chứng khác

Các biểu hiện thoát huyết tương (do tăng tính thấm thành mạch), thường xuất hiện từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 của sốt, kéo dài 24 - 48 giờ Dấu hiệu của tình trạng thoát huyết tương trên lâm sàng có thể là tràn dịch trong các khoang cơ thể, như màng phổi, màng bụng, mô kẽ Thoát huyết tương nặng có thể dẫn đến tình trạng sốc giảm thể tích với các triệu chứng như vật vã, bứt rứt hoặc li bì, lạnh đầu chi, da lạnh ẩm, mạch nhanh nhỏ hoặc mất, huyết áp kẹt (hiệu số huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu ≤ 20 mmHg), tụt (dưới mức sinh lý lứa tuổi), không đo được, lượng nước tiểu ít Khoảng 50% số người bệnh có biểu hiện gan to, đôi khi có đau [43]

Biểu hiện suy tạng: một số trường hợp có suy tạng như viêm gan nặng, suy thận cấp, viêm não, viêm cơ tim Biểu hiện suy tạng có thể cũng gặp trong SXHD không sốc, không có dấu hiệu thoát huyết tương

1.2.2 Biểu hiện cận lâm sàng

- Tiểu cầu: Số lượng tiểu cầu giảm dưới 100.000 tế bào/mm3 trong giai đoạn toàn phát của bệnh Mức độ giảm tiểu cầu có tương quan với mức độ

nghiêm trọng của bệnh Người bệnh SXHD có hội chứng sốc thường có tình trạng giảm tiểu cầu nặng và có nguy cơ xuất huyết nặng

- Hematocrit: Tỷ lệ Hematocrit có thể bình thường hoặc tăng nhẹ trong những ngày đầu của bệnh, liên quan với tình trạng sốt cao, chán ăn, nôn mửa Từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 của bệnh, hiện tượng cô đặc máu có thể xảy ra khi Hematocrit tăng trên 20% so với giá trị ban đầu của người bệnh hoặc so với giá trị trung bình của dân số ở cùng lứa tuổi Vào ngày thứ 7 – 10 của bệnh, hematocrit trở về bình thường hoặc có thể thấp hơn do hiện tượng pha

loãng máu khi dịch được tái hấp thu trở lại lòng mạch

1.2.2.2 Xét nghiệm sinh hoá máu, nước tiểu

Những thay đổi chỉ số sinh hóa máu thường xuất hiện từ ngày thứ 3 của bệnh

- Enzym gan (AST và ALT): Phần lớn tăng gấp 2 đến 5 lần giới hạn trên của giá trị bình thường, khoảng 10% NB có mức tăng gấp 5 đến 15 lần giới hạn trên của mức bình thường Trong SXHD, AST thường tăng cao hơn so với ALT Tỉ lệ NB tăng enzym gan rõ rệt gặp ở những NB sốc SXHD nhiều hơn so với các trường hợp không phải SXHD nặng [45]

- Creatinin: Tình trạng tăng creatinin gợi ý bệnh cảnh suy thận cấp, nước tiểu đôi khi có albumin niệu nhẹ thoáng qua và có thể thấy hồng cầu trong một số trường hợp Ở NB SXHD nặng có tổn thương thận cấp, creatinine máu tăng  1,5-2 lần trị số bình thường hoặc độ thanh thải creatinine giảm  50% ở trẻ em; creatinine máu tăng  1,5 lần giá trị nền hoặc trong 7 ngày trước đó hoặc nước tiểu < 0,5 ml/kg/giờ trong 06 giờ ở người lớn [46]

Xét nghiệm điện giải đồ, đường máu và thăng bằng kiềm toan: Natri máu giảm, hạ đường huyết thường gặp trong SXHD và tình trạng toan chuyển hóa, tăng urê máu thường gặp trong sốc kéo dài [47]

Một số biến đổi bất thường khác như giảm albumin máu > 0,5 gm/dl, hoặc < 3,5 mg% là bằng chứng gián tiếp về rò rỉ huyết tương [48]

1.2.2.3 Đông máu cơ bản

Xét nghiệm các yếu tố đông máu có thể thấy tình trạng fibrinogen giảm dưới 2g/l, tỷ lệ prothrombin (PT) giảm dưới 70%, thời gian thromboplastin được hoạt hoá từng phần (APTT) kéo dài Thời gian APTT và tỷ lệ prothrombin là các xét nghiệm sàng lọc được sử dụng để đánh giá ban đầu về các rối loạn đông cầm máu Chức năng của gan bị tổn thương có thể là nguyên nhân ảnh hưởng đến dòng thác đông máu, dẫn đến giảm tổng hợp các yếu tố trong con đường đông máu nội sinh, các yếu tố phụ thuộc vitamin K như yếu tố V, VII, IX và X Mặt khác, nhiễm vi rút Dengue sản sinh chất hoạt hóa plasminogen mô cũng như IL-6 IL-6 có thể điều hòa tổng hợp yếu tố đông máu XII - yếu tố đầu tiên bắt đầu con đường đông máu nội sinh Ngoài ra, yếu tố antithrombin III và số lượng plasmin giảm đã được ghi nhận trong một số trường hợp, đồng thời với sự phát hiện các kháng thể tự miễn kháng antithrombin trong huyết thanh NB [49]

1.2.2.4 Các dấu hiệu về hình ảnh

Các hình ảnh trên siêu âm ở những NB có thoát huyết tương ở mức độ nặng bao gồm: dày thành túi mật, cổ trướng, tràn dịch màng phổi, tràn dịch màng tim, dịch quanh túi mật, gan lách to và hạch mạc treo Các triệu chứng này là bằng chứng của thoát huyết tương, xuất hiện thoáng qua, hết sau 7 ngày Trong nhiều NC, dày thành túi mật cũng liên quan đến giảm tiểu cầu mức độ nặng (< 50 G/l) Các có báo cáo chỉ ra rằng tỉ lệ NB bị tràn màng bụng là 41,7%, tỉ lệ phù nề quanh túi mật là 86,5%, tràn dịch màng phổi hai bên là 17,9% và tràn dịch màng phổi phải là 40,3% [50]

1.2.2.5 Các xét nghiệm chẩn đoán sự có mặt của vi rút Dengue

Chẩn đoán căn nguyên vi rút Dengue có thể sử dụng các phương pháp trực tiếp hay gián tiếp Phương pháp trực tiếp tức là phân lập được vi rút

Dengue trong máu NB ở giai đoạn sốt Phương pháp gián tiếp là tìm ra sự hiện diện của bộ gen vi rút hoặc kháng thể kháng vi rút Dengue trong máu NB Tùy theo sự đáp ứng của cơ thể trong các giai đoạn của quá trình bệnh lý để lấy máu xét nghiệm phù hợp

 Phân lập vi rút

+ Vi rút Dengue có thể phân lập được từ các bệnh phẩm máu và huyết thanh của NB Vi rút có nồng độ cao trong máu trong 4 ngày đầu của bệnh

+ Lấy bệnh phẩm gan, lách, hạch, tuyến ức để phân lập vi rút

 Huyết thanh chẩn đoán: tìm kháng thể IgM và IgG kháng vi rút

Dengue, cũng như phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (IHA) vẫn là các

phương pháp chẩn đoán huyết thanh học của SXHD được sử dụng thường xuyên nhất:

+ Phản ứng MAC-ELISA tìm kháng thể IgM kháng vi rút Dengue để chẩn đoán nhiễm vi rút Dengue cấp tính Xét nghiệm thường dương tính từ ngày

thứ 5, kể từ khi sốt MAC-ELISA là kỹ thuật được WHO công nhận là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán sinh học sốt xuất huyết [51]

+ Xét nghiệm nhanh: cho kết quả nhanh trong vòng 30 phút đến 3 giờ Tìm kháng thể IgM, IgG hoặc tìm kháng nguyên NS1

+ Phát hiện kháng nguyên: Đo lường bằng kỹ thuật ELISA phát hiện protein NS1 cho phép chẩn đoán sớm bệnh SXHD ở NB sơ nhiễm và tái nhiễm Trong chẩn đoán SXHD hiện nay thường dùng NS1 test do tính đặc hiệu cao, thời gian cho kết quả nhanh chỉ sau 15 – 30 phút, giúp cho chẩn đoán sớm SXHD [52]

+ Tìm kháng thể IgM từ ngày thứ 5 trở đi: Xét nghiệm định lượng kháng thể (tìm kháng thể IgM: xét nghiệm từ ngày thứ 5 của bệnh; tìm kháng thể IgG: lấy máu 2 lần cách nhau 1 tuần tìm động lực kháng thể);

Ngoài ra có một số phương pháp khác như phản ứng ức chế hồng cầu, phản ứng cố định bổ thể, phản ứng trung hòa; Một số phương pháp mới: Phát hiện bộ

gen vi rút có thể lấy mẫu từ sau khi sốt 5 ngày Bằng kỹ thuật khuếch đại đoạn gen sau khi sao chép ngược (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction = RT-PCR) được sử dụng rộng rãi hiện nay để phát hiện các gen vi rút trong mẫu huyết thanh giai đoạn cấp; mảnh lai ghép; hóa mô miễn dịch

1.3 Chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue

1.3.1 Diễn biến lâm sàng sốt xuất huyết Dengue (Hình 1.1)

Sốt xuất huyết Dengue có biểu hiện lâm sàng đa dạng, từ nhẹ đến nặng Bệnh thường khởi phát đột ngột và diễn biến qua 3 giai đoạn [18]:

a, Giai đoạn sốt:

- Lâm sàng: Sốt cao đột ngột, liên tục; nhức đầu, chán ăn, buồn nôn; da

xung huyết; đau cơ, đau khớp, nhức hai hố mắt; nghiệm pháp dây thắt dương tính; thường có chấm xuất huyết dưới da, chảy máu chân răng hoặc máu mũi

- Cận lâm sàng: Hematocrit (Hct) bình thường; số lượng tiểu cầu bình

thường hoặc giảm dần; số lượng bạch cầu thường giảm

b, Giai đoạn nguy hiểm

- Lâm sàng: Người bệnh có thể còn sốt hoặc đã giảm sốt; có thể có các

biểu hiện sau:

+ Đau bụng nhiều: đau bụng nhiều và liên tục hoặc tăng cảm giác đau nhất là ở vùng gan;

+ Vật vã, lừ đừ, li bì;

+ Gan to > 2 cm dưới bờ sườn, có thể đau; nôn ói;

+ Biểu hiện thoát huyết tương do tăng tính thấm thành mạch (thường kéo dài 24-48 giờ): Tràn dịch màng phổi, mô kẽ (có thể gây suy hô hấp), màng bụng, phù nề mi mắt; nếu thoát huyết tương nhiều sẽ dẫn đến sốc với các biểu hiện vật vã, bứt rứt hoặc li bì, lạnh đầu chi, mạch nhanh nhỏ, huyết áp kẹt (hiệu số huyết áp tối đa và tối thiểu ≤ 20mmHg hoặc tụt Huyết áp, không đo được huyết áp, mạch không bắt được, da lạnh, nổi vân tím (sốc nặng), tiểu ít

+ Xuất huyết: Xuất huyết dưới da (nốt xuất huyết rải rác hoặc chấm xuất huyết thường ở mặt trước hai cẳng chân và mặt trong hai cánh tay, bụng, đùi, mạn sườn hoặc mảng bầm tím); xuất huyết niêm mạc (chảy máu chân răng, chảy máu mũi, nôn ra máu, tiêu phân đen hoặc máu, xuất huyết âm đạo hoặc tiểu máu); xuất huyết nặng (chảy máu mũi nặng (cần nhét bấc hoặc gạc cầm máu), xuất huyết âm đạo nặng, xuất huyết trong cơ và phần mềm, xuất huyết đường tiêu hóa và nội tạng (phổi, não, gan, lách, thận), thường kèm theo tình trạng sốc, giảm tiểu cầu, thiếu oxy mô và toan chuyển hóa có thể dẫn đến suy đa phủ tạng và đông máu nội mạch nặng Xuất huyết nặng cũng có thể xảy ra ở người bệnh dùng các thuốc kháng viêm như acetylsalisilic acid (aspirin), ibuprofen hoặc dùng corticoid, tiền sử loét dạ dày-tá tràng, viêm gan mạn) + Một số trường hợp nặng có thể có biểu hiện suy tạng như tổn thương gan nặng/suy gan, thận, tim, phổi, não Những biểu hiện nặng này thường có thể xảy ra ở người bệnh có hoặc không có sốc do thoát huyết tương: Tổn thương gan nặng/suy gan cấp, enzyme gan ALT, ALT ≥ 10000 U/L; tổn thương/suy thận cấp; rối loạn tri giác (SXHD thể não); viêm cơ tim, suy tim hoặc suy chức năng các cơ quan khác

+ Trường hợp nặng có thể có rối loạn đông máu

+ Siêu âm hoặc X quang có thể phát hiện tràn dịch màng bụng, màng phổi

c, Giai đoạn hồi phục - Lâm sàng

+ Người bệnh hết sốt, toàn trạng tốt lên, thèm ăn, huyết động ổn định và tiểu nhiều

+ Có thể phát ban hồi phục hoặc ngứa ngoài da

+ Có thể có nhịp tim chậm, không đều

+ AST, ALT có khuynh hướng giảm

Hình 1.1 Các giai đoạn lâm sàng của SXHD [18]

- Lâm sàng: Sốt ≤ 7 ngày và có 2 trong các dấu hiệu sau:

+ Buồn nôn, nôn + Phát ban

+ Đau cơ, đau khớp, nhức hai hố mắt + Xuất huyết da hoặc dấu hiệu dây thắt (+)

- Cận lâm sàng:

+ Hematocrit bình thường hoặc tăng + Tiểu cầu bình thường hoặc giảm + Bạch cầu bình thường hoặc giảm

b, Chẩn đoán SXHD có dấu hiệu cảnh báo

- Lâm sàng: Bao gồm các triệu chứng lâm sàng của SXHD, kèm theo

một hoặc nhiều dấu hiệu cảnh báo sau: + Vật vã, lừ đừ, li bì

+ Đau bụng nhiều và liên tục hoặc tăng cảm giác đau vùng gan + Gan to > 2 cm dưới bờ sườn

+ Nôn ói nhiều ≥ 3 lần/1 giờ hoặc ≥ 4 lần/6 giờ

+ Xuất huyết niêm mạc: chảy máu chân răng, mũi, nôn ra máu, tiêu phân đen hoặc có máu, xuất huyết âm đạo hoặc tiểu máu

+ Tràn dịch màng phổi, màng bụng trên siêu âm hoặc Xquang

Người bệnh có dấu hiệu cảnh báo có thể tiến triển thành sốt xuất huyết Dengue nặng Vì vậy cần lập kế hoạch theo dõi ý thức, mạch, huyết áp, số lượng nước tiểu và làm lại xét nghiệm hematocrit, tiểu cầu để có chỉ định điều trị kịp thời [18]

c, Chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue nặng

- Sốt xuất huyết Dengue nặng là sốt xuất huyết có một hoặc nhiều biểu

+ Suy các tạng: Suy gan cấp (enzyme gan AST hoặc ALT > 1000 U/l); Thần kinh trung ương (Rối loạn tri giác); Suy thận cấp; Viêm cơ tim, suy tim, hoặc suy chức năng các cơ quan khác [18]

- Sốt xuất huyết có sốc:

+ Thường xảy ra vào ngày thứ 3-7 của bệnh, biểu hiện bằng các triệu chứng vật vã; bứt rứt hoặc li bì thậm chí hôn mê; lạnh đầu chi, da lạnh ẩm; mạnh nhanh nhỏ hoặc mất, huyết áp kẹt, tụt huyết áp hoặc không đo được; tiểu ít

+ Được chia làm 2 loại: SXHD có sốc (mạch nhanh nhỏ, huyết áp kẹt hoặc tụt, kèm theo các triệu chứng da lạnh, ẩm, bứt rứt hoặc vật vã li bì) và SXHD có sốc nặng (mạch khó bắt, huyết áp không đo được)

Bệnh SXHD có biểu hiện lâm sàng đa dạng, diễn biến nhanh chóng từ nhẹ đến nặng, việc phát hiện sớm bệnh và hiểu rõ những vấn đề lâm sàng trong từng giai đoạn của bệnh giúp chẩn đoán sớm, điều trị đúng và kịp thời, nhằm cứu sống người bệnh [18]

1.3.3 Chẩn đoán phân biệt [18]

- Sốt phát ban do vi rút - Tay chân miệng - Sốt mò

- Sốt rét

- Nhiễm khuẩn do liên cầu lợn, não mô cầu, vi khuẩn gram âm, …

- Sốc nhiễm khuẩn - Các bệnh máu

- Bệnh lý ổ bụng cấp, …

1.4 Vi rút Dengue

1.4.1 Vai trò gây bệnh

Vi rút Dengue thuộc nhóm Arbovirus, giống Flavivirus, có 68 thành

viên trong đó có 26 loài gây bệnh ở người [53] Vi rút Dengue có 4 týp huyết thanh: DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 Sau khi nhiễm một vi rút Dengue sẽ có phản ứng dương tính với týp huyết thanh đó nhưng không trung hòa hoàn toàn được các týp huyết thanh còn lại Như vậy, một người có thể bị SXHD nhiều lần [1], [54] Tại Việt Nam trong những năm qua có sự lưu hành của cả

4 týp huyết thanh vi rút Dengue, tuy nhiên phổ biến hơn cả là vi rút Dengue

týp huyết thanh 2 [19] Ở vùng dịch lưu hành nặng, tỷ lệ mắc bệnh của trẻ em thường cao hơn, còn ở vùng dịch lưu hành nhẹ, khả năng mắc của trẻ em và người lớn như nhau Người từng nhiễm vi rút Dengue hoặc đã mắc bệnh thường có miễn dịch lâu dài với vi rút cùng týp huyết thanh Tuy nhiên, nếu nhiễm lại một týp huyết thanh vi rút Dengue khác thường xuất hiện bệnh cảnh lâm sàng nặng hơn [54], [55], [56] Vi rút Dengue lan truyền từ người này

sang người khác qua trung gian truyền bệnh là muỗi vằn tức là Aedes aegypti, ngoài ra còn do Aedes albopictus [57] Muỗi Aedes là trung gian truyền bệnh

sốt xuất huyết Dengue, có thể bay trong bán kính 100 mét, khoảng bay của muỗi thường không vượt quá 300 mét từ ổ lăng quăng [58] Muỗi trưởng thành có thể di chuyển đến các nơi khác cùng với những phương tiện di chuyển của con người Do đó, giúp chúng có thể nhanh chóng lây lan dịch Nguy cơ lây truyền cho con người được coi là cao hơn ở những nơi có sự hiện

diện của Aedes aegypti trong khu vực của Aedes albopictus Điểm này được

minh chứng cho sự bùng nổ của bệnh sốt xuất huyết Dengue khi kết hợp

Aedes albopictus với Aedes aegypti Vòng đời của muỗi Aedes aegypti qua 4

giai đoạn Giai đoạn trứng từ 2 đến 3 ngày, lăng quăng từ 6 đến 8 ngày, nhộng từ 2 đến 3 ngày, muỗi trưởng thành từ 2 đến 3 ngày Nếu nhiệt độ khoảng 20oC và độ ẩm là 80% thì từ lúc trứng cho đến khi thành muỗi trưởng thành

mất từ 12 đến 17 ngày [59] Ở Việt Nam, 95% SXHD là do muỗi Aedes

aegypti truyền, do Aedes albopictus chỉ 5% Muỗi Aedes albopictus ít có vai

trò truyền bệnh do ít hút máu người hơn Aedes aegypti và có thể sống ngoài thiên nhiên, rừng núi hoặc xung quanh nhà [60] Muỗi Aedes aegypti cái hút

máu và truyền bệnh vào ban ngày, trong lúc con người đang thức và di chuyển nên muỗi thường phải hút máu nửa chừng sau đó hút máu tiếp người

khác, đó là lý do làm vi rút lây lan đến nhiều người Hơn nữa do muỗi Aedes

thích hút máu người vì thế chúng tập trung ở những nơi có mật độ dân số cao

Sau khi hút máu người, muỗi Aedes aegypti sẽ mang vi rút và truyền bệnh cho người khác Ấu trùng của Aedes aegypti phát triển rất tốt ở nhiệt độ 25-32°C

Mức độ phát triển của bệnh SXHD gia tăng cùng với số lượng ấu trùng SXHD lan truyền không phụ thuộc độ bay xa của muỗi và trong những thời điểm có dịch, muỗi theo phương tiện giao thông để di chuyển từ vùng này sang vùng khác và truyền vi rút cho người [58], [61]

Hình 1.2 Muỗi Ae aegypti – Trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết Dengue

Muỗi Aedes aegypti có màu đen sẫm, trên thân và chân có những đốm trắng

(Hình 1.2)

Muỗi Aedes aegypti phân bố khắp thế giới, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới Các giai đoạn chưa trưởng thành của muỗi đều diễn ra ở những nơi nước đọng, chủ yếu trong các bể chứa gần nhà [3], [62], [63]

1.4.2 Cấu trúc vi rút Dengue

Vi rút Dengue thuộc chi Flavivirus của họ Flaviviridae có cấu tạo dạng

hình cầu, đường kính khoảng 35-50nm, đối xứng khối Vỏ ngoài là lớp lipid kép chứa glycoprotein và protein có nguồn gốc từ màng lưới nội bào của tế bào chủ Protein capsid (cấu thành bởi 32 capsomer) bao quanh acid nucleic tạo thành nucleocapsid có đường kính 30nm; vi rút có 3 protein cấu trúc cùng

7 protein không cấu trúc (Hình 1.3) [64], [65]

Hình 1.3 Cấu trúc của hạt vi rút Dengue [64]

Hệ gen của vi rút Dengue chứa một sợi RNA đơn dương, kích thước khoảng 11 kb, với đầu 5’ vùng không dịch mã (5’- UTR) khoảng 100 bp, trong khi đầu 3’-UTR dài khoảng 450 bp (Hình 1.4) Giữa vùng không dịch mã ở hai đầu là một khung đọc mở (ORF- open reading frame) mã hóa một polyprotein gồm khoảng 3400 axit amin trong đó có 3 protein cấu trúc là protein C (protein capsid), protein M (protein màng), protein E (protein vỏ) và 7 protein phi cấu trúc (NS) Những protein này được tạo ra trong quá trình phân tách sau dịch mã bởi protease của vi rút và vật chủ và chúng đều có các vai trò khác nhau trong quá trình gây bệnh của của vi rút [64]

Vỏ bọc(C)

(lõi kỵnước)

Vỏ ngoài(E)

Protein màng (M)

(lõi kỵnước

) RNA

(lõi kỵnước)

Hình 1.4 Cấu trúc hệ gen và protein của vi rút Dengue [4]

Protein capsid có khối lượng khoảng 11 kDa nằm ở bên trong lớp lipid kép Vùng kỵ nước ở trung tâm của protein capsid có khả năng tương tác với màng tế bào và đóng vai trò trong quá trình lắp ráp vi rút Protein C chứa một vùng C-terminal tác động như một chuỗi tín hiệu cho sự chuyển đoạn của protein M vào khoang mạng lưới nội chất Capsid được tách ra khỏi polyprotein của vi rút dưới tác dụng của protease NS3/2B Sự phân tách này là cần thiết cho sự hình thành nucleocapsid [64], [65]

Protein prM/M gồm 166 a xit amin có khối lượng là 26 kDa Trong đó, đầu N-terminal của prM được tạo ra bởi peptidase ở mạng lưới nội chất trong suốt quá trình giải phóng vi rút từ tế bào chủ Protein prM (màng) có vai trò quan trọng trong định hình và sự trưởng thành của hạt vi rút, bao gồm 7 cấu trúc gấp nếp β ngược chiều Trong quá trình tạo ra vi rút hoàn chỉnh, prM trong mạng lưới Golgi bị cắt thành peptide ‘pr’ được giải phóng khỏi hạt vi rút hoàn chỉnh và protein M vẫn tồn tại trên vỏ vi rút [66]

Protein E (vỏ) thường được glycosyl hóa để thành glycoprotein, với khối lượng phân tử xấp xỉ 50 kDa Đầu C-terminal của protein E chứa một chuỗi tín hiệu chuyển NS1 vào trong mạng lưới nội chất Đây là một protein được tìm thấy trên bề mặt vi rút, đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết hạt vi rút vào tế bào chủ Một vài thụ thể tương tác với protein E (ICAM3, CD209, Rab 5,

GRP 78 và thụ thể Mannose) là tác nhân quan trọng giúp quá trình gắn kết và

xâm nhập của vi rút [66] Ngoài ra, đột biến từ các vùng khác nhau của protein

này đã tạo nên các týp biến thể của vi rút [64]

Bảng 1.1 Số lượng axit amin và trọng lượng phân tử của các protein cấu trúc và phi cấu trúc của vi rút Dengue

Protein Số lượng axit amin Trọng lượng phân tử (kDa)

Nguồn: Theo Roy SK và cs (2021) [64]

NS1 là một glycoprotein 45 kDa nằm bên trong mạng lưới nội chất và được tiết từ tế bào Đây là kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm vi rút [67]

NS2A là một loại protein kỵ nước với khoảng 231 axit amin NS2A được tách ra từ NS1 trong mạng lưới nội chất và được tách ra khỏi NS2B bởi protease NS3 NS2A liên kết với đầu 3’-UTR trong hệ gen của vi rút, được cho là có liên quan đến khả năng lắp ráp và bài tiết vi rút NS2B là một protein liên kết màng, khối lượng 14 kDa, có chứa 2 miền kỵ nước bao quanh vùng ưa nước Vùng trung tâm của NS2B đóng vai trò như cofactor của protease NS3 [64], [68]

NS3 của vi rút Dengue là một serine protease, đồng thời cũng có hoạt tính RNA helicase và RTPase/NTPase Vùng protease bao gồm sáu sợi β sắp xếp thành hai khối trụ bởi các thành phần 1-180 của protein Ba gốc axít amin trong trung tâm hoạt động của enzym (His-51, Asp73, và Ser-135), được tìm thấy ở

giữa hai khối này, và hoạt tính protease phụ thuộc vào sự có mặt của cofactor NS2B Các thành phần còn lại của NS3 (180-618) tạo thành ba tiểu vùng helicase của vi rút Dengue [68]

NS4A (16kDa) và NS4B (27kDa) là các protein tích hợp màng NS4A được cho là kích thích sự thay đổi màng giúp vi rút sao chép NS4B là protein phụ trợ sao chép RNA vi rút thông qua tương tác trực tiếp của nó với NS3 [67]

NS5 là protein lớn nhất (900 axit amin, 104 KDa) và bảo toàn nhất trong vi rút Dengue (67 % trình tự giống nhau giữa các týp huyết thanh vi rút Dengue 1-4) Nó cũng là một enzym hai chức năng với vùng methyltransferase (MTase, từ vị trí 1-296) ở đầu N và polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp; từ vị trí 320-900) ở đầu C [68]

1.4.3 Cấu trúc của protein NS1 (Hình 1.5)

NS1 (Nonstructural Protein 1) là một protein phi cấu trúc, với độ dài 352 axit amin và tồn tại ở nhiều dạng oligomer khác nhau Dạng monomer của phân tử này có khối lượng phân tử từ 46 – 55 kDa tùy thuộc vào trạng thái glycosyl hóa Monomer của NS1 thường tồn tại trên màng lưới nội sinh chất của tế bào, bao gồm 3 vùng chức năng chính: “miền β-roll”, “miền cánh” và “thang β ” Miền β-roll trải dài từ axit amin 1 đến 29, tạo thành hai cấu trúc hình kẹp tóc Vùng chức năng thứ 2 kéo dài từ axit amin 30 đến 180, tạo thành một đầu nhô ra được gọi là miền cánh Vùng này có 2 vị trí glycosyl hóa (Asn130 và Asn175) và 2 vùng chức năng phụ (α/β và vùng nối “connector”) Thang β là vùng chức năng chính của NS1, kéo dài từ axit amin 181 đến 352 [69]

Sau khi được dimer hóa, NS1 trở nên kỵ nước một phần Trong cấu trúc dimer của NS1, 4 cấu trúc kẹp tóc của “miền β-roll” đan xen với nhau và tạo thành mặt phẳng beta, sau đó nó cuộn tròn lại vào tạo thành cấu trúc hình ống Vùng “thang β” có cấu trúc có hình thang có hai mặt, mặt trước có dạng tấm beta, mặt sau được miêu tả như một vòng lặp đám rối [70]