(Luận Văn Thạc Sĩ Hoá Học) Nghiên Cứu Phân Tích Paraben Và Dẫn Xuất Của Chúng Trong Cá Biển Và Động Vật Hai Mảnh Vỏ

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Danh māc các ký hiáu và chữ viÁt tắt

Tÿ viÁt tắt Tên tiÁng Anh Tên tiÁng Viát

3,4-DHB 3,4-dihydroxy benzoic acid Axit 3,4-dihydroxy benzoic 4-HB p-hydroxy benzoic acid Axit p-hydroxy benzoic

iPrP Iso-propyl paraben Iso-propyl paraben

m-PB Metabolite of parabens Ch¿t chuyển hóa cąa paraben OH3EtP Ethyl protocatechuate Ethyl protocatechuate

OH3MeP Methyl protocatechuate Methyl protocatechuate

UPW Ultrapure Water N°ãc siêu s¿ch (N°ãc c¿t lo¿i ion)

CT Silver Pomfret Cá Chim trắng

HQ Hazard Quotient Giá trß chỉ sá đác tá

IDL Instrumental Detection Limit Giãi h¿n phát hián cąa thiÁt bß IQL Instrumental Quantification

Repeatability Đá lách chu¿n cąa đá lặp l¿i

RSDwr

Relative Standard Deviation of Within-laboratory

Reproducibility

Đá lách chu¿n cąa đá tái lặp

EFSA European Food Safety Authority

C¢ quan An toàn Thực ph¿m Châu Âu

FDA Food and Drug Administration C¢ quan Qu愃ऀn lý Thực ph¿m và D°āc ph¿m Hoa Kỳ EMR Enhanced Matrix Removal

PSA Primary Secondary Amine

SPE Solid Phase Extraction ChiÁt pha rắn MRM Multiple Reaction Monitoring

PRM Pararell Reaction Monitoring QuEChERS Quick 3 Easy 3 Cheap 3

Effective 3 Rugged 3 Safe

Nhanh 3 Dß 3 Rẻ 3 Hiáu qu愃ऀ 3 àn đßnh 3 An toàn

CE Capillary Electrophoresis Đián di mao qu愃ऀn GC-

MS/MS

Gas Chromatography 3 Tandem Mass Spectrometry

Sắc ký khí ghép nái hai lđ

LC-MS/MS Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry

Sắc ký lßng ghép nái hai lđ

HRMS

UHPLC-Ultra-High-Performance Liquid Chromatography - High-Resolution Mass Spectrometry

Sắc ký lßng hiáu năng cao ghép nái khái phá phân gi愃ऀi cao

MS/MS

UPLC-Ultra-peformane Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry

Sắc ký lßng hiáu năng cao

phá

Danh māc các bÁng

Hình 1.1: Công thćc c¿u t¿o chung cąa PB 3

Hình 1.2: S¢ đß chuyển hóa có thể x愃ऀy ra cąa các PB 6

Hình 1.3: Giao dián há tháng sắc ký lßng hiáu năng Thermo Liquid Ultimate 3000 RS UHPLC (Dionex) ghgp nái đFocus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ ( Thermo Scientific) 16

Hình 1.4: C¿u t¿o há Q Exactive Focus 17

Hình 1.5: Cát sắc ký Acquity HSS T3 18

Hình 1.6: Quá trình xử lý mÁu bằng kỹ thuÃt chiÁt pha rắn (SPE) 20

Hình 1.7: C¿u trúc vÃt liáu PSA 21

Hình 2.1: Quy trình xử lý mÁu sinh vÃt biển 31

Hình 3.1: KÁt qu愃ऀ tái °u điều kián dung môi chiÁt 40

Hình 3.2: KÁt qu愃ऀ tái °u vÃt liáu h¿p phă 42

Hình 3.3: KÁt qu愃ऀ tái °u điều kián bay h¢i dung môi 44

Hình 3.4: Táng hàm l°āng PB đ°āc phát hián trong 6 nền mÁu khác nhau 53

Hình 3.5: Tỉ lá phân bá về hàm l°āng từng PB so vãi hàm l°āng táng PB cąa các nền mÁu 54

Hình 3.6: Tỉ lá phân bá về hàm l°āng từng hāp ch¿t chuyển hóa cąa PB so vãi hàm l°āng táng cąa các nền mÁu 55

Hình 3.7: KÁt qu愃ऀ phân tích thành phHình 3.8: KÁt qu愃ऀ phân tích thành phHình 3.9: KÁt qu愃ऀ so sánh sự khác biát cąa PB giư뀃a các vùng miền t¿i Viát Nam 58

Hình 3.10: KÁt qu愃ऀ so sánh sự khác biát cąa m-PB giư뀃a các vùng miền t¿i Viát Nam 58

Danh māc các hình v¿, đß thá

Hình 1.1: Công thćc c¿u t¿o chung cąa PB 3

Hình 1.2: S¢ đß chuyển hóa có thể x愃ऀy ra cąa các PB 6

Hình 1.3: Giao dián há tháng sắc ký lßng hiáu năng Thermo Liquid Ultimate 3000 RS UHPLC (Dionex) ghgp nái đFocus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ ( Thermo Scientific) 16

Hình 1.4: C¿u t¿o há Q Exactive Focus 17

Hình 1.5: Cát sắc ký Acquity HSS T3 18

Hình 1.6: Quá trình xử lý mÁu bằng kỹ thuÃt chiÁt pha rắn (SPE) 20

Hình 1.7: C¿u trúc vÃt liáu PSA 21

Hình 2.1: Quy trình xử lý mÁu sinh vÃt biển 31

Hình 3.1: KÁt qu愃ऀ tái °u điều kián dung môi chiÁt 40

Hình 3.2: KÁt qu愃ऀ tái °u vÃt liáu h¿p phă 42

Hình 3.3: KÁt qu愃ऀ tái °u điều kián bay h¢i dung môi 44

Hình 3.4: Táng hàm l°āng PB đ°āc phát hián trong 6 nền mÁu khác nhau 53

Hình 3.5: Tỉ lá phân bá về hàm l°āng từng PB so vãi hàm l°āng táng PB cąa các nền mÁu 54

Hình 3.6: Tỉ lá phân bá về hàm l°āng từng hāp ch¿t chuyển hóa cąa PB so vãi hàm l°āng táng cąa các nền mÁu 55

Hình 3.7: KÁt qu愃ऀ phân tích thành phHình 3.8: KÁt qu愃ऀ phân tích thành phHình 3.9: KÁt qu愃ऀ so sánh sự khác biát cąa PB giư뀃a các vùng miền t¿i Viát Nam 58

Hình 3.10: KÁt qu愃ऀ so sánh sự khác biát cąa m-PB giư뀃a các vùng t¿i Viát Nam 58

CH¯¡NG 1 TàNG QUAN TÀI LIàU 3

1.1 Táng quan về paraben và hāp ch¿t chuyển hóa cąa chúng 3

1.1.1 Giãi thiáu về paraben 3

1.1.2 Giãi thiáu về hāp ch¿t chuyển hóa 3 dÁn xu¿t cąa paraben 6

1.1.3 Tác dăng khcng khu¿n cąa paraben 8

1.1.4 Ành h°ßng cąa hāp ch¿t paraben đÁn con ng°£i 9

1.1.5 Ành h°ßng cąa hāp ch¿t paraben đÁn môi tr°£ng và sinh vÃt biển 101.1.6 Nguyên nhân và thực tr¿ng ô nhißm paraben ß thąy h愃ऀi s愃ऀn 11

1.1.7 Tình hình nghiên cću trong và ngoài n°ãc 12

1.2 Ph°¢ng phcp phân tích hāp ch¿t paraben và dÁn xu¿t cąa chúng 13

1.3.2.1 VÃt liáu Primary Secondary Amine (PSA) 21

1.3.2.2 VÃt liáu Enhanced Matrix Removal (EMR) 22

CH¯¡NG 2 ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 23

2.1 Đái t°āng, măc tiêu và nái dung nghiên cću 23

2.1.1 Đái t°āng nghiên cću 23

2.1.2 Măc tiêu nghiên cću 23

2.1.3 Nái dung nghiên cću 23

2.2 ThiÁt bß, dăng că, hóa ch¿t 23

2.2.1 ThiÁt bß, dăng că 23

2.3.3.2 Chu¿n trung gian (Cmix 50 mg/L) 27

2.3.3.3 Chu¿n trung gian (Cmix 1 mg/L) 27

2.3.3.4 Dãy chu¿n làm viác 28

2.4.Nái dung nghiên cću 28

2.4.1 Ph°¢ng phcp thu thÃp, xử lý s¢ bá và b愃ऀo qu愃ऀn mÁu 28

2.4.2 Điều kián thiÁt bß phân tích 30

2.4.3 Xcc nhÃn gic trß sử dăng cąa ph°¢ng phcp 30

2.4.4 Nghiên cću quy trình xử lý mÁu 30

2.4.4.1 Quy trình xử lý mÁu 30

2.4.4.2 Kh愃ऀo sct dung môi chiÁt 32

2.4.4.3 Kh愃ऀo sct vÃt liáu h¿p phă trong quc trình chiÁt SPE 32

2.4.4.4 Kh愃ऀo sct điều kián hóa h¢i dung môi 33

2.4.5 Ph°¢ng phcp xử lý sá liáu 33

2.4.5.1 Xcc đßnh hàm l°āng PB và m-PB trong mÁu 33

2.4.5.2 Phân tích tháng kê 34

2.4.6 Đcnh gic rąi ro sćc khße 34

CH¯¡NG 3 KÀT QUÀ VÀ THÀO LUÂN 36

3.1. Điều kián thiÁt bß phân tích 36

3.1.1 Há tháng sắc ký lßng siêu hiáu năng (UHPLC) 36

3.1.2 Há tháng khái phá phân gi愃ऀi cao (HRMS) 37

3.2. KÁt qu愃ऀ kh愃ऀo sct điều kián xử lý mÁu 39

3.2.1 KÁt qu愃ऀ kh愃ऀo sct dung môi chiÁt 39

3.2.2 KÁt qu愃ऀ kh愃ऀo sct vÃt liáu h¿p phă 41

3.2.3 KÁt qu愃ऀ kh愃ऀo sct điều kián hóa h¢i dung môi 43

3.3. KÁt qu愃ऀ xcc nhÃn gic trß sử dăng cąa ph°¢ng phcp 45

3.3.1 KÁt qu愃ऀ giãi h¿n phct hián và giãi h¿n đßnh l°āng cąa thiÁt bß 45

3.3.2 KÁt qu愃ऀ kho愃ऀng tuyÁn tính 46

3.3.3 KÁt qu愃ऀ hiáu su¿t thu hßi, đá lặp l¿i và đá tci lặp 47

3.3.4 KÁt qu愃ऀ giãi h¿n phct hián và giãi h¿n đßnh l°āng cąa ph°¢ng phcp 48

3.4. KÁt qu愃ऀ phân tích hàm l°āng paraben trong mát sá nền mÁu sinh vÃt biển 50

3.5 Đcnh gic rąi ro sćc khße 59

CH¯¡NG 4 KÀT LUÂN 62

TÀI LIàU THAM KHÀO 63

PHĂ LĂC 72

Mà ĐÄU

Paraben là tên gái chung cąa mát nhóm ch¿t b愃ऀo qu愃ऀn hóa hác đ°āc sử dăng phá biÁn trong công nghiáp, đặc biát trong d°āc ph¿m, s愃ऀn ph¿m chăm sóc cá nhân và thực ph¿m [1] Đây đ°āc coi là mát nhóm ch¿t b愃ऀo qu愃ऀn lý t°ßng bßi kh愃ऀ năng khcng khu¿n tát, tính án đßnh cao trong ccc môi tr°£ng pH khác nhau và giá thành rẻ [2] Tuy nhiên, mát sá nghiên cću gcho th¿y paraben có tcc đáng x¿u đÁn môi tr°£ng và sćc khße con ng°£i Chúng đ°āc liát kê vào nhóm hāp ch¿t gây rái lo¿n nái tiÁt do có như뀃ng tác đáng liên quan đÁn quá trình gây vô sinh ß nam giãi, lão hóa da, có mái liên há vãi bánh ung thu vú, &

Ccc quy đßnh hián hành về sử dăng paraben s¿ khác nhau theo từng khu vực Đái vãi khu vực ASEAN, Căc Qu愃ऀn lý D°āc đã đ°a ra quy đßnh, trong các s愃ऀn ph¿m chăm sóc cc nhân, ccc hāp ch¿t paraben có hàm l°āng không v°āt quc 0.8% (tính theo axit) theo công văn sá 6577/QLD-MP Đái vãi thực ph¿m, Viát Nam ch°a có như뀃ng quy đßnh că thể về ng°ÿng cho phép cąa các hāp ch¿t paraben Vì vÃy, viác phân tích, đcnh gic kh愃ऀ năng tích lũy hàm l°āng paraben trong mÁu thực ph¿m là điều cvá sinh an toàn thực ph¿m cũng nh° sćc khße cąa ng°£i tiêu dùng

Sự phá biÁn cąa paraben trong các s愃ऀn ph¿m tiêu dùng cùng vãi hián t°āng x愃ऀ rác bừa bãi đã khiÁn paraben xu¿t hián trong nhiều môi tr°£ng khác

paraben trong môi tr°£ng n°ãc [5-8], không khí [9-13], đ¿t và tr17], trong thực ph¿m biển [18-20]

Viát Nam là đ¿t n°ãc có b£ biển dài, ch¿y dác từ Bắc vào Nam vãi ngußn thąy h愃ऀi s愃ऀn đa d¿ng, phong phú khiÁn cho ho¿t đáng đcnh bắt gb£ trß thành thu nhÃp chą yÁu vãi ng° dân Viát Nam H¢n nư뀃a, l°āng tiêu thă các s愃ऀn ph¿m từ thąy h愃ऀi s愃ऀn vô cùng lãn, là mặt hàng xu¿t kh¿u quan tráng Vì vÃy, viác kiểm soát ch¿t l°āng thąy h愃ऀi s愃ऀn, că thể là hàm l°āng paraben do 愃ऀnh h°ßng từ môi tr°£ng sáng, ngußn thćc ăn; là điều cb愃ऀo đ°āc ngußn cung dßi dào trong n°ãc và ngoài n°ãc cũng nh° đ愃ऀm b愃ऀo sćc khße con ng°£i

Trên c¢ sß đó, chúng tôi tiÁn hành thực hián luÃn văn vãi tiêu đề:

<Nghiên cứu phân tích paraben và dẫn xuất của chúng trong cá biển và động vật hai mảnh vỏ” vãi măc tiêu:

1 Xây dựng ph°¢ng pháp phân tích phù hāp để xcc đßnh 7 hāp ch¿t paraben và 4 dÁn xu¿t là các hāp ch¿t chuyển hóa cąa chúng

2 Áp dăng ph°¢ng phcp xây dựng để xcc đßnh ch¿t phân tích trong mÁu cá biển và đáng vÃt hai m愃ऀnh vß t¿i mát sá ng° tr°£ng tr愃ऀi dài 3 miền cąa Viát Nam

3 Đcnh giá rąi ro sćc khße đái vãi con ng°£i cąa nhóm ch¿t phân tích này

Nái dung nghiên cću bao gßm:

1 Nghiên cću quy trình xử lý mÁu bao gßm kh愃ऀo sát dung môi chiÁt, vÃt liáu h¿p phă trong quá trình chiÁt SPE và điều kián hóa h¢i dung môi

2 Xác nhÃn giá trß sử dăng cąa ph°¢ng pháp

3 Áp dăng ph°¢ng phcp phân tích đã nghiên cću vào phân tích 111 mÁu cá biển và đáng vÃt hai m愃ऀnh vß đ°āc thu thÃp t¿i các tỉnh thành ß ba miền Viát Nam

4 Xử lý sá liáu và đcnh gic rąi ro sćc khße đái vãi con ng°£i từ bá sá liáu thu đ°āc

CH¯¡NG 1 TàNG QUAN TÀI LIàU

1.1 TàNG QUAN VÂ PARABEN VÀ HþP CHÂT CHUYÄN HÓA CĂA CHÚNG

1.1.1 Giới thiáu và paraben

Paraben (PB) hay 4-hydroxybenzoates là este cąa axit hydroxybenzoic, mát nhóm ch¿t b愃ऀo qu愃ऀn hóa hác đ°āc sử dăng phá biÁn trong công nghiáp, đặc biát là trong d°āc ph¿m, s愃ऀn ph¿m chăm sóc cc nhân và thực ph¿m Mát sá lo¿i có thể đ°āc tìm th¿y trong tự nhiên, nh°ng hcác s愃ऀn ph¿m PB th°¢ng m¿i hián nay đều đ°āc s愃ऀn xu¿t dựa trên quá trình este hóa cąa axit 4-hydroxybenzoic và alcohol t°¢ng ćng trong điều kián thích hāp PB có công thćc c¿u t¿o chung nh° sau:

4-Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của PB

PB đ°āc phân lo¿i thành PB m¿ch ngắn, ví dă nh° methyl paraben và ethyl paraben và PB m¿ch dài, bao gßm propyl paraben, butyl paraben và benzyl paraben, dựa trên đá dài cąa chußi este cąa chúng [3]

Trong điều kián bình th°£ng, PB tßn t¿i d°ãi d¿ng như뀃ng tinh thể màu trắng hoặc không màu, không mùi, và không vß PB tan tát trong các dung môi phân cực nh° methanol (MeOH), ethanol (EtOH), glycerol, propylene glycol, và tan ít hoặc gnày vÁn đą để t¿o đ°āc nßng đá và tác dăng mong muán

Trong môi tr°£ng acid thì PB án đßnh, nh°ng trong môi tr°£ng môi tr°£ng kiềm PB đ°āc thąy phân thành axit hydroxybenzoic và alcohol t°¢ng ćng Khi chiều dài chußi alkyl cąa PB tăng lên, kh愃ऀ năng khcng thąy phân và ho¿t tính kháng khu¿n tăng, nh°ng kh愃ऀ năng hoa tan trong n°ãc gi愃ऀm [21] Trong nghiên cću này 7 hāp ch¿t PB đ°āc tiÁn hành nghiên cću, các tính ch¿t hóa lý cąa 7 hāp ch¿t này đ°āc trình bày trong B愃ऀng 1.1

4

Bảng 1.1: Tính chất của một số PB [6, 22, 23]

Khçi l°ÿng phân tā

(mmHg) (25°C)

Log Kow pKa Đß tan (mg/l)

Methyl paraben

(PrP)

5

Iso-propyl paraben

(BzP)

Heptyl paraben

(HeP)

1.1.2 Giới thiáu và hÿp chÃt chuyÅn hóa – dÁn xuÃt căa paraben

PB đ°āc coi là ch¿t b愃ऀo qu愃ऀn khá án đßnh nh°ng chúng có thể bß chuyển hóa [24] theo s¢ đß nh° trong Hình 1.2 Sau khi đ°āc h¿p thă, PB dß dàng đ°āc chuyển hóa bßi các esterase trong gan và ch¿t chuyển hóa chính là axit p-hydroxybenzoic (4-HB) [25] Tuy nhiên, thông tin về viác tiÁp xúc vãi các ch¿t chuyển hóa cąa paraben (m-PB) ß ng°£i còn h¿n chÁ [26] Trong sá các m-PB, methyl protocatechuate (OH3MeP) và ethyl protocatechuate (OH3EtP) t°¢ng ćng đặc tr°ng cho ph¢i nhißm MeP và EtP; ng°āc l¿i, 4-HB và 3,4-dihydroxy benzoic acid (3,4-DHB) là như뀃ng ch¿t chuyển hóa không đặc tr°ng, vì chúng có ngußn gác từ nhiều ngußn khác nhau [27]

Ph愃ऀn ćng x愃ऀy ra trong điều kián kiềm vừa ph愃ऀi, đặc biát khi pH g 8 [28] Ph愃ऀn ćng này khá phá biÁn trong môi tr°£ng do ph¿m vi pH cąa n°ãc th愃ऀi sinh ho¿t là 639 [29] và sự tßn t¿i phá biÁn cąa PB trong các s愃ऀn ph¿m chăm sóc cc nhân Khi các s愃ऀn ph¿m chăm sóc cc nhân có chća PB đ°āc th愃ऀi ra há tháng n°ãc th愃ऀi, chúng s¿ tiÁp xúc vãi môi tr°£ng n¢i pH g 8 và quc trình thąy phân xúc tcc baz¢ cąa PB x愃ऀy ra sau đó, t¿o thành 4-HB

Do đó, bán ch¿t chuyển hóa 4-HB, 3,4-DHB, OH-MeP, và OH-EtP cũng đ°āc phân tích trong nghiên cću này nh° ccc s愃ऀn ph¿m phă PB có thể đ°āc t¿o ra trong quá trình b愃ऀo qu愃ऀn các s愃ऀn ph¿m tiêu dùng

Hình 1.2: Sơ đồ chuyển hóa có thể xảy ra của các PB

7

Bảng 1.2: Tính chất các chất chuyển hóa của PB

phân tā

Khçi l°ÿng phân tā

(mmHg) (25 °C)

Log Kow pKa

Đß tan (mg/l) (25 °C)

Công thąc cÃu t¿o

Methyl protocatechuate

(OH-MeP)

Ethyl protocatechuate

1.1.3 Tác dāng kháng khu¿n căa paraben

Các PB có tác dăng tiêu diát nhiều lo¿i vi khu¿n, n¿m mác nên đ°āc sử dăng nh° ch¿t b愃ऀo qu愃ऀn lý t°ßng C¢ chÁ ho¿t đáng cąa các PB hián vÁn ch°a đ°āc xcc đßnh rõ ràng Chúng đ°āc cho là phá vÿ quá trình vÃn chuyển ch¿t qua màng hoặc ćc chÁ táng hāp ADN và ARN hay mát sá enzyme quan tráng [30]

Steinberg Doron và cộng sự [30] đã nghiên cću kh愃ऀ năng khcng khu¿n

cąa bán PB phá biÁn MeP, EtP, PrP và BuP đái vãi vi khu¿n Streptococcus sobrinus gây ra bánh sâu răng KÁt qu愃ऀ thu đ°āc cho th¿y, kh愃ऀ năng khcng khu¿n cąa PB tăng dtan trong n°ãc cąa PB l¿i gi愃ऀm dmôi tr°£ng n°ãc là môi tr°£ng lý t°ßng để vi khu¿n phát triển Do đó, ccc PB vãi chußi alkyl ngắn th°£ng đ°āc lựa chán sử dăng vãi măc đích b愃ऀo qu愃ऀn

Để tăng hiáu qu愃ऀ trong b愃ऀo qu愃ऀn, mát sá paraben đ°āc sử dăng kÁt hāp vãi nhau Thông th°£ng, hai PB trß lên đ°āc kÁt hāp vãi nhau để tăng kh愃ऀ năng khcng khu¿n

Kho愃ऀng nßng đá PB ckhác nhau đ°āc trình bày trong b愃ऀng 1.4

Bảng 1.4: Khoảng nồng độ PB cần thiết để ức chế các loài nấm khác nhau [31]

1.1.4 Ành h°áng căa hÿp chÃt paraben đÁn con ng°ßi

PB trong lßch sử đ°āc coi là an toàn, nh°ng nghiên cću đ°āc thực hián bßi Darbre và cộng sự đã làm scng tß mái liên há tiềm tàng giư뀃a PB và bánh

ung th° vú [32] Nghiên cću này đã thu hút đ°āc sự chú ý đcng kể và làm d¿y lên mái lo ng¿i về đác tính cąa PB

Mát sá nghiên cću đã chỉ ra rằng PB có kh愃ऀ năng gây rái nái tiÁt, nh° 愃ऀnh h°ßng đÁn ho¿t đáng cąa hormon estrogen trong c¢ thể con ng°£i Hormon này quan tráng trong quá trình phát triển và duy trì c¢ quan sinh dăc, và b¿t kỳ sự can thiáp nào vào ho¿t đáng cąa nó có thể gây ra sự rái lo¿n nái tiÁt Ngoài ra, PB còn có kh愃ऀ năng c愃ऀn trß quá trình hô h¿p cąa ty thể ß các

sinh vÃt khác nhau, gây ra sự kích ho¿t các tÁ bào nái tiÁt thông qua c¢ chÁ estrogen, có thể gây ra vô sinh ß nam giãi [33-38]

Viác con ng°£i tiêu thă PB có thể x愃ऀy ra thông qua nhiều con đ°£ng khác nhau, bao gßm chÁ đá ăn uáng, hô h¿p và h¿p thă qua da, do sự phá biÁn cąa các s愃ऀn ph¿m chăm sóc cc nhân và sự hián dián cąa các hāp ch¿t này trong môi tr°£ng xung quanh [39, 40] Do đó, PB đã đ°āc phát hián trong các mÁu sinh hác khác nhau cąa con ng°£i, bao gßm huyÁt thanh, n°ãc tiểu, nhau thai và mô khái u vú [32, 41, 42] Để đái phó vãi tcc đáng b¿t lāi cąa PB đái vãi sćc khße con ng°£i, nhiều quác gia đã thực hián các bián pháp qu愃ऀn lý và giãi h¿n để gi愃ऀm thiểu các mái nguy tiềm ¿n liên quan đÁn các ch¿t này Ví dă, C¢ quan Qu愃ऀn lý Thực ph¿m và D°āc ph¿m Hoa Kỳ (FDA) và C¢ quan An toàn Thực ph¿m Châu Âu (EFSA) đã thiÁt lÃp ccc ng°ÿng quy đßnh đái vãi PB trong các s愃ऀn ph¿m thực ph¿m dành cho ng°£i [43, 44] T°¢ng tự, Trung Quác đã thực hián ccc quy đßnh liên quan đÁn PB trong các s愃ऀn ph¿m thực ph¿m, nh° đ°āc nêu trong quy đßnh GB 2760-2014 [45]

1.1.5 Ành h°áng căa hÿp chÃt paraben đÁn môi tr°ßng và sinh vÃt biÅn

Bên c¿nh các rąi ro mà hāp ch¿t PB có thể gây ra cho con ng°£i, môi tr°£ng và sinh vÃt biển cũng là như뀃ng đái t°āng chßu 愃ऀnh h°ßng đcng kể

• Kh愃ऀ năng tích tă trong môi tr°£ng: PB có thể tích tă trong môi tr°£ng n°ãc và đ¿t do kh愃ऀ năng hoa tan trong n°ãc và bß tách ra từ s愃ऀn ph¿m chća PB Điều này có thể dÁn đÁn sự tích tă dài h¿n cąa PB trong môi tr°£ng tự nhiên [7]

• Ành h°ßng đÁn sinh vÃt biển: PB có thể 愃ऀnh h°ßng đÁn sinh vÃt biển khi chúng tiÁp xúc vãi n°ãc biển và môi tr°£ng n°ãc Nhiều nghiên cću đã ghi nhÃn sự tßn t¿i cąa PB trong môi tr°£ng n°ãc biển và các lo¿i sinh vÃt biển nh° cc, t愃ऀo, và đáng vÃt biển nhß [18, 46-48]

• Kh愃ऀ năng gây rái nái tiÁt: Không chỉ ß ng°£i, PB cũng có kh愃ऀ năng gây rái nái tiÁt ß sinh vÃt biển và có thể 愃ऀnh h°ßng đÁn quá trình sinh s愃ऀn và phát triển cąa chúng Nó có kh愃ऀ năng t°¢ng tự ß loài cá và các sinh vÃt biển khcc nh° t愃ऀo biển và ngao

Tác gi愃ऀ Oishi [49] đã thử nghiám tác dăng cąa PrP ß liều 0%; 0,01%;

đ°āc tiÁn hành phân tích Tráng l°āng cąa ccc c¢ quan này không thay đái tuy nhiên l¿i ghi nhÃn sự gi愃ऀm ß nßng đá và trư뀃 l°āng tinh trùng khi tăng liều PrP Bên c¿nh đó, l°āng hocmon testosterone cũng gi愃ऀm khi liều l°āng PrP đ°āc tăng lên

• VÃn chuyển vào chußi thćc ăn: PB có thể đ°āc vÃn chuyển từ môi tr°£ng vào chußi thćc ăn thông qua ccc lo¿i thực ph¿m biển Điều này có thể 愃ऀnh h°ßng đÁn ng°£i tiêu dùng khi há tiêu thă các s愃ऀn ph¿m từ biển

1.1.6 Nguyên nhân và thực tr¿ng ô nhißm paraben á thăy hÁi sÁn

Mát sá nghiên cću đã xcc nhÃn sự hián dián cąa PB trong các mặt hàng thực ph¿m khcc nhau, đặc biát tÃp trung vào các s愃ऀn ph¿m có ngußn gác từ biển [48, 50] Điều đcng chú ý là cc và h愃ऀi s愃ऀn nói chung d°£ng nh° là lo¿i thực ph¿m chính dß bß nhißm PB [46]

Do há sá Log Kow tr愃ऀi dài từ th¿p đÁn trung bình, tr¿ng thái không tích đián cąa ch¿t này có thể dß dàng đi qua màng phospholipid và tích lũy sinh hác trong các sinh vÃt [51] Mặc dù đã có bco cco về các PB đ°āc tìm th¿y trong các mô cąa đáng vÃt có vú ß biển [47], viác nghiên cću các hāp ch¿t m-PB trong cá biển ch°a đ°āc phá biÁn 4-HB đ°āc công nhÃn ráng rãi là ch¿t chuyển hóa cuái cùng cąa PB trong c¢ thể sáng [52] Tuy nhiên, crằng có các ch¿t chuyển hóa bá sung cąa PB đã đ°āc xcc đßnh, că thể là 3,4-DHB, OH-MeP và OH- EtP [25] Các ch¿t chuyển hóa này cũng đ°āc phân lo¿i là các hóa ch¿t gây rái lo¿n nái tiÁt mãi nái Mặc dù đã có ccc nghiên cću chćng minh sự hián dián cąa PB và m-PB trong sinh vÃt biển [18, 48, 53], hiểu biÁt cąa chúng ta về sự tích lũy sinh hác và mái t°¢ng quan giư뀃a PB và m-PB trong sinh vÃt biển vÁn còn h¿n chÁ

Viát Nam có b£ biển tr愃ऀi dài kho愃ऀng 3260 km, đóng vai tro quan tráng đái vãi ho¿t đáng kinh tÁ và phát triển cąa đ¿t n°ãc Du lßch biển đã đ°āc biÁt đÁn nh° mát đóng góp quan tráng cho sự tăng tr°ßng kinh tÁ cąa quác gia

do ng°£i dân đßa ph°¢ng thực hián, có kh愃ऀ năng t¿o ra ô nhißm có thể 愃ऀnh

h°ßng đÁn sćc khße con ng°£i thông qua viác tiêu thă h愃ऀi s愃ऀn, đặc biát là do sự hián dián cąa các hóa ch¿t gây rái lo¿n nái tiÁt trong sinh vÃt biển

1.1.7 Tình hình nghiên cąu trong và ngoài n°ớc

Trên thÁ giãi, các nghiên cću về nhóm ch¿t PB và dÁn xu¿t cąa chúng trong nền mÁu sinh vÃt biển ch°a nhiều, ch°a đa d¿ng về giáng loài và khu vực

Chunyang Liao và cộng sự [53] đã nghiên cću về hàm l°āng cąa sáu

PB (MeP, EtP, PrP, BuP, BzP, và HeP) cùng năm hāp ch¿t m-PB (4-HB, DHB, OH-MeP, OH-EtP, và BA) trong 186 mÁu nhuyßn thể đ°āc thu nhÃp t¿i vßnh Bát H愃ऀi, Trung Quác từ 2006 đÁn 2015 Các mÁu nhuyßn thể đ°āc xử lý bằng ph°¢ng phcp chiÁt SPE sau đó đ°āc tiÁn hành phân tích trên há tháng LC-ESI-MS/MS vãi chÁ đá MRM ion hóa âm (Multiple reaction monitoring) Cát phân tích đ°āc sử dăng là sự kÁt hāp cąa cát b愃ऀo vá Javelin (Betasil C18, 2,1 mm × 20 mm, 5 µm) và cát phân tích Zorbax SB-Aq (2,1 mm × 150 mm, 3,5 µm) Pha đáng đ°āc sử dăng là MeOH và dung dßch HCOOH 0,1% KÁt qu愃ऀ cho th¿y MeP và 4-HB là các hāp ch¿t đ°āc phát hián vãi hàm l°āng lãn nh¿t trong các PB và m-PB Hàm l°āng MeP dao đáng trong kho愃ऀng 1,38 3

trong kho愃ऀng 978 3 161000 ng/g dw) Nghiên cću cũng chỉ ra có tßn t¿i mái t°¢ng quan d°¢ng giư뀃a hai hāp ch¿t này

T°¢ng tự, Xiaohong Xue và cộng sự [48] cũng đã sử dăng ph°¢ng

pháp chiÁt mÁu SPE và ph°¢ng phcp phân tích LC-ESI-MS/MS vãi chÁ đá MRM ion hóa âm (Multiple reaction monitoring) để phân tích PB và m-PB trong các mÁu sinh vÃt biển Că thể, các PB và m-PB đ°āc tiÁn hành phân tích trong 167 mÁu mô cąa 35 lo¿i cá khác nhau thu thÃp t¿i Florida từ 2015 3 2016 Cát phân tích đ°āc sử dăng là sự kÁt hāp cąa cát b愃ऀo vá Javelin (Betasil C18, 2,1 mm × 20 mm, 5 µm) và cát phân tích Zorbax SB-Aq (2,1 mm × 150 mm, 3,5 µm) Pha đáng là MeOH và dung dßch CH3COOH 0,4% KÁt qu愃ऀ cho th¿y, MeP, và EtP là các hāp ch¿t PB phá biÁn nh¿t trong các mÁu cá Bên c¿nh đó, 4-HB và 3,4-DHB cũng là ch¿t m-PB đ°āc phát hián

vãi nßng đá cao nh¿t MeP và 4-HB trong nghiên cću này cũng đ°āc phát hián có mái t°¢ng quan d°¢ng vãi nhau

Luca Maria Chiesa và cộng sự [18] đã nghiên cću về hàm l°āng cąa

năm hāp ch¿t PB (MeP, EtP, PrP, BuP và BzP) và ch¿t chuyển hóa 4-HB trong mÁu cc đ°āc thu thÃp t¿i chā ß Milan Nghiên cću sử dăng ph°¢ng pháp chiÁt lßng 3 lßng kÁt hāp phân tích trên há tháng LC-Q-Orbitrap HRMS Đá thu hßi nằm trong kho愃ऀng 77% đÁn 118% Giãi h¿n phát hián (LOD) và

117,7 ng/g KÁt qu愃ऀ cho th¿y, MeP là PB duy nh¿t đßnh l°āng đ°āc vãi hàm l°āng dao đáng từ 0,8 3 32 ng/g, hàm l°āng trung bình đ¿t 6,4 ng/g MeP là ch¿t tan nhiều nh¿t trong n°ãc, do đó là PB đ°āc phát hián đ°āc trong mÁu cá vãi hàm l°āng cao nh¿t 4-HB là ch¿t đ°āc phát hián vãi hàm l°āng dao đáng từ 0,3 3 35660 ng/g Tuy nhiên, 4-HB không chỉ đ°āc t¿o ra qua quá trình chuyển hóa cąa PB, 4-HB còn tßn t¿i sẵn trong thực vÃt Do đó, hàm l°āng 4-HB vÁn thể hián sự khác biát theo loài và khu vực sinh sáng

Þ Viát Nam hián nay, gnhóm ch¿t PB và dÁn xu¿t cąa chúng trong đái t°āng sinh vÃt biển Các nghiên cću về nhóm ch¿t PB t¿i Viát Nam th°£ng tÃp trung vào các môi tr°£ng xung quanh nh° môi tr°£ng không khí, băi, đ¿t, n°ãc, mỹ ph¿m và thực ph¿m chćc năng [12, 13, 54, 55] Các nghiên cću về dÁn xu¿t cąa PB

Nhiều nghiên cću đã sử dăng ccc ph°¢ng phcp phân tích khcc nhau để xcc đßnh PB trong các mÁu thực ph¿m nh° ph°¢ng phcp đián di mao qu愃ऀn (CE), ph°¢ng phcp sắc ký khí (GC), ph°¢ng phcp sắc ký lßng (LC),

Nhóm nghiên cću cąa tác gi愃ऀ Usama A [56] đã sử dăng ph°¢ng phcp CE để phân tích bán PB phá biÁn là MeP, EtP, PrP và BuP trong sư뀃a mẹ và mát sá mÁu thực ph¿m khác MÁu đ°āc chiÁt tách sử dăng ph°¢ng phcp vi l°āng lßng 3 lßng phân tcn (DLLME), sau đó b¢m vào mcy đián di mao qu愃ऀn vãi detector UV-Vis t¿i b°ãc sóng 298 nm Giãi h¿n phát hián (LOD) cąa ph°¢ng phcp dao đáng từ 0,9 µg/mL (vãi EtP) đÁn giá trß cao nh¿t là 2,1 µg/mL (vãi MeP) Ph°¢ng phcp đián di mao qu愃ऀn có °u điểm tiÁt kiám hóa ch¿t và có thể phân tích đ°āc nhiều nhóm ch¿t khcc nhau Tuy nhiên, đái vãi nhóm ch¿t PB và m-PB, ph°¢ng phcp này có mát sá nh°āc điểm nh°: Đá tin cÃy, đá án đßnh ch°a tát; Kh愃ऀ năng phân gi愃ऀi cąa thiÁt bß không đą để phân tách các ch¿t phân tích có c¿u trúc t°¢ng tự nhau

Nhóm nghiên cću cąa tác gi愃ऀ Abdelmonaim Azzouz [57] đã sử dăng ph°¢ng phcp GC-MS/MS để xcc đßnh các hāp ch¿t gây rái lo¿n nái tiÁt trong đó có b愃ऀy PB phá biÁn (MeP, EtP, PrP, iPrP, BuP, iBuP và BzP) trong mÁu h愃ऀi s愃ऀn t¿i chā khu vực Bắc Phi MÁu đ°āc chiÁt sử dăng ph°¢ng phcp chiÁt hß trā siêu âm và chiÁt pha rắn tr°ãc khi tiêm vào há tháng GC-MS Giãi h¿n phát hián cąa ph°¢ng phcp đ¿t 0,5 3 20,0 ng/kg, đá thu hßi nằm trong kho愃ऀng từ 84 đÁn 105%

Nhóm nghiên cću cąa tác gi愃ऀ Jinling Yang [58] đã sử dăng ph°¢ng pháp phân tích HPLC-UV kÁt hāp vãi ph°¢ng phcp chiÁt phân tán pha lßng (MLPDE) để phân tích các hāp ch¿t MeP, EtP, PrP, BuP, iPrP và iBuP trong mát sá mÁu thực ph¿m rắn khcc nhau Quc trình phân tích đ°āc tiÁn hành trên cát sắc ký lßng ODS-SP (4,6 × 250mm, 5µm) ß 35°C Detector UV-Vis đ°āc cài đặt ß 254nm, thể tích b¢m mÁu ß 10 µL Pha đáng là hßn hāp dung môi MeOH : UPW (v/v, 70/30) Th£i gian phân tích mÁu kéo dài 7 phút KÁt qu愃ऀ phân tích cho th¿y, ß điều kián tái °u, đá thu hßi cąa các ch¿t phân tích đ¿t từ 93,7 đÁn 107,9% Đá lặp l¿i và đá tái lặp l5,22% Giãi h¿n phát hián (LOD) đ¿t từ 0,285 đÁn 1,122 mg/kg Ph°¢ng phcp sắc ký lßng hiáu năng cao vãi đ

hián cao, có thể có sự chßng chéo cąa các pic khi phân tích các nền mÁu phćc t¿p

Ph°¢ng phcp UPLC-MS/MS đã đ°āc mát nhóm tác gi愃ऀ Trung Quác [59] phát triển và xác nhÃn để xcc đßnh đßng th£i các PB gßm: MeP, EtP, PrP và BuP trong mÁu n°ãc t°¢ng đÃu nành Sau khi mÁu đ°āc chiÁt tách sử dăng ph°¢ng phcp chiÁt pha rắn, các PB đ°āc tách ra khßi nhau trên cát BEH C18 (100 mm × 2,1 mm × 1,7 µm) ß tác đá 0,4 mL/phút Pha đáng là dung dßch HCOOH 0,05% và MeOH Các hāp ch¿t này đã đ°āc phân tích thông qua quá trình ion hóa ESI ß chÁ đá ion hóa âm Hiáu su¿t thu hßi cąa ph°¢ng phcp đ¿t trên 83% vãi RSD nhß h¢n 8,78% Giãi h¿n phát hián (MDL) và giãi h¿n đßnh l°āng (MQL) cąa ph°¢ng phcp đ¿t l6,92 ng/mL

Nhóm tác gi愃ऀ Yue Zhao và cộng sự [60] đã tiÁn hành phân tích PrP và

ch¿t chuyển hóa 4-HB trong mÁu máu chuát bằng cách sử dăng ph°¢ng phcp phân tích LC-MS/MS vãi cát sắc ký lßng ACQUITY UPLC HSS T3 ß chÁ đá ion hóa âm Ph°¢ng phcp cho đá nh¿y, đá chính xcc, đá chán lác cao

Nhóm tác gi愃ऀ E.Wielogorska và cộng sự [61] đã tiÁn hành phân tích bán PB (MeP, EtP, PrP, BuP) và các hāp ch¿t rái lo¿n nái tiÁt khác trong mÁu sư뀃a Ph°¢ng phcp UHPLC-MS/MS sử dăng cát sắc ký lßng ACQUITY UPLC HSS T3 đ°āc sử dăng để phát triển và xác nhÃn giá trß sử dăng theo 2002/657/EC cho phgp đßng th£i chiÁt tcch, đßnh tính và đßnh l°āng 19 hāp ch¿t rái lo¿n nái tiÁt này Kho愃ऀng tuyÁn tính đ°āc xây dựng trong kho愃ऀng 0,5 3 20,0 µg/kg vãi há sá t°¢ng quan trên 0,99 Đá lặp l¿i và đá tái lặp đ°āc xác đßnh là 4,7% và 23,4%

Ccc ph°¢ng phcp trên có nhiều °u điểm khi đ°āc áp dăng để phân tích PB, tuy nhiên gặp nhiều khó khăn khi ćng dăng vãi các hāp ch¿t chuyển hóa cąa chúng Đặc tr°ng cąa các PB và m-PB là có c¿u trúc hāp ch¿t đ¢n gi愃ऀn, t°¢ng tự nhau (ít nhóm chćc hóa hác), và có tính phân cực Từ đó, gây khó khăn trong viác lựa chán thiÁt bß phân tích có đá nh¿y, đá án đßnh và đá chính xác cao

Dựa theo tài liáu tham kh愃ऀo, ch¿t phân tích và điều kián thực tÁ t¿i phòng thí nghiám, chúng tôi lựa chán ph°¢ng phcp UHPLC 3 Q Orbitrap

HRMS để phân tích các hāp ch¿t PB và m-PB Viác sử dăng đphân gi愃ऀi cao (HRMS) cho phép xác đßnh đ°āc khái l°āng chính xác cąa các ion phân tử, làm tăng hiáu qu愃ऀ phân tích do đá chán lác, đá đặc hiáu và đá phân gi愃ऀi cao

Trong nghiên cću này, quy trình xcc đßnh hàm l°āng PB và m-PB đ°āc tiÁn hành kh愃ऀo sát trên cát sắc ký lßng Acquity UPLC HSS T3 (100 × 2,1 mm i.d., 1,8 µm) ghép nái vãi cát b愃ऀo vá Acquity UPLC HSS T3 VanGuard (5 × 2,1 mm i.d., 1,8 µm) (Waters) và há tháng sắc ký lßng hiáu năng Thermo Liquid Ultimate 3000 RS UHPLC (Dionex) ghgp nái đExactive™ Focus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ ( Thermo Scientific)

Hình 1.3: Giao diện hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng Thermo Liquid Ultimate 3000 RS UHPLC (Dionex) gh攃Āp nối đầu do khối phऀ Q Exactive™ Focus

Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ ( Thermo Scientific)

1.2.1 Há thçng sắc ký lång

Vãi sự tiÁn bá không ngừng cąa khoa hác và công nghá, đã xu¿t hián nhiều há tháng sắc ký lßng hiáu năng cao trên thß tr°£ng Các há tháng tiên tiÁn đã đ°āc phát triển để khắc phăc nhiều h¿n chÁ cąa các thiÁt bß thÁ há tr°ãc, bao gßm đá trß dung môi, áp su¿t ho¿t đáng ngày càng cao, và viác rút ngắn th£i gian phân tích Trong nghiên cću này, há tháng UHPLC sử dăng là há tháng sắc ký lßng siêu hiáu năng Thermo Liquid UltiMate 3000 RS UHPLC (Dionex) vãi hai b¢m dung môi

1.2.2 Há thçng khçi phá

Hình 1.4: Cấu tạo hệ Q Exactive Focus

Há tháng phân tích khái phá Q Exactive Focus sử dăng c¿u trúc kÁt hāp giư뀃a tć cực và bá phân tích khái Orbitrap Đây là mát sự khác biát lãn so vãi các há tháng phân tích khái ba tć cực thông th°£ng Đái vãi há ghép nái này, c°£ng đá ion s¿ đ°āc tăng lên đcng kể do đ°āc bÁy tín hiáu t¿i bá phân tích khái Orbitrap S¢ đß c¿u t¿o cąa há tháng Q Exactive Focus đ°āc thể hián ß hình 1.4

Trong há tháng này, sau khi ch¿t phân tích đ°āc ion hóa, dung dßch ch¿t lßng đ°āc phun s°¢ng từ áng capillary bằng áp su¿t r¿t cao Các h¿t s°¢ng khi r£i khßi đmặt D°ãi tcc đáng cąa sự chênh lách áp su¿t giư뀃a bußng ion hóa và bá phân tích khái ß áp su¿t chân không, các h¿t s°¢ng nhß s¿ di chuyển theo transfer

tube đÁn bá phÃn S-len Transfer tube có vai trò dÁn truyền h¿t s°¢ng từ bußng ion hóa đÁn bá phân tách khái tć cực và đßng th£i t¿o điều kián để h¿t s°¢ng hóa h¢i S-lens, là mát lá thép mßng có tính dÁn đián cao, án đßnh dòng ion và đßnh h°ãng chúng vào bá phân tách khái tć cực

T¿i bá phÃn tć cực, dựa vào đián từ có thể điều chỉnh, ion vừa di chuyển vừa xoay Điều này cho phép chán lựa m/z mong muán và lo¿i bß các ion không mong muán Bằng cách sử dăng há tháng C-trap và Orbitrap, ion đ°āc bÁy l¿i trong mát kho愃ऀng th£i gian xcc đßnh để tăng đá tín hiáu Orbitrap, vãi c¿u trúc hình thoi đác đco, t¿o điều kián cho viác phân tích khái phá vãi đá chính xcc cao Ion sau khi đ°āc bÁy l¿i ß C-trap di chuyển đßng lo¿t đÁn Orbitrap, n¢i lực h¿p dÁn tĩnh đián giư뀃 chúng trong quỹ đ¿o xoắn ác, t¿o điều kián cho viác phân tích chính xác dựa trên m/z Từ đó, do khcc biát về m/z giư뀃a các ion, dÁn đÁn sự khác nhau giư뀃a ccc góc quay ω nên có thể phân tích khái phá vãi đá chính xác cực kì cao

Dựa vào đá chính xác cao cąa khái phá Q Exactive Focus, không ctr愃ऀi qua quá trình bắn phá t¿o ion con cho viác đßnh danh và đßnh l°āng, nên há tháng khái phá này phù hāp để có thể phân tích các hāp ch¿t có c¿u trúc t°¢ng tự nhau nh° PB và m-PB Do đó, chúng tôi sử dăng há tháng khái phá Q Exactive Focus trong nghiên cću này

Hình 1.5: Cột sắc ký Acquity HSS T3

Cát sắc ký đ°āc sử dăng trong nghiên cću này là cát sắc ký Acquity HSS T3 Cát sắc ký lßng HSS T3 (High Strength Silica, Type C3) là mát lo¿i

cát đ°āc sử dăng trong ph°¢ng phcp sắc ký lßng hiáu năng (HPLC) và siêu hiáu năng (UHPLC) để tách và phân tích hāp ch¿t hư뀃u c¢ Cát HSS T3 th°£ng đ°āc sử dăng cho phân tích các hāp ch¿t có tính ch¿t phân cực và chúng đ°āc dựa vào t°¢ng tcc pha tĩnh-ch¿t phân tích

C¿u trúc cąa cát HSS T3 dựa trên vÃt liáu pha tĩnh là silica gel có đặc tính cao c¿p, đ°āc chćc năng hóa để t¿o ra sự phân cực và t°¢ng tcc vãi các ch¿t có tính ch¿t phân cực Sự chćc năng hóa cąa silica gel trên cát này t¿o ra kh愃ऀ năng tcch biát và phân tách hiáu qu愃ऀ đái vãi các hāp ch¿t hư뀃u c¢

Cát HSS T3 th°£ng đ°āc sử dăng trong các ćng dăng phân tích phćc t¿p nh° phân tích d°āc ph¿m, hóa d°āc, và nhiều ćng dăng khcc Đặc điểm chung cąa cát HSS T3 bao gßm kh愃ऀ năng tcch biát các hāp ch¿t có đá phân cực khác nhau và kh愃ऀ năng giư뀃 mát t°¢ng tcc m¿nh vãi các ch¿t phân tích

1.3 PH¯¡NG PHÁP XĀ LÝ MÀU

1.3.1 Ph°¢ng pháp xā lý mÁu QuEChERS

QuEChERS là tên viÁt tắt cąa căm từ Quick 3 Easy 3 Cheap 3 Effective 3 Rugged - Safe Tiêu chí cąa ph°¢ng phcp là Nhanh - Dß - Rẻ - Hiáu qu愃ऀ - àn đßnh 3 An toàn

Ph°¢ng phcp chiÁt này đ°āc phát triển đAnastassiades và Steven J Lehotay t¿i USDA/ARS-ERRC ß Wyndmoor/Pennsylvania, Mỹ Kể từ khi ra đ£i vào năm 2003, ph°¢ng phcp này đã đ°āc c愃ऀi tiÁn liên tăc, tăng hiáu su¿t chiÁt và kh愃ऀ năng ćng dăng trên ccc nền mÁu khcc nhau Ccc ph°¢ng phcp tiêu chu¿n Châu Âu EN 15662.2008 và AOAC 2007.01 đã đ°āc phát triển mát phnày Ph°¢ng phcp sử dăng r¿t ít mÁu, hāp ch¿t đác h¿i, năng l°āng và t¿o ra ít ch¿t th愃ऀi ¯u điểm cąa ph°¢ng phcp là nh£ tính linh ho¿t cao, bßi nó có thể thay đái để phù hāp vãi đặc tính cąa ch¿t phân tích, thành phbß và kỹ thuÃt phân tích có sẵn trong phòng thí nghiám Đó là lý do t¿i sao ph°¢ng phcp QuEChERS đặc biát phá biÁn trong viác xcc đßnh nhiều lo¿i hāp ch¿t hư뀃u c¢ từ các nền mÁu khác nhau chẳng h¿n nh° rau cą, n°ãc trái cây, cc, mÃt ong, thuác lc, r°āu vang, trćng, sư뀃a, sư뀃a chua, thßt bo, n°ãc, tr

tích và đ¿t [62] QuEChERS đã đ°āc ch¿p nhÃn trên toàn cph°¢ng phcp xử lý mÁu đcng tin cÃy để phân tích mÁu sinh vÃt

Nhìn chung ccc nghiên cću th°£ng tái °u hóa ccc b°ãc nh° hydrate hóa mÁu, kích th°ãc mÁu, dung môi chiÁt và thể tích dung môi, khái l°āng NaCl và MgSO4 và viác sử dăng ccc ch¿t h¿p phă khcc nhau trong b°ãc d-

SPE

1.3.2 Ph°¢ng pháp xā lý mÁu SPE

Hình 1.6: Quá trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)

SPE là mát trong như뀃ng ph°¢ng phcp phá biÁn đ°āc sử dăng để tách và làm giàu các hāp ch¿t hư뀃u c¢ trong mÁu n°ãc hoặc thực ph¿m, đßng th£i

gi愃ऀn, tác đá thực hián nhanh chóng và kh愃ऀ năng tÃp trung ch¿t phân tích mát cách hiáu qu愃ऀ Có hai h°ãng chính khi sử dăng SPE: lựa chán pha tĩnh giúp l°u giư뀃 chán lác ch¿t phân tích, hoặc lựa chán pha tĩnh có kh愃ऀ năng l°u giư뀃 chặt nền mÁu

Trong tr°£ng hāp sử dăng pha tĩnh nhằm măc đích l°u giư뀃 ch¿t phân

vào cát chiÁt pha rắn Quá trình ho¿t hóa pha tĩnh bằng dung môi phù hāp đ愃ऀm b愃ऀo rằng chỉ có các hāp ch¿t phân tích s¿ t°¢ng tcc và bcm vào pha tĩnh

trong quá trình t愃ऀi mÁu qua cát Điều này đ愃ऀm b愃ऀo rằng không có m¿t mÁu x愃ऀy ra trong quá trình xử lý Trong suát quá trình chiÁt pha rắn, dung dßch mÁu đ°āc t愃ऀi qua cát khi vÃt liáu pha tĩnh đã tr愃ऀi qua giai đo¿n ho¿t hóa vãi dung môi thích hāp d°ãi tcc đáng cąa tráng lực hoặc dùng áp su¿t th¿p Lúc

tĩnh Sau quc trình t愃ऀi mÁu qua cát, ch¿t c愃ऀn nhißu cquá trình rửa t¿p bằng cách sử dăng dung môi thích hāp để rửa cát Cuái cùng ch¿t phân tích đ°āc đ°āc rửa gi愃ऀi bằng dung môi thích hāp và đ°āc tiÁn hành phân tích

Trong tr°£ng hāp thć hai, măc tiêu là l°u giư뀃 t¿p ch¿t cąa nền mÁu Quá trình ho¿t hóa pha tĩnh tr°ãc khi t愃ऀi mÁu qua cát chiÁt pha rắn là quan tráng Sau khi dung dßch mÁu đ°āc t愃ऀi qua cát, nền mÁu và mát phphân tích s¿ bß l°u giư뀃 trên pha tĩnh L°āng ch¿t phân tích còn l¿i sau quá trình này s¿ đ°āc rửa gi愃ऀi bằng dung môi thích hāp để đ愃ऀm b愃ऀo thu hßi hoàn toàn ch¿t phân tích và tái thiểu nền mÁu đ°āc rửa gi愃ऀi Trong tr°£ng hāp này,

vãi các thành phpha tĩnh không nên l°u giư뀃 hoặc l°u giư뀃 r¿t yÁu ch¿t phân tích, để đ愃ऀm b愃ऀo rằng ch¿t phân tích đ°āc rửa gi愃ऀi hiáu qu愃ऀ và thu hßi đ

1.3.2.1 Vật liệu Primary Secondary Amine (PSA)

Hình 1.7: Cấu trúc vật liệu PSA

VÃt liáu h¿p phă PSA t°¢ng tự vÃt liáu h¿p phă NH2, cung c¿p c愃ऀ c¢ chÁ l°u giư뀃 trao đái anion và pha thông th°£ng Do có sự tßn t¿i cąa các

nhóm amin bÃc mát và bÃc hai (có giá trß pKa lcó kh愃ऀ năng trao đái ion cao h¢n và liên kÁt hydro m¿nh h¢n Ngoài ra, PSA có thể t¿o phćc chelate vãi mát sá ion kim lo¿i và do đó có thể đ°āc sử dăng để làm giàu chúng Do PSA có sá l°āng cacbon nhiều h¢n đcng kể so vãi hhÁt các ch¿t h¿p thă có nhóm chćc amin, do đó là sự lựa chán tát h¢n cho ccc hāp ch¿t phân cực nh° PB và m-PB

1.3.2.2 Vật liệu Enhanced Matrix Removal (EMR)

Captiva EMR-Lipid cąa Agilent là mát b°ãc tiÁn trong lĩnh vực xử lý mÁu‚ thay thÁ cho các lo¿i QuEChERS d-SPE truyền tháng trong viác lo¿i bß lipid ra khßi nền mÁu‚ từ đó c愃ऀi thián đá lặp l¿i‚ đá tin cÃy cąa kÁt qu愃ऀ phân tích cũng nh° tăng tuái thá cąa máy sắc ký

Captiva EMR-Lipid có kh愃ऀ năng lo¿i bß lipid mát cách chán lác‚ không làm th¿t thoát ch¿t phân tích Công nghá chÁ t¿o ch¿t h¿p phă EMR-Lipid tiên tiÁn vãi sự kÁt hāp giư뀃a: Đặc tính lo¿i trừ kích th°ãc giúp ch¿t h¿p phă không giư뀃 l¿i ch¿t phân tích; T°¢ng tcc kỵ n°ãc giư뀃a ch¿t h¿p phă vãi các chußi lipid giúp giư뀃 l¿i hoàn toàn lipid

C¢ chÁ kgp đác đco này tái °u hóa quc trình lo¿i bß lipid và thu hßi ch¿t phân tích‚ đặc biát đái vãi các nền mÁu phćc t¿p Vì vÃy‚ Captiva EMR-Lipid đ°āc sử dăng ráng rãi trong quá trình xử lý dßch chiÁt mÁu giàu t¿p béo (thực ph¿m‚ thćc ăn chăn nuôi )

CH¯¡NG 2 ĐæI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 2.1 ĐæI T¯þNG, MĀC TIÊU VÀ NÞI DUNG NGHIÊN CĄU

2.1.1 Đçi t°ÿng nghiên cąu

Nghiên cću này đ°āc thực hián trên ccc đái t°āng bao gßm 5 loài cá phá biÁn và 1 loài đáng vÃt hai m愃ऀnh vß đ°āc thu thÃp từ chā cc đßa ph°¢ng t¿i các tỉnh thành ß các vùng miền khác nhau cąa Viát Nam, bao gßm H愃ऀi Phòng, Qu愃ऀng Ninh, Nam Đßnh, Đà Nẵng, Bình Đßnh, Phú Yên, Khánh Hòa, Bà Rßa-Vũng Tàu, Thành phá Hß Chí Minh và Tiền Giang

2.1.2 Māc tiêu nghiên cąu

Nghiên cću và phân tích đßng th£i 7 hāp ch¿t PB và 4 dÁn xu¿t là các ch¿t chuyển hóa cąa chúng trong các loài sinh vÃt biển đ°āc thu thÃp t¿i các tỉnh thành khác nhau dác vùng biển Viát Nam bằng ph°¢ng phcp sắc ký lßng hiáu năng cao ghgp nái khái phá phân gi愃ऀi cao UHPLC-HRMS

2.1.3 Nßi dung nghiên cąu

− Nghiên cću quy trình xử lý mÁu

− Xác nhÃn giá trß sử dăng cąa ph°¢ng phcp

− Áp dăng ph°¢ng phcp đã nghiên cću vào phân tích mÁu cc và đáng vÃt hai m愃ऀnh vß

− Xử lý và đcnh gic bá sá liáu thu đ°āc

2.2 THIÀT Bà, DĀNG CĀ, HÓA CHÂT 2.2.1 ThiÁt bá, dāng cā

❖ Há tháng UHPLC-Q-Orbitrap HRMS bao gßm: − Há tháng Ultimate 3000+ UHPLC

− B¢m UltiMate 3000 RS pump

− Bá tiêm mÁu tự đáng UltiMate Autosampler − Há điều nhiát UltiMate column combartment

− Đ− Cát sắc ký lßng Water Acquity UPLC HSS T3 (100 × 2,1 mm i.d., 1,8 µm) (Waters) ghép nái vãi cát b愃ऀo vá Water Acquity UPLC HSS T3 VanGuard (5 × 2,1 mm i.d., 1,8 µm)

❖ ThiÁt bß xử lý mÁu

− Máy vortex (VELP Scientifica, MB, Italy) − Máy ly tâm (UNIVERSAL 320, Hettich, Đćc) − Bể siêu âm (Elma S300H, Singen, Đćc)

− Bá thái khí Nitrogen (Eyela, Tokyo, NhÃt B愃ऀn) − Bá chiÁt pha rắn Agilent (CA, USA)

− Tą s¿y (Memmert, Đćc) − B¢m hút áp su¿t

− Cân phân tích miligram, chính xcc đÁn 0.0001g (Sartorius, Đćc) − Micropipet, lo¿i 5 3 50 μL, 20 3 200 μL, 10 3 1000 μL, 100 μL

− Màng lác polytetrafluoroethylene (PTFE) 0,22 μm (CNW, Trung Quác)

− Màng lác cellulose acetate 0,45 µm (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Đćc)

2.2.2 Hóa chÃt

Thông tin về các lo¿i ch¿t chu¿n gác đ°āc sử dăng để thực hián luÃn văn đ°āc trình bày trong b愃ऀng 2.2

Bảng 2.1: Thông tin các chất chuẩn và nội chuẩn

khiÁt

Hãng sÁn xuÃt

Ch¿t chu¿n 1 Methylparaben (MeP)

>98%

Aldrich, St Louis, MO,

Sigma-USA 2 Ethylparaben (EtP)

3 Propylparaben (PrP) 4 Iso-propylparaben (iPrP) 5 Butylparaben (BuP) 6 Benzylparaben (BzP) 7 Heptylparaben (HeP)

8 Methyl protocatechuate (OH-MeP) 9 Ethyl protocatechuate (OH-EtP) 10 4-hydroxybenzoic acid (4-HB) 11 3,4-dihydroxybenzoic acid (3,4-

DHB)

Nái chu¿n 12 13C Methylparaben (13C-MeP)

>98%

Aldrich, St Louis, MO,

Sigma-USA 13 13C Butylparaben (13C-BuP)

14

13C 4-hydroxybenzoic acid (13HB)

C-4-Các hóa chất khác:

− Methanol (MeOH) (>99%, Merck, Darmstadt, Đćc) − Acetonitrile (ACN) (>99%, Merck, Darmstadt, Đćc) − Toluene (>99%, Merck, Darmstadt, Đćc)

− Acid acetic băng (AA, >99.5%, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)

− Natri clorua (NaCl) (>99.0%, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)

− Magie sulfat khan (MgSO4) (>99.5%, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)

− Cát chiÁt pha rắn Captiva EMR-Lipid (EMR, 600 mg, 6 mL) (Agilent, California, USA)

− Cát chiÁt pha rắn Bond Elut PSA (PSA, 500 mg, 6 mL) (Agilent, California, USA)

− N°ãc c¿t lo¿i ion (UPW) đ°āc lác từ há tháng Milli-Q Integral (Merck Millipore, Đćc) dùng để chu¿n bß pha đáng và hßn hāp dung môi pha chu¿n

2.3 CHU¾N Bà HÓA CHÂT, DUNG MÔI PHA ĐÞNG 2.3.1 Chu¿n bá pha đßng

− Pha đáng A: UPW + 5% ACN + 0,05% AA L¿y kho愃ऀng 500 mL n°ãc c¿t lo¿i ion vào bình đßnh mćc 1000 mL Dùng pipet thąy tinh hút 50 mL ACN và micropipet hút 500µL acid acetic đÃm đặc vào bình đßnh mćc Đßnh mćc bằng n°ãc lo¿i ion đÁn v¿ch 1000 mL, lắc đều Sử dăng bá lác dung môi vãi màng lác cellulose acetate 0,45 µm để lác dung dßch vừa pha, chuyển dung dßch vừa lác sang bình chća pha đáng s¿ch, đÃy nắp h£, rung siêu âm dung dßch trong 30 phút

− Pha đáng B: ACN + 5% UPW L¿y kho愃ऀng 500 mL ACN vào bình đßnh mćc 1000 mL Dùng pipet thąy tinh hút 50 mL UPW vào bình đßnh mćc Đßnh mćc bằng ACN đÁn v¿ch 1000 mL, lắc đều Sử dăng bá lác dung môi vãi màng lác cellulose acetate 0,45 µm để lác dung dßch vừa pha, chuyển dung dßch vừa lác sang bình chća pha đáng sach, đÃy nắp h£, rung siêu âm dung dßch 30 phút

2.3.2 Chu¿n bá hóa chÃt

− Dung dßch ACN (1% AA): L¿y kho愃ऀng 500 mL ACN vào bình đßnh mćc 1000 mL Dùng pipet thąy tinh hút 10 mL acid acetic đÃm đặc cho vào bình đßnh mćc Đßnh mćc bằng ACN đÁn v¿ch 1000 mL, lắc đều

− Hßn hāp muái 4g MgSO4, 1g NaCl: sử dăng cân phân tích 4 sá cân 4g MgSO4 và 1g NaCl cho vào áng ly tâm 50 mL, lắc đều

2.3.3 Chu¿n bá các dung dách chu¿n

Các dung dßch chu¿n làm viác đ°āc chu¿n bß từ dung dßch chu¿n gác vãi dung môi pha loãng là MeOH Các dung dßch chu¿n để dựng đ°£ng chu¿n đ°āc chu¿n bß từ các dung dßch chu¿n làm viác và MeOH : UPW (1:1, v:v), các dung dßch này đ°āc pha và b愃ऀo qu愃ऀn trực tiÁp trong vial thąy tinh trong tą l¿nh -20°C, thể tích cąa các dung dßch thành phtính toán là l¿y chính xác bằng micropipet Dung dßch ch¿t chu¿n đcnh d¿u đßng vß 13C12 1 mg/L dùng để làm ch¿t đßng hành đ°āc pha trong bình đßnh mćc 10 mL Cách chu¿n bß các dung dßch chu¿n đ°āc trình bày d°ãi đây:

2.3.3.1 Chuẩn gốc (C0)

Các dung dßch chu¿n gác có nßng đá 1000 mg/L đ°āc pha trong dung môi MeOH: cân chính xác 10.0 mg ch¿t rắn cąa 11 ch¿t (MeP, EtP, PrP, iPrP, BuP, HeP, BzP, OH-MeP, OH-EtP, 4-HB, 3,4-DHB) hoa tan và đßnh mćc 10 mL bằng MeOH Lắc đều để hòa tan chu¿n

Chu¿n đ°āc b愃ऀo qu愃ऀn trong lá tái màu, qu¿n kĩ bằng parafilm tránh bay h¢i dung môi và ß -20oC

2.3.3.2 Chuẩn trung gian (Cmix 50 mg/L)

Dung dßch chu¿n trung gian Cmix 50 mg/L chća 11 ch¿t PB có nßng đá 50 mg/L đ°āc pha trong dung môi MeOH: Rút 500 µL dung dßch chu¿n gác có nßng đá 1000 mg/L cąa mßi ch¿t cho vào bình đßnh mćc 10 mL chća sẵn mát ít MeOH, sau đó đßnh mćc lên chính xác 10 mL bằng MeOH ĐÃy nắp, lắc đều

Chu¿n đ°āc b愃ऀo qu愃ऀn trong lá tái màu, qu¿n kĩ bằng parafilm tránh bay h¢i dung môi và ß -20oC

2.3.3.3 Chuẩn trung gian (Cmix 1 mg/L)

Dung dßch chu¿n trung gian Cmix 1 mg/L chća 11 ch¿t PB có nßng đá 1 mg/L đ°āc pha trong dung môi MeOH: Rút 200 µL dung dßch chu¿n gác có

nßng đá 50 mg/L cąa mßi ch¿t cho vào bình đßnh mćc 10 mL chća sẵn mát ít MeOH, sau đó đßnh mćc lên chính xác 10 mL bằng MeOH, đÃy nắp và lắc đều

Chu¿n đ°āc b愃ऀo qu愃ऀn trong lá tái màu, qu¿n kĩ bằng parafilm tránh bay h¢i dung môi và ß -20oC

2.3.3.4 Dãy chuẩn làm việc

Xây dựng đ°£ng chu¿n dung môi vãi 7 điểm chu¿n có nßng đá trong kho愃ऀng 1 3 100 µg/L Chu¿n làm viác đ°āc pha trong dung môi là MeOH : H2O (1:1, v:v) Cách pha dung dßch chu¿n làm viác đ°āc trình bày nh° b愃ऀng 2.3:

Bảng 2.2: Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc

Chu¿n làm viác

Nßng đß chu¿n làm viác (µg/L)

Chu¿n dùng

đÅ pha Vhút (µL)

Vđánh mąc(µL)

2.4 NÞI DUNG NGHIÊN CĄU

2.4.1 Ph°¢ng pháp thu thÃp, xā lý s¢ bß và bÁo quÁn mÁu

Nghiên cću này đ°āc thực hián trên bá dư뀃 liáu bao gßm 111 mÁu sinh vÃt biển Các mÁu bao gßm các loài khác nhau, că thể là cc b¢n ngá

(Psettodes erumei, BN, n = 19), cá b¿c má (Rastrelliger kanagurta, BM, n =

19), cá há (Trichiurus lepturus, H, n = 16), cá chỉ vàng (Selaroides leptolepis,

CV, n = 19), cá chim trắng (Pampus argenteus, CT, n = 19), và ngao

(Meretrix lyrata, N, n=19) Các mÁu sinh vÃt đ°āc thu thÃp từ các chā cá ß