báo cáo thực hành vi sinh kĩ thuật cấy bệnh phẩm máu tìm vi khuẩn gây bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC Y – DƯỢC

- -KHOA DƯỢC

BÁO CÁO

THỰC HÀNH VI SINHNhóm: 3

Lớp: Dược B + C.QH2022YMã học phần: SMP 1011

Thầy hướng dẫn: Đào Ngọc Duy

Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2024

DANH SÁCH THÀNH VIÊN

2 Nguyễn Thị Hương Khánh 22100261

19 Nguyễn Thị Hoài Thương 2210031220 Lê Thị Thùy Trang 2210031521 Nguyễn Thùy Trang 22100318

BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ

Giới thiệu,mở đầu, kết

tìm vikhuẩn gây

lấy máu tĩnh mạch để cấymáu

Lê Thị Thùy TrangLê Thị Thùy TrangNguyễn Thị Hoài

Thương Nguyễn Thị Hoài ThươngQuy trình cấy máu trên cơ

sở kết quả nhuộm Gram

Đỗ Thị Bích ThuĐỗ Thị Bích ThuHoàng Thị Như ÝHoàng Thị Như ÝNguyễn Khải ThiệnNguyễn Khải Thiện

Kháng sinhđồ

Định nghĩa kháng sinh đồNguyễn Ngọc ThảoNguyễn Ngọc ThảoNguyên lý, mục đích điều

kiện của kỹ thuật khoanhgiấy kháng sinh khuếch tán

Phạm Thị QuyênPhạm Thị QuyênĐinh Phú TàiĐinh Phú TàiLưu Thị Thanh TâmLưu Thị Thanh Tâm

Trình bày nguyên lý và kỹthuật kháng sinh pha loãng

Nông Thu PhươngNông Thu PhươngNguyễn Trọng Thái Phúc Nguyễn Trọng Thái Phúc

Lý Ngọc NhiLý Ngọc NhiĐọc và nhận định kết quả

kháng sinh đồ của cácchủng mẫu

Trịnh Thị NgọcTrịnh Thị Ngọc

Nguyễn Thị Trà MyNguyễn Thị Trà MyPhân tích

một số caselâm sàng

Phân tích nhận định một sốkết quả xn máu, case cuối

Nguyễn Khánh LyNguyễn Khánh LyTẩn Sía LưuTẩn Sía LưuPhạm Quốc ViệtPhạm Quốc ViệtNguyễn Thùy LinhNguyễn Thùy LinhTổng HợpVàng Chính Hưng Nguyễn Thị HươngKhánh

trình Nguyễn Thị Khánh VânNguyễn Tiến Lâm

A KĨ THUẬT CẤY BỆNH PHẨM MÁU TÌM VI KHUẨN GÂY BỆNHI.Các loại vi khuẩn gây nhiễm trùng máu thường gặp

Một số loài vi khuẩn gây nhiễm trùng máu thường gặp:

- Escherichia coli (E.coli)

+ Hầu hết các chủng E coli đều vô hại,

+ Một số serotype như EPEC, ETEC, v.v có thể gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng cho vật chủ

+ Hầu hết các chủng không gây bệnh cho người và là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường

- Klebsiella Pneumoniae (K.Pneumoniae):

+ Phế trực khuẩn Friedlander với khả năng gây ra các loại bội nhiễm ở đường hô hấp Đây cũng là một mầm bệnh cơ hội, luôn trực chờ để tấn công khi hệ miễn dịch bắt đầu suy yếu

+ Thông thường, vi khuẩn klebsiella pneumoniae có tồn tại trong ruột của con người, tuy nhiên ở môi trường này, chúng sẽ không gây ra các tác hại đáng kể Khi cơ thể gặp vấn đề nào đó, chúng sẽ nhanh chóng tấn công đến các bộ phận khác Đây mới là giai đoạn nguy hiểm của chủng vi khuẩn này

- Acinetobacter baumannii (A.Baumannii): Vi khuẩn Acinetobacter

baumannii là loại vi khuẩn gram âm, chúng có thể sống trên cơ thể của một số người khỏe mạnh, chúng có thể sống ở họng, da hay dịch tiết cơ thể mà không gây bệnh, nhưng khi gặp điều kiện thuận lợi như sức đề kháng của cơ thể ngườibị suy giảm miễn dịch thì chúng thành một tác nhân gây bệnh.

- Staphylococcus aureus (S.Aureus): Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống

thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da.

- Pseudomonas aeruginosa (P.Aeruginosa)

+ P aeruginosa đôi khi có mặt ở vùng nách và vùng sinh dục bình thường nhưng hiếm khi ở phân trừ khi có kháng sinh

+ Các thành viên khác của nhóm vi khuẩn gram âm này là các mầm bệnh cơ hội thường gây ra các bệnh nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt là ở các bệnh nhân thở máy, các bệnh nhân bị bỏng và bệnh nhân hạ bạch cầu trung tính hoặc suy nhược mạn tính.

II.Nguyên tắc lấy máu, cách lấy máu tĩnh mạch để cấy máu 1 Thời điểm lấy máu

- Lấy máu trước thời điểm người bệnh có biểu hiện rét run và bắt đầu sốt cao, trong vòng 30 phút, không được chậm trễ vì theo thời gian lượng vi khuẩn trong máu sẽ giảm sốt sau khi bệnh nhân hạ sốt.

- Lấy máu trước khi sử dụng kháng sinh Nếu đang sử dụng kháng sinh phải ngưng sử dụng kháng sinh hoặc lấy máu trước thời điểm sử dụng liều kháng sinh tiếp theo.

Lưu ý: Tránh lấy máu ở một số trường hợp sau:

- Bệnh nhân đang truyền dịch hoặc vừa truyền dịch xong- Bệnh nhân đâng dùng thuốc kháng sinh

- Bệnh nhân đang ăn hoặc vừa ăn xong

2 Nguyên tắc lấy máu

- Lấy máu đúng thời kỳ vi khuẩn đang lưu hành trong máu nhiều nhất, lúc sốt cao nhất

- Lấy máu nhiều lần trong ngày và trong nhiều ngày liên tiếp (bệnh Osler)- Đảm bảo vô khuẩn

- Đảm bảo đúng số lượng máu cần lấy

- Máu lấy xong cấy ngay vao bình canh thang tại gường bệnh

3 Số chỉ định cấy máu

- Lấy 2 mẫu ở 2 vị trí, cùng thời điểm- Lấy 2 mẫu ở cùng vị trí, cùng thời điểm- Lấy máu nhiều lần/ngày (bệnh Osler)- Lấy máu nhiều ngày liên tiếp

- Không nên chỉ định cấy máu một mẫu

4 Cách lấy máu tĩnh mạch để cấy máu

a Chuẩn bị

- Đối chiếu họ tên, tuổi, số giường, phòng bệnh nhân được lấy máu

- Tường hợp cấy máu nhiều lần trong ngày và nhiều ngày liên tiếp cần ghi rõ ngày, giờ cấy máu lần 1, 2, 3…

- Thời gian lấy máu chậm nhất là 15 phút sau khi nhận phiếu cấy máu

- Kiểm tra dụng cụ, rửa tay sạch, đeo khẩu trang, găng tay trước khi lấy máub Thủ thuật lấy máu

- Kiểm tra nhiệt độ bệnh nhân, ghi phiếu xét nghiệm- Lấy tĩnh mạch khuỷu tay hoặc mu bàn tay hoặc cổ tay- Buộc dây garo, sát trùng nơi chõ kim bằng cồn 70º

- Mở nắp bảo vệ chai cấy máu, sát trùng mặt nút cao su bằng cồn 70º, chọc kim qua nút cao su, bơm trực tiếp máu vào chai, lắc chai cấy máu để máu được trộnđều

- Sát khuẩn tay lấy bệnh phẩm bằng cồn 70º

III.Quy trình cấy máu trên cơ sở kết quả nhuộm Gram

1 Kiểm tra bình máu: Với bình cấy máu thông thường kiểm tra 02

lần/ngày (7 giờ sáng và 15 giờ chiều), khi thấy máu có biểu hiện khác thường (đục, có váng, cặn ở đáy hoặc cặn xốp lơ lửng) thì lấy ra làm xét nghiệm tìm vi khuẩn/nấm Với chai của máy cấy máu tự động: Nếu dương tính có còi và tín hiệu xuất hiện trên màn hình ở vị trí nào thì lấy chai máu ở vị trí đó ra, quét vào đầu dò và làm xét nghiệm tìm vi

khuẩn/nấm theo các bước sau: - Lắc đều bình máu:

+ Với bình cấy máu thông thường: Dùng pipette hoặc que cấy vô trùng

lấy một loop dàn tiêu bản nhuộm Gram tìm vi khuẩn/nấm và tính chất bắt màu, hình thể của vi khuẩn/nấm, ghi vào sổ xét nghiệm.

+ Với chai của máy cấy máu tự động: Sát trùng nắp chai, để khô, lấy bơm kim tiêm hút một lượng nhỏ dịch làm tiêu bản nhuộm Gram tìm vi khuẩn/nấm và tính chất bắt màu, hình thể của vi khuẩn/nấm, ghi vào sổ xét nghiệm.

- Cấy chuyển vào môi trường thích hợp theo kết quả nhuộm Gram: Vớibình cấy máu thông thường, dùng pipette hút 0,1ml hoặc lấy 1 loop đầy Với chai cấy máu của máy cấy máu tự động, dùng bơm kim tiêm hút một lượng nhỏ dịch

+ Cầu khuẩn Gram (+) đứng thành đám như chùm nho: cấy 1 đĩa TM + 1 ống Chapmann/35 độ C/24 giờ.

+ Trực khuẩn Gram (-): cấy 1 đĩa TM + 1 đĩa MacConkey + một ống thạch thường/35 độ C/24 giờ

+ Nếu nghi ngờ nấm chuyển vào môi trường Sabauroud: 1 ống để ở nhiệt độ phòng, 1 ống để ở 35 độ C, theo dõi 2 – 7 ngày.

Các trường hợp khác cấy 1 đĩa TM + 1 đĩa thạch Chocolate/ 5% C02/350C/24 giờ.

2 Để tủ ấm 35 độ C/24 giờ, ngày hôm sau kiểm tra khuẩn lạc, nhuộm

Gram xem hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn/nấm, tiếp tục dùng hóa chất và sinh phẩm thích hợp thử các tính chất sinh vật hóa học,làm định danh để xác định loài vi khuẩn/nấm và làm KSĐ.

3 Trả kết quả ngay cho bác sĩ lâm sàng khi có kết quả kháng sinh đồ.4 Nếu âm tính: Để tủ ấm với bình cấy máu thông thường đến ngày thứ 7

(với chai cấy máu của máy cấy máu tự động, máy sẽ tự động báo âm tính sau 5 ngày), làm tiêu bản nhuộm Gram và cấy chuyển trên môi trường thạch máu 35 độ C/24 giờ Sau 24 giờ, nếu không mọc khuẩn lạc thì kết luận âm tính và trả kết quả xét nghiệm cho bác sĩ lâm sàng.

- Những trường hợp vi khuẩn đã nhờn thuốc, cần phải kết hợp nhiều loại khángsinh cùng lúc hoặc phải dùng kháng sinh mạnh hơn. 

- Một số trường hợp bệnh nhân nhập viện có triệu chứng nghi ngờ nhiễm khuẩnvà chưa sử dụng kháng sinh Khi đó bác sĩ sẽ yêu cầu tìm ra kháng sinh phù hợp nhất để điều trị đích nhanh chóng và hiệu quả.

- Bên cạnh đó, phương pháp này còn được ứng dụng trong việc nghiên cứu sự nhạy cảm của một loại kháng sinh mới đối với vi khuẩn.

II. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (disk diffusion test)

a Nguyên lí

- Kháng sinh được thấm vào những khoanh giấy tròn, thường có đường kính 6mm, được đặt tại một điểm trên mặt đĩa thạch Kháng sinh từ khoanh giấy khuếch tán ra xung quanh Độ khuếch tán phụ thuộc vào tính chất của từng loạikháng sinh và độ dày của môi trường Vì vậy, càng xa nơi đặt khoanh giấy nồng độ kháng sinh càng thấp và ngược lại.

- Nơi có kháng sinh (xung quanh khoanh giấy), vi khuẩn không phát triển được gọi là vùng ức chế Đường kính vùng ức chế lớn chứng tỏ vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh đó Ngược lại, đường kính vùng ức chế nhỏ chứng tỏ vi khuẩn được thử đề kháng kháng sinh này (vì gần khoanh giấy- nồng độ kháng sinh cao mà vi khuẩn vẫn phát triển được).

 Việc đo đường kính vùng ức chế đóng vai trò quan trọng khi đọc kết quả kỹ thuật kháng sinh khuếch tán.

- Để chọn được kháng sinh thích hợp cho điều trị, cần phải đặt nhiều khoanh giấy, mỗi khoanh giấy thấm một kháng sinh với hàm lượng nhất định (tùy hãngsản xuất); mỗi đĩa petri (đường kính 90mm) thường đặt 6 khoanh.

b Mục đích

- Mục đích chính là để xác định MIC (Minimum Inhibitory Concentration), lànồng độ kháng sinh tối thiểu để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, giúp xácđịnh được mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với một loại kháng sinh cụ thể,từ đó:

+ Nhằm hướng dẫn cho các bác sỹ lâm sàng chọn lựa kháng sinh tốt nhất chotừng bệnh nhân

+ Nhằm thu thập những thông tin dịch tễ học về sự đề kháng của vi khuẩn gâybệnh quan trọng ở cộng đồng

c Điều kiện thực hiện kháng sinh đồ

- 3 yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả kháng sinh đồ gồm:

+ Vi khuẩn: Chủng phải thuần nhất, đã được phân lập từ người bệnh và xác định là tác nhân gây bệnh; phải đang ở giai đoạn phát triển mạnh và được pha thành huyền dịch có mật độ nhất định (ví dụ 10^8 cầu khuẩn/ml) và được dàn đều trên mặt thạch.

+ Môi trường: Mueller- Hinton (đủ dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển những không cản trở tác dụng của kháng sinh) với độ dày 4±0,5mm

+ Khoanh giấy kháng sinh: Phải đủ hoạt tính; mỗi nhóm vi khuẩn cần đặt những kháng sinh ưu tiên (hàng đầu) và một số kháng sinh khác thay thế hoặc nhằm mục đích nghiên cứu.

- Điều kiện nuôi cấy: thường ở 35° C và 18-24h ( đối với những vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu kỵ khí tùy tiện, dễ nuôi cấy).

III. Kỹ thuật kháng sinh pha loãng1 Nguyên lý:

- Kháng sinh được hòa đều vào môi trường nên tại bất kỳ điểm nào, nồng độ kháng sinh cũng như nhau

- Kháng sinh được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau (thường là pha loãng theo cấp số nhân của 2, ví dụ: 2, 4, 8, 16, 32, 64 ) Sau đó cấy vi khuẩn cần được thử nghiệm, một lượng như nhau cho mỗi nồng độ kháng sinh.

- Môi trường nuôi cấy là Mueller-Hinton, có thể sử dụng môi trường lỏng hoặc đặc Nếu trong môi trường có kháng sinh, vi khuẩn vẫn phát triển thành khuẩn lạc (trên môi trường đặc) hay làm đục môi trường (lỏng) thì chứng tỏ chúng đề kháng với nồng độ kháng sinh đó.

2 Mục đích.

Xác định nồng độ kháng sinh ức chế được sự phát triển của một lượng vi khuẩnnhất định (Nồng độ ức chế tối thiểu - minimal inhibition concentration = MIC).Biết MIC sẽ biết liều lượng kháng sinh thích hợp (đủ) để điều trị cho từng vi khuẩn gây bệnh.

3 Kỹ thuật kháng sinh pha loãng

- Liều lượng dung trong điều trị phải đạt cao hơn MIC ( đã xác định in vitro)

4 Một số kỹ thuật kháng sinh pha loãng.

- Phương pháp E – Test

- Pha loãng kháng sinh trong tube- Pha loãng kháng sinh trong thạch- Pha loãng kháng sinh trong plate

 Kỹ thuật E-Test:

Là kỹ thuật định lượng đơn giản nhất, được hình thành trên cơ sở ứng dụng được những ưu điểm của kỹ thuật xác định MIC trên môi trường lỏng và kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên môi trường thạch.

 Nguyên lý:

- Kháng sinh được đưa vào các ô cố định của thanh E-Test với dải nồng độ giảm dần theo bậc 2 Khi thanh E-Test được đặt trên mặt thạch đã được cấy vi khuẩn, kháng sinh sẽ được khuếch tán vào môi trường thạch Sau 18-24h nuôi cấy, xuất hiện các vùng ức chế hình elip đối xứng qua thanh E-

Test.Giá trị MIC được xác định tại nồng độ là điểm cắt của hình elip với thanh E-Test.

 Các vật liệu, sinh phẩm:

- Thạch kháng sinh đồ Mueller-Hinton- Vi khuẩn thuần nhất

- Các thanh E-Test kháng sinh các loại

 Quy trình thực hiện:

- Cấy vi khuẩn lên mặt đĩa thạch KSĐ

- Đặt thanh E-Test thử nghiệm lên mặt thạch, mặt ghi nồng độ hướng lên trên, vị trí nồng độ kháng sinh lớn nhất đặt sát mép đĩa thạch và đảm bảo tiếp xúc toàn bộ với mặt thạch Sau khi đặt xong các test thử 15 phút, lậtn gược đĩa thạch cất vào tủ ấm đủ ấm 37oC 18-24h.

 Đọc kết quả: Gía trị MIC là nồng độ kháng sinh ghi trên thanh test thử tại vị trí

cắt của hình e-lip với thanh E-test.

5 Ý nghĩa của kháng sinh đồ

Xác định và định danh được vi khuẩn gây bệnh, đồng thời đánh giá mức độ nhạycảm của kháng sinh đó đối với vi khuẩn gây bệnh giúp

- Trên lâm sàng, các bác sĩ sẽ chọn lựa kháng sinh tốt nhất, đưa ra phác đồ điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân Tránh việc lạm dụng thuốc kháng sinhquá đà để giảm thiểu tình trạng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn.

- Tập hợp những thông tin dịch tễ học về sự đề kháng của vi khuẩn gây bệnh quan trọng đối với các kháng sinh hiện có Từ đó xây dựng các hướng dẫn sử dụng kháng sinh trong điều trị khi chưa có kết quả kháng sinh đồ.

IV. Đọc và nhận định kết quả kháng sinh đồ

1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (disk diffusion test)

a) Đọc kết quả:

- Kiểm tra mật độ khuẩn lạc: Nơi không có kháng sinh hoặc nồng

độ kháng sinh thấp không đủ ức chế được vi khuẩn, chúng sẽ mọc thành những khuẩn lạc dày sát nhau; nhưng không được dày quá – thành thảm hoặc thưa quá – còn khe hở giữa các khuẩn lạc Vì mật độ vi khuẩn quá dày sẽ thu nhỏ đường kính vùng ức chế và ngược lại quá thưa sẽ mở rộng đường kính vùng ức chế so với chuẩn => Sai lệch kết quả

- Dùng thước đo đường kính vùng ức chế tính ra mm

- Đo và nhận định kết quả ở các chủng mẫu bằng cách so vào bảng

giới hạn dành cho chủng mẫu để kiểm tra chất lượng xét nghiệm Chất lượng xét nghiệm bao gồm nhiều yếu tố kỹ thuật; ví dụ: hoạt tính của khoanh giấy kháng sinh, nếu đạt yêu cầu (đường kính vùng ức chế nằm trong giới hạn cho phép – bảng 1) mới đọckết quả của các chủng phân lập được.

- Đo đường kính vùng ức chế ở các chủng phân lập được từ người

bệnh, so vào bảng giới hạn – bảng 2 để xếp loại “đề kháng – resistant – R” hoặc “trung gian – intermediate – I” hoặc “nhạy cảm – susceptible – S” cho mỗi khoanh ở các đĩa kháng sinh đồ đã chuẩn bị sẵn.

mỗi kháng sinh, đường đưa vào cơ thế, khả năng sẵn có, giá thánh,…)

Bảng 1 Giới hạn đường kính vùng ức chế của các chủng kiểm tra chất lượng

(Theo CLSI, 2006)

Bảng 2 Giới hạn đường kính vùng ức chế xếp loại độ nhạy cảm của vi khuẩn với

kháng sinh (Theo CLSI, 2006)

2 Kỹ thuật kháng sinh pha loãng (dilution test).

a, Đọc kết quả:- Ống 1: luôn trong.- Ống 10: luôn đục.

protein) Nếu nồng độ thuốc tự do trong mô cao hơn MIC, điều trị có thểthành công.

Kết quả xét nghiệm và chẩn đoán sơ bộ:

- Xét nghiệm nhanh đường hô hấp phat hiện vi khuẩn Streptococcus pyogenes- Chẩn đoán sơ bộ: Viêm họng do vi khuẩn Streptococcus pyogenes

Kết quả và điều trị ban đầu:

- Bệnh nhân được kê đơn kháng sinh penicillin V theo liều dung thông thường trong 10 ngày

- Sau 5 ngày điều trị, triệu chứng của bệnh nhân cải thiện đáng kể

Theo dõi và đánh giá:

- Bệnh nhân được theo dõi chặt chẽ sau khi kết thúc kháng sinh để đảm bảo sự cải thiện và ngăn ngửa tái phát

- Nếu triệu chứng tiếp tục hoặc tái phát cần xem xét lại đặt lại liệu pháp và sự tang cường xét nghiệm đánh giá nhiễm trùng và khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn.