NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN VIBRIO CỦA VI KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ RUỘT TÔM

Kỹ Thuật - Công Nghệ - Nông - Lâm - Ngư - Y dược - Sinh học 1 UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA: LÝ – HÓA - SINH ---------- PHẠM THỊ THÙY TRÂM N T N ỌN N BACILLUS Ả N NG VIBRIO G N T KHÓA LU N TỐT NGHI ĐẠI HỌC Quảng Nam, tháng 4 năm 2015 2 UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠ Ọ Q ẢNG NA KHOA: LÝ – HÓA – SINH ---------- KHÓA LU N TỐT NGHI ĐẠI HỌC Tên đề tài: N T N ỌN N BACILLUS Ả N NG VIBRIO G N T Sinh viên thực hiện Ạ T Ị T TR MSSV: 2111012752 ÊN NG N : Ư ẠM SINH - KTNN KHÓA 2011 - 2015 Cán bộ hướng dẫn T AN T Ị T AN MSCB: T35-15111-21878 ảng m, tháng 4 năm 2015 3 LỜ A ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫ n của cô Thạc sĩ Phan Thị Thanh Diễm. Các số liệu và kết quả nêu trong sskhóa luận tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. Sinh viên thực hiện PHẠM THỊ THÙY TRÂM 4 LỜI CẢ ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự nỗ lực, cố gắng của bả n thân còn có sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của quý thầy cô, sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt quá trình tôi thực hiện nghiên cứu. Qua đây, cho phép tôi bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất đến cô giáo Thạc sĩ Phan Thị Thanh Diễm là giáo viên hướng dẫn đã định hướng, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành đề tài khóa luận này. Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo nhà trường của trường Đại học Quảng Nam đã tạo điều kiện cho tôi mượn phòng thí nghiệm Sinh Học gồm có các máy móc, thiết bị cầ n thiết cho đề tài để tôi có thể tiến hành nghiên cứu đề tài một cách thuận lợi. Bên cạnh đó, tôi cũng xin cảm ơn hai người bạn cùng nghiên cứu với tôi đã hỗ trợ cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm. Cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô đã dành thời gian để đọ c, nhận xét và chấm điểm luận văn này để giúp cho Luận văn tốt nghiệp của tôi có thể hoàn chỉnh hơn. Do hạn chế về khả năng và thời gian nghiên cứu nên đề tài của tôi vẫ n còn nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô giáo để tôi hoàn thiện hơn đề tài nghiên cứu của mình. Xin chân thành cảm ơn. Sinh viên thực hiện PHẠM THỊ THÙY TRÂM 5 MỤC LỤC PHẦN 1. MỞ ĐẦU .........................................................................................................1 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu. ..........................................................................16 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu. ...........................................................................................16 1.2.2. Nội dung. .............................................................................................................16 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. .........................................................................16 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu. .........................................................................................16 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu. ............................................................................................ 17 1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. .........................................................................17 1.4.1. Địa điểm. .............................................................................................................17 1.4.2. Thời gian. .............................................................................................................17 1.5. Phương pháp nghiên cứu. .......................................................................................17 PHẦN 2. NỘI DUNG ....................................................................................................18 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................18 1.1. Ngành thủy sản. ......................................................................................................18 1.1.1. Tổng quan ngành thủy sản. ..................................................................................18 1.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam. .........................................................................18 1.2. Tình hình dịch bệnh ở tôm, nguyên nhân và phương pháp giải quyết. ..................19 1.2.1. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi. .....................................................................19 1.2.2. Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản. ......................21 1.2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio. .........................................................................21 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản. ..............21 1.2.3. Một số bệnh điển hình ở trong qua trình nuôi tôm. ............................................22 1.2.3.1. Bệnh thân đỏ đốm trắ ng (SEMBV - Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus)...................................................................................................................22 1.2.3.2. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV). ............................................................... 23 1.2.3.3. Bệnh đầu vàng (YHD - Yellow Head Disease). ...............................................23 1.2.3.4. Bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm. ........................................................................24 1.2.4. Các phương pháp xử lý........................................................................................24 1.2.4.1. Phương pháp phòng bệnh. ................................................................................24 6 1.2.4.2. Phương pháp trị bệnh. ......................................................................................25 1.3.1. Khái niệm Probiotic. ............................................................................................ 26 1.3.2. Tác dụng của probiotic. .......................................................................................27 1.3.2.1. Tăng cường khả năng tiêu hóa. ........................................................................27 1.3.2.2. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa. ................................................27 1.3.2.3. Kích thích hệ miễn dịch ....................................................................................28 1.3.2.4.. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose. .......................................................................................................................................28 1.3.2.5. Sinh tổng hợp ra các chất kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến. .........29 1.3.2.6. Một số tác dụng khác ........................................................................................29 1.3.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng probiotic trong nuôi tôm trên thế giới và Việ t Nam. .............................................................................................................................. 29 1.4. Vi khuẩn Bacillus. ..................................................................................................31 1.4.1. Vị trí phân loại. ....................................................................................................31 1.4.2. Đặc điểm sinh học. .............................................................................................. 31 1.4.3. Một số loại Bacillus thường gặp trong tự nhiên. .................................................32 1.4.3.1. Bacillus subtilis. ............................................................................................... 32 1.4.3.2. Bacillus megaterium. ........................................................................................33 1.4.3.3. Bacillus mensentericus. ....................................................................................33 1.4.3.4. Bacillus cereus..................................................................................................34 1.4.3.5. Bacillus pumilu. ................................................................................................ 34 1.4.3.6. Bacillus polymyxa ............................................................................................. 34 1.4.3.7. Bacillus brevis. .................................................................................................34 1.4.3.8. Bacillus simplex. ............................................................................................... 35 1.4.3.9. Bacillus linchenniformis. ..................................................................................35 1.4.4. Một số ứng dụng của vi khuẩn thuộc chi Bacillus. .............................................35 1.4.4.1. Cải thiện sức khỏe. ...........................................................................................35 1.4.4.2. Cải thiện môi trường.........................................................................................36 1.4.5. Lợi thế khi chọn Bacillus làm chế phẩm sinh học...............................................38 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 40 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu. ..............................................................................40 7 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................. 40 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu. ...........................................................40 2.1.2.1. Dụng cụ.............................................................................................................40 2.1.2.2. Thiết bị. .............................................................................................................40 2.1.2.3. Hóa chất. ...........................................................................................................40 2.1.2.3. Môi trường. .......................................................................................................40 2.2. Phương pháp nghiên cứu. .......................................................................................41 2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ ruột tôm. ....................................41 2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn. ...................................42 2.2.3. Hoạt hóa các chủng vi khuẩn...............................................................................42 2.2.4. Phương pháp nhân giống. ....................................................................................42 2.2.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường dịch thể. .....42 2.2.6. Xác định khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. 43 2.2.6.1. Phương pháp cấy đường chữ thập trên môi trường thạch đĩa. .........................43 2.2.6.2. Phương pháp xác định vòng vô khuẩn trên môi trường thạch. ........................43 2.2.8. Phương pháp xác định khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn Vibrio trên môi trường dịch thể. ............................................................................................... 44 2.2.9. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus spp. trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. ........................................................................................45 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ............................................................... 46 3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ mẫu ruột tôm. .......................46 3.1.2. Kết quả kiểm tra bằng phản ứng catalaza. ...........................................................47 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn. .........................................49 3.3. Hoạt hóa các chủng vi khuẩn..................................................................................52 3.4. Số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường dịch thể. .............................................53 3.5. Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đã đượ c phân lập..........................................................................................................................54 3.5.1. Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đã đượ c phân lập bằng phương pháp cấy chữ thập. ....................................................................55 3.5.2. Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đã đượ c phân lập bằng phương pháp xác định vòng vô khuẩn trên môi trường thạch đĩa. ........57 8 3.6. Khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đã tuyển chọ n. .......................................................................................................................................63 3.7. Khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn Vibrio trên môi trường dịch thể . .......................................................................................................................................64 PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. ......................................................................69 1.1. Kết luận...................................................................................................................69 1.2. Kiến nghị. ...............................................................................................................69 PHẦN 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................71 9 DANH MỤC CÁC TỪ VI T TẤT Chữ viết tắt Ý ng ĩa ĐBSCL Đồng bằng song Cửu Long NA1,5 Nutrient Agar 1,5. NB Môi trường Nutrient Broth SEMBV Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus MBV Monodon Baculovirus YHD Yellow Head Disease 10 DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệ u bảng Tên bảng Trang 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp. đã phân lập. 35 3.2. Số lượng tế bào của Vibrio và Bacillus spp. trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu. 39 3.3. Nuôi chấm điểm các chủng Bacillus spp. sau 24h và vi khuẩn Vibrio. 43 3.4 Nuôi chấm điểm các chủng Bacillus spp. sau 48h và vi khuẩn Vibrio. 46 3.5 Khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. 49 3.6 Số lượng tế bào các chủng Bacillus spp. trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 42 11 DANH MỤC CÁC BI ĐỒ Số hiệu đồ thị Tên đồ thị Trang 3.1. Số lượng các chủng vi khuẩn trong 1ml nuôi cấy ban đầu. 40 3.2. Khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. nuôi sau 24h với Vibiro. 44 3.3 Khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. nuôi sau 48h với Vibiro. 47 3.4. Số lượng tế bào các chủng Bacillus spp. trên môi trường có nước nuôi tôm. 53 12 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệ u hình Tên hình Trang 2.1. Sơ đồ pha loãng vi khuẩn. 27 2.2 Phương pháp cấy đường chữ thập 29 2.3. Phương pháp xác định tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn. 30 3.1. Mẫu tôm dùng để phân lập Bacillus. 32 3.2. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L1 33 3.3. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L2 33 3.4. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L3 34 3.5. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L4 34 3.6. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L10. 34 3.7. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L11 34 3.8. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L1. 36 3.9. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L2. 36 3.10. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L4. 36 3.11. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L5. 36 3.12. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L6. 37 3.13. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L7. 37 3.14. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L8. 37 13 3.15. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L9. 37 3.16. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L10. 38 3.17. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L11. 38 3.18. Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. cấy truyền trong ống thạch nghiêng trên môi trường NA1,5. 38 3.19. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L1 với Vibrio. 34 3.20. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L2 với Vibrio. 41 3.21. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L3 với Vibrio. 41 3.22. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L4 với Vibrio. 41 3.23. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L5 với Vibrio. 42 3.24. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L7 với Vibrio. 42 3.25. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L10 với Vibrio. 42 3.26. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L11 với Vibrio. 42 3.27. Khả năng đối kháng của Bacillus spp. L4 (nuôi chấm điểm 24h) với Vibrio sau 24h, 48h, 72h. 42 3.28. Khả năng đối kháng của Bacillus spp. L4 (nuôi chấm điểm 24h) với Vibrio sau 24h, 48h, 72h. 48 3.29. Các chủng Bacillus spp. đối kháng lẫn nhau tạo ra vòng vô khuẩn. 50 3.30. Số lượng tế bào Vibrio trước khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể. 51 3.31. Số lượng tế bào Vibrio sau khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể. 51 14 3.32. Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp. L2 trước khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 54 3.33. Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp. L2 sau khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 54 3.34 Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp. L4 trước khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 54 3.35 Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp. L4 sau khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 54 15 ẦN 1 ĐẦ 1.1. Lý do chọn đề tài. Nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam có vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Trong đó, nuôi tôm xuất khẩu đang ngày càng được chú trọng và đẩy mạnh, đem lại hiệu quả cao, đưa tổng lượng xuất khẩu hàng năm tăng lên. Tuy nhiên, ngành nuôi tôm đang gặp khó khăn lớn dẫn đến thất bại ở nhiều nơi. Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước ao nuôi, dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy. Khi ao nuôi bị ô nhiễm là cơ hội cho những nhóm vi sinh vật có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là tôm nuôi bị bệnh. Vì vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường nước và phòng bệnh là cấp thiết. Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra, làm cho tỉ lệ sống của đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm bệ nh do vi khuẩn, chủ yếu là nhóm Vibrio, gây ảnh hưởng lớn đến năng suất nuôi. Các bệnh vi khuẩn đó là bệnh đầu vàng, thân đỏ, đốm trắng và phát sáng. Trong đó bệnh phát sáng hiện đang gây hậu quả rất nặng nề. Bệnh này do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm sú và một số loài tôm khác. Bệnh xuất hiện từ giai đoạn ấu trùng, tôm bột đến tôm trưởng thành ở trong cả bể ương và ao nuôi. Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi trường ao nuôi và phòng bệnh. Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người. Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong tôm nuôi, vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Hiện nay tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong phòng trị bệnh cho tôm nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng. Một xu hướng mới hiện nay được áp dụng nhằm ngăn ngừa dịch bệnh cho tôm là việc sử dụng chế phẩm men vi sinh sống nhằm giúp cho tôm có khả năng hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn, đồng thời cải tạo được môi trường nuôi, từ đó tôm sẽ có khả năng chống chịu bệnh tật và áp lực môi trường tốt hơn. Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu này còn mới mẻ, chưa có nhiều nghiên cứu chọn lọc các chủng vi khuẩn từ vùng nuôi để dùng làm chế phẩm vi sinh phù hợp. Vì vậy, 16 việc sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm gặp nhiều khó khăn trong việc nâng cao sức đề kháng cho tôm. Bên cạnh đó, phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loạ i. Các chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn hạn chế. Việ c nghiên cứu chọn lựa những hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây bệ nh, có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩ m vi sinh là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Một trong những nhóm vi khuẩn có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh ở tôm là vi khuẩn Bacillus. Bacillus là một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhấ t, nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm probiotic. Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi đã chọn và nghiên cứu đề tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh ở Tôm”. 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu. 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu. Đề tài được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủ ng vi khuẩn Bacillus spp. hoạt tính mạnh có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio gây bệnh ở tôm. 1.2.2. Nội dung. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu chúng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứ u sau: - Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có hoạt tính cao từ các mẫu ruộ t tôm bị bệnh và tôm không bị bệnh. - Tuyển chọn chủng Bacillus spp. có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio gây bệ nh trên tôm từ các chủng Bacillus spp. đã phân lập được và từ bộ sưu tập vi khuẩn Bacillus spp. của tổ bộ môn sinh. - Khảo sát đặc điểm hình thái và nuôi cấy của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được. 1 3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu. Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập từ ruột tôm. 17 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu. Trên địa bàn thành phố Tam kỳ, tỉnh Quảng Nam. 1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. 1.4.1. Địa điểm. Tại phòng thí nghiệm Sinh Học - trường Đại học Quảng Nam. 1.4.2. Thời gian. Từ tháng 102014 đến tháng 42015. 1 5 ương p áp ng iên cứu. - Phương pháp thực nghiệm tại phòng thí nghiệm. - Phương pháp nghiên cứu, tổng hợp tài liệu (sách, báo, internet…). - Phương pháp xử lý số liệu. 18 PHẦN 2. NỘI DUNG ƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U 1 1 Ngàn t ủy sản 1.1.1. Tổng quan ngành thủy sản. Việt Nam có vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên thuận lợi tạo ra thế mạnh nổi trội để phát triển ngành công nghiệp thủy sản. Xuất khẩu thủy sản, do đó, trở thành một trong những lĩnh vực mũi nhọn của ngành kinh tế 21. Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07năm. Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước 20. Sản phẩm thủy sản xuất khẩu của Việt Nam rất đa dạng về chủng loạ i, tuy nhiên hai sản phẩm đóng góp lớn nhất cho sự phát triển của ngành cũng như là hai sản phẩ m xuất khẩu chính là cá tra và tôm 21. Trong những năm gần đây, ngành nuôi tôm nước ta đã trở thành một trong nhữ ng ngành kinh tế chủ đạo của quốc gia. Diện tích nuôi tôm không ngừng được mở rộ ng. Trong số các mặt hàng thủy sản, tôm đang giữ vị trí đứng đầu về giá trị xuất khẩu củ a toàn ngành 25. Mặt hàng tôm đã vượt lên chiếm 40,7 tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của Việ t Nam. Thị trường tiêu thụ tôm đã vươn tới 90 nước, trong đó 3 thị trường chính (EU, Mĩ, Nhật Bản) chiếm trên 70 tổng kim ngạch xuất khẩu tôm của nước ta 26. Tuy nhiên, trong năm 2010, thủy sản Việt Nam nói chung đang đứng trước khó khăn phải đối mặt với những rào cản kỹ thuật từ phía nhà nhập khẩu 25. Mộ t trong những khó khăn của xuất khẩu là dư lượng hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm thủ y hải sản. Do đó, cần phải xây dựng giải pháp kỹ thuật không dùng thuố c kháng sinh và các chất hóa học hoặc tìm các chất thay thế an toàn nhằm đạt được các sản phẩm thủ y sản an toàn vệ sinh thực phẩm 19. 1.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam. Hiện nay tôm vẫn là loài có vai trò quan trọng, đóng góp cho sự phát triển củ a ngành thủy sản Việt Nam nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng. Tôm có hai loại 19 sản phẩm chính là tôm sú và tôm thẻ chân trắng, trong đó tỷ lệ tôm thẻ chân trắng gia tăng trong thời gian gần đây, nhưng tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu cơ bả n 21. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng mới bắt đầu nuôi trong năm 2008 và phát triển nhanh trong vài năm gần đây. Diện tích nuôi năm 2009 mới đạt 3.398 ha, chiếm tỷ lệ nhỏ khoảng 0,58 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng, nhưng đến năm 2013 diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng đã tăng lên 44.601 ha, chiếm 7,4 diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng 15. Năm 2009 - 2013, tốc độ tăng trưởng bình quân 0,9 năm. Diệ n tích nuôi tôm sú vẫn chiếm tỷ trọng lớn trong tổng diện tích nuôi với 558.795 ha, chiếm 92,6 tổ ng diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng và chiếm 94,9 tổng điện tích nuôi tôm sú của cả nước. Tuy nhiên, diện tích nuôi tôm sú có xu hướng giảm dần trong giai đoạ n 2009 - 2013 với tốc độ giảm bình quân 0,84năm. Trong giai đoạn này, diện tích nuôi tôm nước lợ vùng Đồng bằng sông Cửu Long tăng bình quân 0,9 năm, sản lượ ng nuôi lại tăng bình quân 8,7năm (tăng từ 308.855 tấn lên 431.569 tấn), điều này cho thấ y mức độ áp dụng khoa học công nghệ trong nuôi tôm nước lợ 15. Năm 2013, theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, cả nước có khoảng 29 tỉnh, thành nuôi tôm nước lợ, với tổng diện tích thả nuôi 652.612 ha, sản lượng đạ t 475.854 tấn. Trong đó, khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long chiếm 92,5 diệ n tích và 79,8 sản lượng của cả nước 15. Tính đến thời điểm 31102014, cả nước đã thả nuôi 675.830 ha (đạt 100,9 kế hoạch và bằng 103,6 so với cùng kỳ 2013), trong đó diện tích nuôi tôm sú là 582.514 ha, tôm chân trắng là 93.316 ha (đạt 133,3 kế hoạch năm 2014, bằng 146,4 cùng kỳ năm 2013). Sản lượng thu hoạch 568.668 tấn (đạt 103,4 kế hoạch năm 2014 và bằng 105,1 so với cùng kỳ 2013), trong đó sản lượng tôm sú đạt 240.937 tấn, tôm chân trắng 327.731 tấn 15. 1.2. Tình hình dịch bệnh ở tôm, nguyên nhân và phương pháp giải quyết. 1 2 1 Tìn ìn dịc bện trên tôm nuôi Từ năm 1990 - 1995 sản lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do dịch bệnh. Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến 20 năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn. Tại Việt Nam trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng 7. Các chương trình nghiên cứu trên tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy các tác nhân gây bệnh chính bao gồm nhóm vi khuẩn Vibrio và các virus quan trọng như MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrom Virus) (Nguyễn Văn Hảo và cs, 1997). Sự giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987). Dựa vào khoảng 49 đặc tính kiểu hình và khoảng 210 mẫu phân lập đại diện đã xác định vi khuẩn gây bệnh là Vibrio harveyi, Vibrio cholerae dòng Albensis và Photobacterium leiognathi 5. Năm 2012, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 120 xã thuộc 54 huyện của 19 tỉ nh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 8.734 ha và bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tạ i 192 xã thuộc 52 huyện của 16 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 28.005 ha 15. Năm 2013, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 282 xã thuộc 94 huyện của 28 tỉ nh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 8.734 ha. So với năm 2012, dịch bệnh đốm trắng tăng 3.617 ha, tương đương khoảng 1,4 lần. Số lượng xã, huyện, tỉnh có d ịch cũng tăng so với cùng kỳ năm 2012 và dịch bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 199 xã thuộ c 59 huyện của 19 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 5.875 ha. So với năm 2012, dịch bệnh hoại tử gan tụy tăng chút ít về phạm vi có dịch, nhưng tổng diện tích chỉ bằng khoảng 21 15. Năm 2014, trong 9 tháng đầu năm, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tạ i 233 xã thuộc 65 huyện của 21 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 18.321 ha. So với cả năm 2013, phạm vi dịch đã xuất hiện gần tương đương, nhưng diện tích bệnh lại cao hơn 1,5 lần, khoảng 5.970 ha và dịch bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 224 xã thuộ c 59 huyện của 22 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 5.119 ha. So với cả năm 2013, dịch đã xuất hiện ở phạm vi nhiều hơn, nhưng diện tích bệnh lại chỉ bằ ng 87, khoảng 5.119 ha. So với năm 2012, phạm vi có dịch bệnh xuất hiện nhiều hơn, nhưng tổng diện tích bị bệnh chỉ bằng khoảng 18 15. 21 1.2.2. Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản. 1.2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio. Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là nhóm vi khuẩn có dạ ng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 μm. Vibrio không hình thành bào tử và có khả năng chuyển động nhờ tiên mao hay nhiều tiên mao mảnh (Đỗ Thị Hòa, 2004). Là các vi khuẩn màu Gram âm, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, sinh khí H2S (Trần Linh Thướ c, 2008). Hầu hết các loài của chi Vibrio đều phân bố trong môi trường nước mặ n, thích hợp ở 20 - 40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi động vật thủy sản biển, đặc biệt giáp xác nuôi ven biể n và trên biển. Môi trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose) là môi trường chọn lọ c của Vibrio. Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc này, Vibrio đượ c chia làm 2 nhóm: nhóm có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạ c màu vàng; nhóm không có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu xanh lá cây. Vibrio là vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 - 30oC 5. Các loài Vibrio có mật độ cao trong môi trường nước, bao gồm cả cửa sông, vùng nước ven biển và trầm tích biển và khắp nơi trong nuôi trồng thủy sản. Một số nghiên cứu cho thấy Vibrio xuất hiện với mật độ dày đặc trong sinh vật biển, như san hô, cá, động vật thân mềm, tôm, cỏ biển, bọt biển và động vật nổi (Thompson và cs, 2004). Kết quả nghiêncứu ở Việt Nam cho thấy, vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ. Vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới 5. 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây r trên động vật thủy sản. Bệnh Vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra. Trong bệnh Vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh Vibriosis ở động vật thủy sản. Cùng với việc thâm canh hóa nghề nuôi trong những năm gần đây, tôm nuôi của toàn thế giới đang chịu ảnh hưởng của dịch bệnh, 22 bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus. Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá và động vật thân mềm nước mặn phát triển, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản, đặc biệt là trong nuôi tôm. Vibrio harveyi là tác nhân gây bệnh chủ yếu cho tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei và tôm sú Penaeus monodon 5. Hiện nay người ta đã phân lập và định danh được 172 chủng vi khuẩn từ tôm bệnh và tìm thấy khoảng 90 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio (Nguyễn Thị Tĩnh, 2010). Ở Việt Nam đã phân lập được các loài Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae, Vibrio mimicus trên cá, tôm nhiễm bệnh (Oanh et al,. 1999). Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm khi việc sử dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều mà ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn kháng thuốc 5. Nhầm ngăn ngừa những tổn thất do bệnh Vibriosis gây ra trên tôm cả về mặt môi trường kinh tế và kinh tế xã hội, cần phải có những giải pháp nhằm tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh đồng thời giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và hóa chất. 1.2.3. Một số bệnh điển hình ở trong qua trình nuôi tôm. 1.2.3.1. Bệnh thân đỏ đốm trắng (SEMBV - Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus). Tác nhân gây bệnh: bệnh thân đỏ đốm trắng là do một loại virus có tên khoa học viết tắt là SEMBV (Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus) gây ra. Virus này cảm nhiễm ở các mô có nguồn gốc trung bì và ngoại bì như: mang, lớp biểu mô của vỏ, thần kinh, dạ dày và một số cơ quan khác. Khi xâm nhập vào cơ thể tôm sẽ lan ra các bộ phận khác của cơ thể, khi chúng xâm nhập được vào tế bào sẽ xâm nhập tiếp vào nhân và phát triển về số lượng rất nhanh làm cho kích cỡ của nhân to ra ta thấy rõ qua kính hiển vi. Khi virus phát triển đến một mức độ nào đó nó sẽ giết chết tế bào và virus sẽ bung cùng với tế bào ra khỏi cơ thể tôm lan truyền ra nguồn nước, khi gặp tôm khỏe khác lại tiếp tục xâm nhập và cứ thế tiếp diễn. Nếu virus không xâm nhập được vào tế bào của tôm thì nó sẽ chết vì nó chỉ sống được tự do trong môi trường nước 4 ngày. Virus này sống và tồn tại được trong môi trường nước ngọt và mặn do đó tôm nuôi ở các độ mặn khác nhau từ 5 - 40o đều cảm nhiễm virus và gây bệnh. Như thế cho thấy rằng virus này có khả năng gây bệnh cho tôm ở bất cứ ao nuôi tôm nào. 23 Ngoài ra trên cơ thể những con tôm bệnh thân đỏ đốm trắng còn bị nhiễm các tác nhân cơ hội khác như: vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật (Protozoa)… 22. Dấu hiệu bệnh lý: con tôm yếu dạt vào bờ; trên thân tôm xuất hiện các đốm trắng tròn, to nhỏ khác nhau nằm dưới lớp vỏ kitin ở phần đầu ngực và vỏ các đốt bụng, cũng có một số ít trường hợp tôm bị bệnh này nhưng không có đốm trắng; màu sắc tôm chuyển sang màu hồng tối hoặc nhợt nhạt; khả năng tiêu hoá thức ăn bị giảm sút nghiêm trọng, đa phần các con tôm dạt bờ đều không ăn; tôm chết từ rải rác tới hàng loạt, có thể chết cả ao trong vòng 5 - 7 ngày, đặc biệt chết nhiều sau khi lột xác. Kết quả kiểm tra mô học cho thấy nhân ở tế bào bị cảm nhiễm phình to chiếm chỗ cả nguyên sinh chất 22. 1.2.3.2. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV). Tác nhân gây bệnh: bệnh MBV gây ra trên tôm bởi một loại virus thuộc giống Baculovirus, thuộc nhóm virus có hình thể ẩn trong nhân tế bào mà nó cảm nhiễm. Dấu hiệu bệnh: nếu tôm giống thả nuôi có mức độ nhiễm MBV cao thì có thể gây chết hàng loạt trong hai tuần đầu, nếu không gây chết loại virus này cũng làm tôm mẫn cảm hơn với các tác nhân khác nên tôm nuôi thường hay bị còi cọc, chậm lớn và thường xuất hiện các dấu hiệu khác như đen mang, cụt râu, đỏ thân. Một dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của những con tôm bị nhiễm MBV là sự tồn tại các thể ẩn hình cầu trong nhân tế bào gan, nhờ vậy có thể phát hiện được dễ dàng bệnh này dưới kính hiển vi. 1.2.3.3. Bệnh đầ vàng (YHD - Yellow Head Disease). Tác nhân gây bệnh: gây bệnh đầu vàng trên tôm nuôi là loại virus có tên Rhabdovirus. Ðây là loài virus có nhân ARN. Virus này có thể ký sinh ở nhiều nội quan khác nhau của tôm như: gan tụy, mang, máu, dạ dày… Ngoài ra, tôm bị bệnh đầu vàng còn có khả năng bị cảm nhiễm một số tác nhân cơ hội khác như: vi khuẩn, nguyên sinh động vật… 22. Dấu hiệu bệnh lý: bệnh có dấu hiệu rất đặc thù là tôm nuôi đột nhiên tiêu thụ thức ăn mạnh hơn bình thường trong vài ngày liên tiếp, sau đó bỏ ăn hoàn toàn; tôm bị bệnh lờ đờ, bắt đầu dạt vào bờ ao; màu sắc của tôm trở nên nhợt nhạt, phần đầu ngực có màu vàng do gan tụy và mang tôm chuyển sang màu vàng, giáp đầu ngực bị phồng, mang tiết dịch có mùi hôi; sau 2 - 3 ngày kể từ khi có hiện tượng dạt bờ, tôm bắt đầu chết. Sau 5 - 7 ngày có khả năng chết toàn bộ tôm trong ao 22. 24 1.2.3.4. Bệnh phát sáng ở ấ trùng tôm. Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra, nhất là ở tôm sú. Trong thời gian gần đây nhiều bà con nuôi tôm sú bị thiệt hại nặng khi mua phải tôm sú giống nhiễm bệnh phát sáng 5. Khi tôm bị bệnh phát sáng thường yếu, lờ đờ, kém bắt mồi, nặng có thể bỏ ăn, trong bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục. Khi bệnh xảy ra trong các trại giống, tác hại thường lớn, đặc biệt ở các giai đoạn tiền ấu trùng như zoea, mysis. Khi bệnh xảy ra ở dạng cấp tính có thể làm tôm ấu trùng chết hàng loạt, tỷ lệ chết có thể lên đến 100 trong bể ấp do sự nhiễm khuẩn toàn thân. Bệnh phát sáng thường gây tác hại lớn ở giai đoạn ấu trùng và hậu ấu trùng. Giai đoạn ấu niên trong ao nuôi thịt cũng có thể bị ảnh hưởng, nhưng tác hại thấp hơn. Từ mẫu tôm bị bệnh phát sáng người ta đã phân lập được Vibrio harveyi, Vibrio vulificus và Vibrio parahaemolyticus 5. 1.2.4. Các phương pháp xử lý. 1.2.4.1. Phương pháp phòng bệnh. Việc đầu tiên phải làm trước mỗi vụ nuôi là làm tốt công việc sát trùng bể, ao, dụng cụ và nguồn nước trước mỗi đợt sản xuất. Đối với ao nuôi phải cải tạo ao thật kỹ, vét sạch bùn đáy, bón vôi, phơi ao, khoáng hóa nền đáy tiêu diệt mầm bệnh. Nguồn nước phải được sát trùng bằng các phương pháp khác nhau: phương pháp cơ học (lọc), phương pháp hóa học (xử lý bằng thuốc sát trùng), phương pháp lý học (sát trùng bằng đèn cực tím), phương pháp sinh học, phương pháp sinh thái để tiêu diệt và kìm hãm sự phát triển của Vibrio 7. Độ mặn và nhiệt độ cao là điều kiện thuận lợi cho Vibrio phát triển mạnh. Vì vậy cần giảm độ mặn trong ao nuôi tôm thịt xuống 15 - 20‰ để kìm hãm sự phát triển của Vibrio 7. Vào mùa hè nhiệt độ thường cao, để hạn chế khả năng tăng nhiệt cần duy trì mức nước trong ao nuôi đạt độ sâu từ 1,2 - 1,5m. Ô nhiễm môi trường trong quá trình nuôi do lượng thức ăn dư thừa và do động vật thủy sản thải ra là yếu tố nguy hiểm dẫn đến phát sinh dịch bệnh. 25 Cần lựa chọn thức ăn có chất lượng tốt, xác định khẩu phần thức ăn chính xác, tránh dư thừa. Với thức ăn tươi sống cần được sát trùng bằng một số thuốc diệt khuẩn (formalin, iodine) rồi rửa lại bằng nước sạch trước khi cho ấu trùng ăn. Có thể dùng chế phẩm vi sinh (probiotic) để cân bằng sinh thái trong hệ thống nuôi và giảm lượng chất thải hữu cơ trong ao, bể, kìm hãm sự phát triển của Vibrio gây bệnh. Không dùng kháng sinh (antibiotic) để phòng bệnh, có thể dùng chất khử trùng (formol, …) để diệt khuẩn ngoài môi trường, nhưng phải lựa chọn nồng độ thuốc không ảnh hưởng tới vật nuôi và chỉ dùng khi thật sự cần thiết, coi đó chỉ là giải pháp cuối cùng. Khi bệnh đã xảy ra, trước khi xả bỏ, cần dùng thuốc diệt khuẩn (chlorine, formol) để sát trùng nước, diệt vi khuẩn 5. Có thể tăng hệ miễn dịch tự nhiên của động vật nuôi thủy sản bằng quản lý môi trường tốt và bổ sung một số sản phẩm như vitamin C, A, E sẽ kích thích cơ quan tạo kháng thể; hạn chế dùng hóa dược trong nuôi trồng thủy sản. Một biện pháp hữu hiệu nhằm tăng sức đề kháng của tôm và các loài động vật thủy sản khác là sử dụng nhóm vi sinh vật hữu ích gọi là vi sinh vật probiotic (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) như Zymetin, Dikaku và Biodream trộn vào thức ăn sẽ giúp cho động vật thủy sản tiêu hoá tốt. Các vi sinh vật này sẽ cạnh tranh thức ăn với các vi khuẩn Vibrio gây bệnh và chiếm địa bàn ở đường ruột của vật nuôi, loại bỏ vi khuẩn Vibrio gây bệnh trong ruột vật nuôi 7. Như vậy để phòng trị bệnh cho động vật thủy sản do Vibrio gây bệnh gây ra cần thực hiện tốt các biện pháp từ khâu chọn giống ban đầu, cải tạo ao loại bỏ hết các chất hữu cơ vào đầu vụ và cuối vụ, thực hiện nuôi tôm trong độ mặn thấp, giữ nước có màu xanh vỏ đậu, hạn chế khả năng tăng cao nhiệt độ, không cho ăn dư, tăng cường sức khỏe tôm nuôi bằng thức ăn giàu dinh dưỡng, vitamine và bổ sung chế phẩm probiotic, xử lý môi trường nuôi và có mật độ nuôi phù hợp với trình độ quản lí… 5. 1.2.4.2. Phương pháp trị bệnh. Khi bệnh Vibriosis đã xuất hiện, có thể dùng kháng sinh để trị bệnh. Giảm mật độ vi khuẩn trong nước và cải thiện điều kiện môi trường bằng một số biện pháp kĩ thuật: xifon đáy, thay nước đáy, dùng một số loại thuốc diệt khuẩn 26 như: benzalkonoum chloride (BKC), iodine… sau đó thay một phần nước trong ao, gây lại màu nước 7. Tuy vậy ở giai đoạn tiền ấu trùng và hậu ấu trùng, do sức chịu đựng của vật nuôi với thuốc rất kém và khi bệnh đã xảy ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp đã bỏ ăn, vì vậy dùng thuốc khó khăn và ít có hiệu quả 5. 1.3. Probiotic và tình hình nghiên cứu về probiotic cho tôm trên thế giới và Việt Nam. 1.3.1. Khái niệm Probiotic. Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “cho cuộc sống”. Khái niệm probiotic đã xuất hiện từ những năm đầu thế kỷ XX nhưng đến năm 1960 người ta mới quan tâm đến probiotic. Đã có nhiều định nghĩa từ thuật ngữ này, như Lily và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên: probiotic là các chất được tiết ra bởi một loài vi sinh vậ t có khả năng thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác và có ý nghĩa ngược với kháng sinh. Năm 1971, Sperti đã mô tả probiotic như là dịch chiết tế bào có khả năng kích thích sinh trưởng của vi sinh vật 8. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989) 3. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiệ n, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiề u trong các ấn phẩm khoa học. Một là: theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”. Hai là: theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” 10. Ngày nay, khái niệm probiotic dùng để chỉ những vi sinh vật sống được bổ sung vào đường tiêu hóa của con người và vật nuôi làm tăng cường sức khỏe cho con ngườ i và vật nuôi thông qua việc cải thiện cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruộ t 1. Probiotic là chất bổ sung chế độ ăn dựa vào các vi sinh vật sống, mà khi được sử dụng 27 với lượng thỏa đáng sẽ có tác dụng có lợi trên sinh vật chủ, cải thiện sự cân bằng hệ vi khuẩn ở ruột giúp ngăn ngừa rối loạn về tiêu hóa đặc biệt là các tình trạng tiêu chả y cấp hoặc tiêu chảy do sử dụng kháng sinh. 1.3.2. Tác dụng của probiotic. 1.3.2.1. Tăng cường khả năng tiê hó . Vi khuẩn probiotic giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng, giúp tiêu hóa các chất giàu năng lượng chưa được sử dụng, kích thích sự tăng trưởng tế bào, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại, làm cho hệ miễn dịch chỉ phản ứng đối với các vi khuẩn gây bệnh. Trong các thực phẩm lên men với Lactobacillus sẽ làm tăng chất lượng, tăng khả năng tiêu hóa và đồng hóa các chất dinh dưỡ ng. Vì vậy, Lactobacillus đã được xem là nhân tố kích thích sự hấp thu dinh dưỡ ng. Ngoài ra, vi khuẩn probiotic tham gia cạnh tranh và kìm hãm sự sinh trưởng của các vi sinh vậ t có hại trong đường ruột giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột 12. Probiotic kích thích tính thèm ăn, làm tăng khả năng hoạt động tiêu hóa của nhu động ruột, đồng thời tích lũy các chất và tiết ra các enzyme tiêu hóa như: α- amylase, protetase, lipase, cellulose (Han boong Industry Co.Ltd.2001) tiêu hóa các chất 2. 1.3.2.2. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiê hó . Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan trọng đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiế t ra các kháng sinh hay là các chất cạnh tranh 3. Probiotic tác động lên hệ vi sinh vật đường ruột với cơ chế tác động như: cạ nh tranh chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh; cạnh tranh vớ i các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng vào đường ruột, vị trí nào đượ c các vi khuẩn probiotic gắn kết thì các độc tố đường ruột bị ngăn chặn; vi khuẩ n probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, những hợp chấ t này có thể làm giảm hoạt tính của các vi sinh vật gây bệnh, các độc tố được tạ o ra và làm giảm khả năng trao đổi chất của vi khuẩn gây bệnh 3. Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở các ch ủng probiotic đó là: Hydrogen peroxide, acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic, Bacteriocin, Diacetyl. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH trong khoang ruột 28 thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yế u là acetate, propionate, acid lactic 9. 1.3.2.3. Kích thích hệ miễn dịch Có nhiều nghiên cứu cho thấy tác động của việc bổ sung một số probiotic lên chức năng hàng rào miễn dịch của cơ thể. Các nghiên cứu trên người cho thấy việc bổ sung L.Casei, L.Bulgaricus và L.Acidophilus kích thích tăng sản sinh đại thực bào và tăng thực bào đối với trẻ trẻ được bổ sung probiotic và giảm sự thẩm thấu của ruộ t khi bổ sung Lactobacilli và ở những trẻ đẻ non được bổ sung Bifidobacteria tăng khả năng kháng khuẩn 1. Ở người trưởng thành khi sử dụng L.Acidophilus La1 và Bifidobacteria làm tăng IgA đặc hiệu, cũng như B.Lactics làm tăng hoạt động thực bào chống lại E.Coli, tăng khả năng tiêu diệt tế bào 4. Ngoài ra, probiotic có thể góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, làm tăng hàm lượng globulin, tăng cường hiệu quả của một số vaccin như vaccin thương hàn. Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào củ a vi sinh vật hay hạt carbon, tăng khả năng sản xuất kháng thể thường gọ i là IgG và IgM và interon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu). Probiotic còn tăng khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột như kháng thể IgA. Như vậy probiotic tác độ ng lên hàng rào miễn dịch của cơ thể theo cơ chế miễn dịch đặc hiệu (miễn dịch thu được) và miễ n dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên). Miễn dịch đặc hiệu tốt cần thiết cho việ c bảo vệ cơ thể, giảm cơ hội cho các phản ứng gây viêm, loét hay dị ứng 6. 1.3.2.4.. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp đượ c lactose. Sự không dung nạp đường lactose xảy ra khá phổ biến ở nhiều người, ở những người bị viêm ruột mãn tính, cấp tính và những người phẫu thuật ruột, gây ra sự đầy hơi, khó tiêu khi hấp thụ thực phẩm có chứa đường lactose. Nhiều nghiên cứu cho thấ y khả năng không dung nạp đường lactose là do thiếu nghiêm trọng enzyme lactase (β- galactosidase) trong ruột, thiếu hụt có thể do thể trạng hoặc do tổn thương niêm mạc ruột. Phần lớn lactose không chuyển hóa được ở ruột non sẽ tới đại tràng và tại đây lactose sẽ được sử dụng bởi tạp khuẩn, để sản sinh ra acid béo chuỗi ngắn như: hydrogen, methan và cacbonat làm cho chúng ta chướng hơi, co thắt ruột, đau từng 29 cơn và tiêu chảy. Khi sử dụng càng nhiều sản phẩm chứa nhiều lactose thì hiện tượng này càng được biểu hiện rõ hơn 8. Các chủng vi khuẩn lên men acid lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cả i thiện các triệu chứng đầy hơi, khó tiêu khi sử dụng lactose. Các thử nghiệm cho thấ y việc sử dụng lactose có trong sữa Proby tốt hơn sử dụng lactose trong các sản phẩ m khác vì hoạt tính dung nạp lactose của β- galactosidase có trong Proby cao hơn nhiều. Hầu hết các vi khuẩn probiotic sử dụng để lên men sữa bao gồm Lacitc bulgaricus và Lactic thermophiles vừa sản sinh ra lactose vừa khích thích lactose trong ruột sản sinh, giúp cải thiện rõ rệt khả năng dung nạp lactose và hỗ trợ tiêu hóa ở đường ruột 10. 1.3.2.5. Sinh tổng hợp ra các chất kháng ng thư và chống các yếu tố đột biến. Một số chủng Lactobacilli như Lactoacidophius làm giảm hoạt độ ủa các enzyme β- glucoronidase, nitroreductase và azoreductase là những enzyme xúc tác sản sinh các chất gây ung thư trong hệ tiêu hóa. Probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết, ung thư bàng quang, ngoài ra probiotic còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu 9. Nhờ sự sản xuất các hợp chất kháng ung thư: sinh ra những acid yếu có lợi cho đường ruột như acid butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương mau lành và hồi phục chức năng. Điều hòa những enzyme gây tiền chất ung thư ruột, ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch 18. 1.3.2.6. Một số tác dụng khác Probiotic ngoài những tác động trên còn có một số tác động như: ngăn ngừa bệ nh tiêu chảy, các rối loạn tiêu hóa đường ruột, giảm cholesterol trong máu, cải thiện nhu động ruột… 24. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng probiotic trong nuôi tôm trên thế giớ i và Việt Nam. Khi sử dụng một loại probiotic thân thiện môi trường có tên thương mại là Environ - AC của tập đoạn Biostadt India Ltd, để xử lý sinh học môi trường ao nuôi tôm ở một trang tại tôm sú tại làng Srijang gần Chandipur nằm ở vùng duyên hải Balasore ven biển Oissa (Ấn Độ) thì khi phân tích mẫu nước trước khi sử dụng probiotic đã cho thấy sự hiện diện của NH3, H2S, NO2 và mật độ vi khuẩn Vibrio rất cao. Trong khi 30 đó, sau khi sử dụng Probiotic thì từ ngày nuôi thứ 70 trở đi, mức độ độc hại không chỉ giảm mà còn giảm triệt để tới bằng mức 0, số lượng Vibrio cũng giảm đi đáng kể. Những phát hiện tương tự như các quan sát thực hiện bởi Ravichandranand Jall aluddin (2000) sử dụng Environ - AC với liều lương đầu 25kgha, sau đó là 10 Kg cách tuần 14. Nghiên cứu này cho thấy trong ao được xử lý probiotic, các quần thể vi khuẩn Vibrio phát triển chậm trong khi đó, ở ao không được xử lý bằng probiotic số lượng Vibrio tăng rất nhanh. Prabhu và cộng sự (1999) trong nghiên cứu của mình cũng thấy được mức độ ammoniac andnitrie trong ao xử lý băng probiotic thấp hơn trong ao đối chứng. Nghiên cứu của Jha và Naik (2007, 2008, 2009) cho thấy ao nuôi sử dụng probiotic có tỷ lệ vi khuẩn Vibrio rất hạn chế và không hình thành các loại khí độc hại như amoniac, nitrit hydrogen sulphide, vv, trong khi ở các ao đối chứng, vi khuẩn Vibrio tăng nhanh và phát hiện nhiều loại khí độc hại 14. Tất cả các tác giả trên đều khuyến cáo việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi tôm để phân hủy các chất hữu cơ, làm giảm và kiểm so...

UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM

KHOA: LÝ – HÓA - SINH

KHÓA LU N TỐT NGHI ĐẠI HỌC

Quảng Nam, tháng 4 năm 2015

UBND TỈNH QUẢNG NAM

LỜ A ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của cô Thạc sĩ Phan Thị Thanh Diễm

Các số liệu và kết quả nêu trong sskhóa luận tốt nghiệp là trung thực và chưa

từng được công bố trong bất kì công trình nào khác

Sinh viên thực hiện

PHẠM THỊ THÙY TRÂM

LỜI CẢ ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự nỗ lực, cố gắng của bản thân còn có sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của quý thầy cô, sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt quá trình tôi thực hiện nghiên cứu

Qua đây, cho phép tôi bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất đến cô giáo Thạc sĩ Phan Thị Thanh Diễm là giáo viên hướng dẫn đã định hướng, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành đề tài khóa luận này

Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo nhà trường của trường Đại học Quảng Nam đã tạo điều kiện cho tôi mượn phòng thí nghiệm Sinh Học gồm có các máy móc, thiết bị cần thiết cho đề tài để tôi có thể tiến hành nghiên cứu đề tài một cách thuận lợi

Bên cạnh đó, tôi cũng xin cảm ơn hai người bạn cùng nghiên cứu với tôi đã hỗ trợ cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô đã dành thời gian để đọc, nhận xét và chấm điểm luận văn này để giúp cho Luận văn tốt nghiệp của tôi có thể hoàn chỉnh hơn

Do hạn chế về khả năng và thời gian nghiên cứu nên đề tài của tôi vẫn còn nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô giáo để tôi hoàn thiện hơn đề tài nghiên cứu của mình

Xin chân thành cảm ơn

Sinh viên thực hiện

PHẠM THỊ THÙY TRÂM

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 16

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16

1.2.2 Nội dung 16

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 16

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 16

1.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 18

1.2 Tình hình dịch bệnh ở tôm, nguyên nhân và phương pháp giải quyết 19

1.2.1 Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi 19

1.2.2 Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản 21

1.2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio 21

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản 21

1.2.3 Một số bệnh điển hình ở trong qua trình nuôi tôm 22

1.2.3.1 Bệnh thân đỏ đốm trắng (SEMBV - Systemic Ectodermal and Mesodermal

1.2.4.2 Phương pháp trị bệnh 25

1.3.1 Khái niệm Probiotic 26

1.3.2 Tác dụng của probiotic 27

1.3.2.1 Tăng cường khả năng tiêu hóa 27

1.3.2.2 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa 27

1.4.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn thuộc chi Bacillus 35

1.4.4.1 Cải thiện sức khỏe 35

1.4.4.2 Cải thiện môi trường 36

1.4.5 Lợi thế khi chọn Bacillus làm chế phẩm sinh học 38

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 40

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 40

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu 40

2.1.2.1 Dụng cụ 40

2.1.2.2 Thiết bị 40

2.1.2.3 Hóa chất 40

2.1.2.3 Môi trường 40

2.2 Phương pháp nghiên cứu 41

2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp từ ruột tôm 41

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn 42

2.2.3 Hoạt hóa các chủng vi khuẩn 42

2.2.4 Phương pháp nhân giống 42

2.2.5 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường dịch thể 42

2.2.6 Xác định khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp 43 2.2.6.1 Phương pháp cấy đường chữ thập trên môi trường thạch đĩa 43

2.2.6.2 Phương pháp xác định vòng vô khuẩn trên môi trường thạch 43

2.2.8 Phương pháp xác định khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn Vibrio trên môi trường dịch thể 44

2.2.9 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus spp trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm 45

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus spp từ mẫu ruột tôm 46

3.1.2 Kết quả kiểm tra bằng phản ứng catalaza 47

3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn 49

3.3 Hoạt hóa các chủng vi khuẩn 52

3.4 Số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường dịch thể 53

3.5 Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp đã được phân lập 54

3.5.1 Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp đã được phân lập bằng phương pháp cấy chữ thập 55

3.5.2 Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp đã được phân lập bằng phương pháp xác định vòng vô khuẩn trên môi trường thạch đĩa 57

3.6 Khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus spp đã tuyển chọn.

DANH MỤC CÁC TỪ VI T TẤT

ĐBSCL Đồng bằng song Cửu Long NA1,5% Nutrient Agar 1,5%

NB Môi trường Nutrient Broth

SEMBVSystemic Ectodermal and Mesodermal BaculovirusMBVMonodon Baculovirus

YHD Yellow Head Disease

3.2 Số lượng tế bào của Vibrio và Bacillus spp trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu

3.6 Số lượng tế bào các chủng Bacillus spp trên môi trường chỉ

có nước nuôi tôm

42

DANH MỤC CÁC BI ĐỒ

3.1 Số lượng các chủng vi khuẩn trong 1ml nuôi cấy ban đầu

40

3.2 Khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp nuôi sau 24h với Vibiro

44

3.3 Khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp nuôi sau 48h với Vibiro

47

3.4 Số lượng tế bào các chủng Bacillus spp trên môi

trường có nước nuôi tôm

53

DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu

hình

2.3 Phương pháp xác định tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn

30

3.1 Mẫu tôm dùng để phân lập Bacillus 32 3.2 Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp L1 33 3.3 Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp L2 33 3.4 Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp L3 34 3.5 Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp L4 34 3.6 Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp L10 34 3.7 Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp L11 34 3.8 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L1 36 3.9 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L2 36 3.10 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L4 36 3.11 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L5 36 3.12 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L6 37 3.13 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L7 37 3.14 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L8 37

3.15 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L9 37 3.16 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L10 38 3.17 Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp L11 38 3.18 Các chủng vi khuẩn Bacillus spp cấy truyền trong

ống thạch nghiêng trên môi trường NA1,5%

38

3.19 Cấy chữ thập chủng Bacillus spp L1 với Vibrio 34 3.20 Cấy chữ thập chủng Bacillus spp L2 với Vibrio 41 3.21 Cấy chữ thập chủng Bacillus spp L3 với Vibrio 41 3.22 Cấy chữ thập chủng Bacillus spp L4 với Vibrio 41 3.23 Cấy chữ thập chủng Bacillus spp L5 với Vibrio 42 3.24 Cấy chữ thập chủng Bacillus spp L7 với Vibrio 42 3.25 Cấy chữ thập chủng Bacillus spp L10 với Vibrio 42 3.26 Cấy chữ thập chủng Bacillus spp L11 với Vibrio 42 3.27 Khả năng đối kháng của Bacillus spp L4 (nuôi

chấm điểm 24h) với Vibrio sau 24h, 48h, 72h

42

3.28 Khả năng đối kháng của Bacillus spp L4 (nuôi chấm điểm 24h) với Vibrio sau 24h, 48h, 72h

3.32

Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp L2

trước khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm

54

3.33 Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp L2

sau khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm

54

3.34 Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp L4

trước khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm

54

3.35 Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp L4

sau khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm

54

ẦN 1 ĐẦ 1.1 Lý do chọn đề tài

Nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam có vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Trong đó, nuôi tôm xuất khẩu đang ngày càng được chú trọng và đẩy mạnh, đem lại hiệu quả cao, đưa tổng lượng xuất khẩu hàng năm tăng lên

Tuy nhiên, ngành nuôi tôm đang gặp khó khăn lớn dẫn đến thất bại ở nhiều nơi Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước ao nuôi, dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy Khi ao nuôi bị ô nhiễm là cơ hội cho những nhóm vi sinh vật có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là tôm nuôi bị bệnh Vì vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường nước và phòng bệnh là cấp thiết

Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra, làm cho tỉ lệ sống của đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm bệnh do vi

khuẩn, chủ yếu là nhóm Vibrio, gây ảnh hưởng lớn đến năng suất nuôi Các bệnh vi

khuẩn đó là bệnh đầu vàng, thân đỏ, đốm trắng và phát sáng Trong đó bệnh phát sáng

hiện đang gây hậu quả rất nặng nề Bệnh này do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm sú

và một số loài tôm khác Bệnh xuất hiện từ giai đoạn ấu trùng, tôm bột đến tôm trưởng thành ở trong cả bể ương và ao nuôi

Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi trường ao nuôi và phòng bệnh Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong tôm nuôi, vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Hiện nay tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong phòng trị bệnh cho tôm nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng

Một xu hướng mới hiện nay được áp dụng nhằm ngăn ngừa dịch bệnh cho tôm là việc sử dụng chế phẩm men vi sinh sống nhằm giúp cho tôm có khả năng hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn, đồng thời cải tạo được môi trường nuôi, từ đó tôm sẽ có khả năng chống chịu bệnh tật và áp lực môi trường tốt hơn

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu này còn mới mẻ, chưa có nhiều nghiên cứu chọn lọc các chủng vi khuẩn từ vùng nuôi để dùng làm chế phẩm vi sinh phù hợp Vì vậy,

việc sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm gặp nhiều khó khăn trong việc nâng cao sức đề kháng cho tôm Bên cạnh đó, phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loại Các chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn hạn chế Việc nghiên cứu chọn lựa những hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh, có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay

Một trong những nhóm vi khuẩn có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh ở tôm là vi khuẩn Bacillus Bacillus là một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất,

nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm probiotic

Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi đã chọn và nghiên cứu đề tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh ở Tôm”

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi

khuẩn Bacillus spp hoạt tính mạnh có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio gây bệnh ở

tôm

1.2.2 Nội dung

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu chúng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp có hoạt tính cao từ các mẫu ruột

tôm bị bệnh và tôm không bị bệnh

- Tuyển chọn chủng Bacillus spp có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên tôm từ các chủng Bacillus spp đã phân lập được và từ bộ sưu tập vi khuẩn

Bacillus spp của tổ bộ môn sinh

- Khảo sát đặc điểm hình thái và nuôi cấy của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được

1 3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn Bacillus spp phân lập từ ruột tôm

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Trên địa bàn thành phố Tam kỳ, tỉnh Quảng Nam

1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 1.4.1 Địa điểm

Tại phòng thí nghiệm Sinh Học - trường Đại học Quảng Nam

1.4.2 Thời gian

Từ tháng 10/2014 đến tháng 4/2015

1 5 ương p áp ng iên cứu

- Phương pháp thực nghiệm tại phòng thí nghiệm

- Phương pháp nghiên cứu, tổng hợp tài liệu (sách, báo, internet…) - Phương pháp xử lý số liệu

PHẦN 2 NỘI DUNG

ƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U 1 1 Ngàn t ủy sản

1.1.1 Tổng quan ngành thủy sản

Việt Nam có vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên thuận lợi tạo ra thế mạnh nổi trội để phát triển ngành công nghiệp thủy sản Xuất khẩu thủy sản, do đó, trở thành một trong những lĩnh vực mũi nhọn của ngành kinh tế [21] Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước [20]

Sản phẩm thủy sản xuất khẩu của Việt Nam rất đa dạng về chủng loại, tuy nhiên hai sản phẩm đóng góp lớn nhất cho sự phát triển của ngành cũng như là hai sản phẩm xuất khẩu chính là cá tra và tôm [21]

Trong những năm gần đây, ngành nuôi tôm nước ta đã trở thành một trong những ngành kinh tế chủ đạo của quốc gia Diện tích nuôi tôm không ngừng được mở rộng Trong số các mặt hàng thủy sản, tôm đang giữ vị trí đứng đầu về giá trị xuất khẩu của toàn ngành [25]

Mặt hàng tôm đã vượt lên chiếm 40,7% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam Thị trường tiêu thụ tôm đã vươn tới 90 nước, trong đó 3 thị trường chính (EU, Mĩ, Nhật Bản) chiếm trên 70% tổng kim ngạch xuất khẩu tôm của nước ta [26]

Tuy nhiên, trong năm 2010, thủy sản Việt Nam nói chung đang đứng trước khó khăn phải đối mặt với những rào cản kỹ thuật từ phía nhà nhập khẩu [25] Một trong những khó khăn của xuất khẩu là dư lượng hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm thủy hải sản Do đó, cần phải xây dựng giải pháp kỹ thuật không dùng thuốc kháng sinh và các chất hóa học hoặc tìm các chất thay thế an toàn nhằm đạt được các sản phẩm thủy sản an toàn vệ sinh thực phẩm [19]

1.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam

Hiện nay tôm vẫn là loài có vai trò quan trọng, đóng góp cho sự phát triển của ngành thủy sản Việt Nam nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng Tôm có hai loại

sản phẩm chính là tôm sú và tôm thẻ chân trắng, trong đó tỷ lệ tôm thẻ chân trắng gia tăng trong thời gian gần đây, nhưng tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu cơ bản [21] Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng mới bắt đầu nuôi trong năm 2008 và phát triển nhanh trong vài năm gần đây Diện tích nuôi năm 2009 mới đạt 3.398 ha, chiếm tỷ lệ nhỏ khoảng 0,58% tổng diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng, nhưng đến năm 2013 diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng đã tăng lên 44.601 ha, chiếm 7,4% diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng [15]

Năm 2009 - 2013, tốc độ tăng trưởng bình quân 0,9 %/năm Diện tích nuôi tôm sú vẫn chiếm tỷ trọng lớn trong tổng diện tích nuôi với 558.795 ha, chiếm 92,6% tổng diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng và chiếm 94,9% tổng điện tích nuôi tôm sú của cả nước Tuy nhiên, diện tích nuôi tôm sú có xu hướng giảm dần trong giai đoạn 2009 - 2013 với tốc độ giảm bình quân 0,84%/năm Trong giai đoạn này, diện tích nuôi tôm nước lợ vùng Đồng bằng sông Cửu Long tăng bình quân 0,9 %/năm, sản lượng nuôi lại tăng bình quân 8,7%/năm (tăng từ 308.855 tấn lên 431.569 tấn), điều này cho thấy mức độ áp dụng khoa học công nghệ trong nuôi tôm nước lợ [15]

Năm 2013, theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, cả nước có khoảng 29 tỉnh, thành nuôi tôm nước lợ, với tổng diện tích thả nuôi 652.612 ha, sản lượng đạt 475.854 tấn Trong đó, khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long chiếm 92,5% diện tích và 79,8 % sản lượng của cả nước [15]

Tính đến thời điểm 31/10/2014, cả nước đã thả nuôi 675.830 ha (đạt 100,9% kế hoạch và bằng 103,6% so với cùng kỳ 2013), trong đó diện tích nuôi tôm sú là 582.514 ha, tôm chân trắng là 93.316 ha (đạt 133,3% kế hoạch năm 2014, bằng 146,4 cùng kỳ năm 2013) Sản lượng thu hoạch 568.668 tấn (đạt 103,4% kế hoạch năm 2014 và bằng 105,1% so với cùng kỳ 2013), trong đó sản lượng tôm sú đạt 240.937 tấn, tôm chân trắng 327.731 tấn [15]

1.2 Tình hình dịch bệnh ở tôm, nguyên nhân và phương pháp giải quyết

1 2 1 Tìn ìn dịc bện trên tôm nuôi

Từ năm 1990 - 1995 sản lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do dịch bệnh Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến

năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn Tại Việt Nam trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng [7]

Các chương trình nghiên cứu trên tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long cho

thấy các tác nhân gây bệnh chính bao gồm nhóm vi khuẩn Vibrio và các virus quan

trọng như MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrom Virus) (Nguyễn Văn Hảo và cs, 1997) Sự giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987) Dựa vào khoảng 49 đặc tính kiểu hình và khoảng 210 mẫu phân lập đại diện đã xác định vi

khuẩn gây bệnh là Vibrio harveyi, Vibrio cholerae dòng Albensis và Photobacterium

leiognathi [5]

Năm 2012, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 120 xã thuộc 54 huyện của 19 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 8.734 ha và bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 192 xã thuộc 52 huyện của 16 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 28.005 ha [15]

Năm 2013, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 282 xã thuộc 94 huyện của 28 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 8.734 ha So với năm 2012, dịch bệnh đốm trắng tăng 3.617 ha, tương đương khoảng 1,4 lần Số lượng xã, huyện, tỉnh có dịch cũng tăng so với cùng kỳ năm 2012 và dịch bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 199 xã thuộc 59 huyện của 19 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 5.875 ha So với năm 2012, dịch bệnh hoại tử gan tụy tăng chút ít về phạm vi có dịch, nhưng tổng diện tích chỉ bằng khoảng 21% [15]

Năm 2014, trong 9 tháng đầu năm, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 233 xã thuộc 65 huyện của 21 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 18.321 ha So với cả năm 2013, phạm vi dịch đã xuất hiện gần tương đương, nhưng diện tích bệnh lại cao hơn 1,5 lần, khoảng 5.970 ha và dịch bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 224 xã thuộc 59 huyện của 22 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 5.119 ha So với cả năm 2013, dịch đã xuất hiện ở phạm vi nhiều hơn, nhưng diện tích bệnh lại chỉ bằng 87%, khoảng 5.119 ha So với năm 2012, phạm vi có dịch bệnh xuất hiện nhiều hơn, nhưng tổng diện tích bị bệnh chỉ bằng khoảng 18% [15]

1.2.2 Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản

1.2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio.

Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là nhóm vi khuẩn có dạng hình que hay hình

dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 µm Vibrio không hình thành bào tử và

có khả năng chuyển động nhờ tiên mao hay nhiều tiên mao mảnh (Đỗ Thị Hòa, 2004) Là các vi khuẩn màu Gram âm, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, sinh khí H2S (Trần Linh Thước,

2008) Hầu hết các loài của chi Vibrio đều phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp ở 20 - 40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối

đe dọa cho nghề nuôi động vật thủy sản biển, đặc biệt giáp xác nuôi ven biển và trên biển Môi trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose) là môi trường chọn lọc

của Vibrio Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc này, Vibrio được chia

làm 2 nhóm: nhóm có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu vàng; nhóm không có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu xanh lá cây

Vibrio là vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 -

30oC [5]

Các loài Vibrio có mật độ cao trong môi trường nước, bao gồm cả cửa sông,

vùng nước ven biển và trầm tích biển và khắp nơi trong nuôi trồng thủy sản Một số

nghiên cứu cho thấy Vibrio xuất hiện với mật độ dày đặc trong sinh vật biển, như san

hô, cá, động vật thân mềm, tôm, cỏ biển, bọt biển và động vật nổi (Thompson và cs, 2004)

Kết quả nghiêncứu ở Việt Nam cho thấy, vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ Vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào

các ngày biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới [5]

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây r trên động vật thủy sản

Bệnh Vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do

vi khuẩn Vibrio spp gây ra Trong bệnh Vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân

sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh Vibriosis ở động vật thủy sản Cùng với việc thâm canh hóa nghề nuôi trong những năm gần đây, tôm nuôi của toàn thế giới đang chịu ảnh hưởng của dịch bệnh,

bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá và động vật thân mềm nước mặn phát triển, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản, đặc biệt là trong nuôi tôm

Vibrio harveyi là tác nhân gây bệnh chủ yếu cho tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei và tôm sú Penaeus monodon [5] Hiện nay người ta đã phân lập và định

danh được 172 chủng vi khuẩn từ tôm bệnh và tìm thấy khoảng 90% chủng vi khuẩn

thuộc nhóm Vibrio (Nguyễn Thị Tĩnh, 2010) Ở Việt Nam đã phân lập được các loài

Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae, Vibrio mimicus trên

cá, tôm nhiễm bệnh (Oanh et al, 1999) Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi

tôm khi việc sử dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều mà ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn kháng thuốc [5]

Nhầm ngăn ngừa những tổn thất do bệnh Vibriosis gây ra trên tôm cả về mặt môi trường kinh tế và kinh tế xã hội, cần phải có những giải pháp nhằm tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh đồng thời giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và hóa chất

1.2.3 Một số bệnh điển hình ở trong qua trình nuôi tôm

1.2.3.1 Bệnh thân đỏ đốm trắng (SEMBV - Systemic Ectodermal and Mesodermal

Baculovirus)

Tác nhân gây bệnh: bệnh thân đỏ đốm trắng là do một loại virus có tên khoa học viết tắt là SEMBV (Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus) gây ra Virus này cảm nhiễm ở các mô có nguồn gốc trung bì và ngoại bì như: mang, lớp biểu mô của vỏ, thần kinh, dạ dày và một số cơ quan khác Khi xâm nhập vào cơ thể tôm sẽ lan ra các bộ phận khác của cơ thể, khi chúng xâm nhập được vào tế bào sẽ xâm nhập tiếp vào nhân và phát triển về số lượng rất nhanh làm cho kích cỡ của nhân to ra ta thấy rõ qua kính hiển vi Khi virus phát triển đến một mức độ nào đó nó sẽ giết chết tế bào và virus sẽ bung cùng với tế bào ra khỏi cơ thể tôm lan truyền ra nguồn nước, khi gặp tôm khỏe khác lại tiếp tục xâm nhập và cứ thế tiếp diễn Nếu virus không xâm nhập được vào tế bào của tôm thì nó sẽ chết vì nó chỉ sống được tự do trong môi trường nước 4 ngày Virus này sống và tồn tại được trong môi trường nước ngọt và mặn do đó tôm nuôi ở các độ mặn khác nhau từ 5 - 40%o đều cảm nhiễm virus và gây bệnh Như thế cho thấy rằng virus này có khả năng gây bệnh cho tôm ở bất cứ ao nuôi tôm nào

Ngoài ra trên cơ thể những con tôm bệnh thân đỏ đốm trắng còn bị nhiễm các tác nhân

cơ hội khác như: vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật (Protozoa)… [22]

Dấu hiệu bệnh lý: con tôm yếu dạt vào bờ; trên thân tôm xuất hiện các đốm trắng tròn, to nhỏ khác nhau nằm dưới lớp vỏ kitin ở phần đầu ngực và vỏ các đốt bụng, cũng có một số ít trường hợp tôm bị bệnh này nhưng không có đốm trắng; màu sắc tôm chuyển sang màu hồng tối hoặc nhợt nhạt; khả năng tiêu hoá thức ăn bị giảm sút nghiêm trọng, đa phần các con tôm dạt bờ đều không ăn; tôm chết từ rải rác tới hàng loạt, có thể chết cả ao trong vòng 5 - 7 ngày, đặc biệt chết nhiều sau khi lột xác Kết quả kiểm tra mô học cho thấy nhân ở tế bào bị cảm nhiễm phình to chiếm chỗ cả

nguyên sinh chất [22]

1.2.3.2 Bệnh Monodon Baculovirus (MBV)

Tác nhân gây bệnh: bệnh MBV gây ra trên tôm bởi một loại virus thuộc giống

Baculovirus, thuộc nhóm virus có hình thể ẩn trong nhân tế bào mà nó cảm nhiễm

Dấu hiệu bệnh: nếu tôm giống thả nuôi có mức độ nhiễm MBV cao thì có thể gây chết hàng loạt trong hai tuần đầu, nếu không gây chết loại virus này cũng làm tôm mẫn cảm hơn với các tác nhân khác nên tôm nuôi thường hay bị còi cọc, chậm lớn và thường xuất hiện các dấu hiệu khác như đen mang, cụt râu, đỏ thân Một dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của những con tôm bị nhiễm MBV là sự tồn tại các thể ẩn hình cầu trong nhân tế bào gan, nhờ vậy có thể phát hiện được dễ dàng bệnh này dưới kính hiển vi

1.2.3.3 Bệnh đầ vàng (YHD - Yellow Head Disease)

Tác nhân gây bệnh: gây bệnh đầu vàng trên tôm nuôi là loại virus có tên Rhabdovirus Ðây là loài virus có nhân ARN Virus này có thể ký sinh ở nhiều nội quan khác nhau của tôm như: gan tụy, mang, máu, dạ dày… Ngoài ra, tôm bị bệnh đầu vàng còn có khả năng bị cảm nhiễm một số tác nhân cơ hội khác như: vi khuẩn, nguyên sinh động vật… [22]

Dấu hiệu bệnh lý: bệnh có dấu hiệu rất đặc thù là tôm nuôi đột nhiên tiêu thụ thức ăn mạnh hơn bình thường trong vài ngày liên tiếp, sau đó bỏ ăn hoàn toàn; tôm bị bệnh lờ đờ, bắt đầu dạt vào bờ ao; màu sắc của tôm trở nên nhợt nhạt, phần đầu ngực có màu vàng do gan tụy và mang tôm chuyển sang màu vàng, giáp đầu ngực bị phồng, mang tiết dịch có mùi hôi; sau 2 - 3 ngày kể từ khi có hiện tượng dạt bờ, tôm bắt đầu chết Sau 5 - 7 ngày có khả năng chết toàn bộ tôm trong ao [22]

1.2.3.4 Bệnh phát sáng ở ấ trùng tôm

Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra, nhất là ở tôm sú Trong thời gian gần đây nhiều bà con nuôi tôm sú bị thiệt hại nặng khi mua phải tôm sú giống nhiễm bệnh phát sáng [5]

Khi tôm bị bệnh phát sáng thường yếu, lờ đờ, kém bắt mồi, nặng có thể bỏ ăn, trong bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục Khi bệnh xảy ra trong các trại giống, tác hại thường lớn, đặc biệt ở các giai đoạn tiền ấu trùng như zoea, mysis Khi bệnh xảy ra ở dạng cấp tính có thể làm tôm ấu trùng chết hàng loạt, tỷ lệ chết có thể lên đến 100% trong bể ấp do sự nhiễm khuẩn toàn thân

Bệnh phát sáng thường gây tác hại lớn ở giai đoạn ấu trùng và hậu ấu trùng Giai đoạn ấu niên trong ao nuôi thịt cũng có thể bị ảnh hưởng, nhưng tác hại thấp hơn

Từ mẫu tôm bị bệnh phát sáng người ta đã phân lập được Vibrio harveyi,

Vibrio vulificus và Vibrio parahaemolyticus [5]

1.2.4 Các phương pháp xử lý

1.2.4.1 Phương pháp phòng bệnh

Việc đầu tiên phải làm trước mỗi vụ nuôi là làm tốt công việc sát trùng bể, ao, dụng cụ và nguồn nước trước mỗi đợt sản xuất

Đối với ao nuôi phải cải tạo ao thật kỹ, vét sạch bùn đáy, bón vôi, phơi ao, khoáng hóa nền đáy tiêu diệt mầm bệnh Nguồn nước phải được sát trùng bằng các phương pháp khác nhau: phương pháp cơ học (lọc), phương pháp hóa học (xử lý bằng thuốc sát trùng), phương pháp lý học (sát trùng bằng đèn cực tím), phương pháp sinh

học, phương pháp sinh thái để tiêu diệt và kìm hãm sự phát triển của Vibrio [7]

Độ mặn và nhiệt độ cao là điều kiện thuận lợi cho Vibrio phát triển mạnh Vì

vậy cần giảm độ mặn trong ao nuôi tôm thịt xuống 15 - 20‰ để kìm hãm sự phát triển

của Vibrio [7]

Vào mùa hè nhiệt độ thường cao, để hạn chế khả năng tăng nhiệt cần duy trì mức nước trong ao nuôi đạt độ sâu từ 1,2 - 1,5m Ô nhiễm môi trường trong quá trình nuôi do lượng thức ăn dư thừa và do động vật thủy sản thải ra là yếu tố nguy hiểm dẫn đến phát sinh dịch bệnh

Cần lựa chọn thức ăn có chất lượng tốt, xác định khẩu phần thức ăn chính xác, tránh dư thừa Với thức ăn tươi sống cần được sát trùng bằng một số thuốc diệt khuẩn (formalin, iodine) rồi rửa lại bằng nước sạch trước khi cho ấu trùng ăn

Có thể dùng chế phẩm vi sinh (probiotic) để cân bằng sinh thái trong hệ thống

nuôi và giảm lượng chất thải hữu cơ trong ao, bể, kìm hãm sự phát triển của Vibrio

gây bệnh Không dùng kháng sinh (antibiotic) để phòng bệnh, có thể dùng chất khử trùng (formol, …) để diệt khuẩn ngoài môi trường, nhưng phải lựa chọn nồng độ thuốc không ảnh hưởng tới vật nuôi và chỉ dùng khi thật sự cần thiết, coi đó chỉ là giải pháp cuối cùng

Khi bệnh đã xảy ra, trước khi xả bỏ, cần dùng thuốc diệt khuẩn (chlorine, formol) để sát trùng nước, diệt vi khuẩn [5]

Có thể tăng hệ miễn dịch tự nhiên của động vật nuôi thủy sản bằng quản lý môi trường tốt và bổ sung một số sản phẩm như vitamin C, A, E sẽ kích thích cơ quan tạo kháng thể; hạn chế dùng hóa dược trong nuôi trồng thủy sản Một biện pháp hữu hiệu nhằm tăng sức đề kháng của tôm và các loài động vật thủy sản khác là sử dụng nhóm vi sinh vật hữu ích gọi là vi sinh vật probiotic (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) như Zymetin, Dikaku và Biodream trộn vào thức ăn sẽ giúp cho động vật thủy sản tiêu hoá

tốt Các vi sinh vật này sẽ cạnh tranh thức ăn với các vi khuẩn Vibrio gây bệnh và chiếm địa bàn ở đường ruột của vật nuôi, loại bỏ vi khuẩn Vibrio gây bệnh trong ruột

vật nuôi [7]

Như vậy để phòng trị bệnh cho động vật thủy sản do Vibrio gây bệnh gây ra cần

thực hiện tốt các biện pháp từ khâu chọn giống ban đầu, cải tạo ao loại bỏ hết các chất hữu cơ vào đầu vụ và cuối vụ, thực hiện nuôi tôm trong độ mặn thấp, giữ nước có màu xanh vỏ đậu, hạn chế khả năng tăng cao nhiệt độ, không cho ăn dư, tăng cường sức khỏe tôm nuôi bằng thức ăn giàu dinh dưỡng, vitamine và bổ sung chế phẩm probiotic, xử lý môi trường nuôi và có mật độ nuôi phù hợp với trình độ quản lí… [5]

1.2.4.2 Phương pháp trị bệnh

Khi bệnh Vibriosis đã xuất hiện, có thể dùng kháng sinh để trị bệnh

Giảm mật độ vi khuẩn trong nước và cải thiện điều kiện môi trường bằng một sốbiện pháp kĩ thuật: xifon đáy, thay nước đáy, dùng một số loại thuốc diệt khuẩn

như: benzalkonoum chloride (BKC), iodine… sau đó thay một phần nước trong ao, gây lại màu nước [7]

Tuy vậy ở giai đoạn tiền ấu trùng và hậu ấu trùng, do sức chịu đựng của vật nuôi với thuốc rất kém và khi bệnh đã xảy ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp đã bỏ ăn, vì vậy dùng thuốc khó khăn và ít có hiệu quả [5]

1.3 Probiotic và tình hình nghiên cứu về probiotic cho tôm trên thế giới và Việt Nam

1.3.1 Khái niệm Probiotic

Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “cho cuộc sống” Khái niệm probiotic đã xuất hiện từ những năm đầu thế kỷ XX nhưng đến năm 1960 người ta mới quan tâm đến probiotic Đã có nhiều định nghĩa từ thuật ngữ này, như Lily và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên: probiotic là các chất được tiết ra bởi một loài vi sinh vật có khả năng thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác và có ý nghĩa ngược với kháng sinh Năm 1971, Sperti đã mô tả probiotic như là dịch chiết tế bào có khả năng kích thích sinh trưởng của vi sinh vật [8]

Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989) [3] Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học Một là: theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” Hai là: theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” [10]

Ngày nay, khái niệm probiotic dùng để chỉ những vi sinh vật sống được bổ sung vào đường tiêu hóa của con người và vật nuôi làm tăng cường sức khỏe cho con người và vật nuôi thông qua việc cải thiện cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruột [1] Probiotic là chất bổ sung chế độ ăn dựa vào các vi sinh vật sống, mà khi được sử dụng

với lượng thỏa đáng sẽ có tác dụng có lợi trên sinh vật chủ, cải thiện sự cân bằng hệ vi khuẩn ở ruột giúp ngăn ngừa rối loạn về tiêu hóa đặc biệt là các tình trạng tiêu chảy cấp hoặc tiêu chảy do sử dụng kháng sinh

1.3.2 Tác dụng của probiotic

1.3.2.1 Tăng cường khả năng tiê hó

Vi khuẩn probiotic giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng, giúp tiêu hóa các chất giàu năng lượng chưa được sử dụng, kích thích sự tăng trưởng tế bào, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại, làm cho hệ miễn dịch chỉ

phản ứng đối với các vi khuẩn gây bệnh Trong các thực phẩm lên men với Lactobacillus

sẽ làm tăng chất lượng, tăng khả năng tiêu hóa và đồng hóa các chất dinh dưỡng Vì

vậy, Lactobacillus đã được xem là nhân tố kích thích sự hấp thu dinh dưỡng Ngoài ra,

vi khuẩn probiotic tham gia cạnh tranh và kìm hãm sự sinh trưởng của các vi sinh vật có hại trong đường ruột giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột [12]

Probiotic kích thích tính thèm ăn, làm tăng khả năng hoạt động tiêu hóa của nhu động ruột, đồng thời tích lũy các chất và tiết ra các enzyme tiêu hóa như: α- amylase, protetase, lipase, cellulose (Han boong Industry Co.Ltd.2001) tiêu hóa các chất [2]

1.3.2.2 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiê hó

Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan trọng đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiết ra các kháng sinh hay là các chất cạnh tranh [3]

Probiotic tác động lên hệ vi sinh vật đường ruột với cơ chế tác động như: cạnh tranh chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh; cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng vào đường ruột, vị trí nào được các vi khuẩn probiotic gắn kết thì các độc tố đường ruột bị ngăn chặn; vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, những hợp chất này có thể làm giảm hoạt tính của các vi sinh vật gây bệnh, các độc tố được tạo ra và làm giảm khả năng trao đổi chất của vi khuẩn gây bệnh [3]

Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở các chủng probiotic đó là: Hydrogen peroxide, acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic, Bacteriocin, Diacetyl Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH trong khoang ruột

thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, acid lactic [9]

1.3.2.3 Kích thích hệ miễn dịch

Có nhiều nghiên cứu cho thấy tác động của việc bổ sung một số probiotic lên chức năng hàng rào miễn dịch của cơ thể Các nghiên cứu trên người cho thấy việc bổ

sung L.Casei, L.Bulgaricus và L.Acidophilus kích thích tăng sản sinh đại thực bào và

tăng thực bào đối với trẻ trẻ được bổ sung probiotic và giảm sự thẩm thấu của ruột khi

bổ sung Lactobacilli và ở những trẻ đẻ non được bổ sung Bifidobacteria tăng khả năng kháng khuẩn [1]

Ở người trưởng thành khi sử dụng L.Acidophilus La1 và Bifidobacteria làm tăng IgA đặc hiệu, cũng như B.Lactics làm tăng hoạt động thực bào chống lại E.Coli, tăng

khả năng tiêu diệt tế bào [4]

Ngoài ra, probiotic có thể góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, làm tăng hàm lượng globulin, tăng cường hiệu quả của một số vaccin như vaccin thương hàn Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của vi sinh vật hay hạt carbon, tăng khả năng sản xuất kháng thể thường gọi là IgG và IgM và interon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu) Probiotic còn tăng khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột như kháng thể IgA Như vậy probiotic tác động lên hàng rào miễn dịch của cơ thể theo cơ chế miễn dịch đặc hiệu (miễn dịch thu được) và miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên) Miễn dịch đặc hiệu tốt cần thiết cho việc bảo vệ cơ thể, giảm cơ hội cho các phản ứng gây viêm, loét hay dị ứng [6]

1.3.2.4 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose

Sự không dung nạp đường lactose xảy ra khá phổ biến ở nhiều người, ở những người bị viêm ruột mãn tính, cấp tính và những người phẫu thuật ruột, gây ra sự đầy hơi, khó tiêu khi hấp thụ thực phẩm có chứa đường lactose Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng không dung nạp đường lactose là do thiếu nghiêm trọng enzyme lactase (β-galactosidase) trong ruột, thiếu hụt có thể do thể trạng hoặc do tổn thương niêm mạc ruột Phần lớn lactose không chuyển hóa được ở ruột non sẽ tới đại tràng và tại đây lactose sẽ được sử dụng bởi tạp khuẩn, để sản sinh ra acid béo chuỗi ngắn như: hydrogen, methan và cacbonat làm cho chúng ta chướng hơi, co thắt ruột, đau từng

cơn và tiêu chảy Khi sử dụng càng nhiều sản phẩm chứa nhiều lactose thì hiện tượng này càng được biểu hiện rõ hơn [8]

Các chủng vi khuẩn lên men acid lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cải thiện các triệu chứng đầy hơi, khó tiêu khi sử dụng lactose Các thử nghiệm cho thấy

việc sử dụng lactose có trong sữa Proby tốt hơn sử dụng lactose trong các sản phẩm khác vì hoạt tính dung nạp lactose của β- galactosidase có trong Proby cao hơn nhiều

Hầu hết các vi khuẩn probiotic sử dụng để lên men sữa bao gồm Lacitc bulgaricus và

Lactic thermophiles vừa sản sinh ra lactose vừa khích thích lactose trong ruột sản sinh,

giúp cải thiện rõ rệt khả năng dung nạp lactose và hỗ trợ tiêu hóa ở đường ruột [10]

1.3.2.5 Sinh tổng hợp ra các chất kháng ng thư và chống các yếu tố đột biến

Một số chủng Lactobacilli như Lactoacidophius làm giảm hoạt độ ủa các enzyme

β- glucoronidase, nitroreductase và azoreductase là những enzyme xúc tác sản sinh các chất gây ung thư trong hệ tiêu hóa Probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết, ung thư bàng quang, ngoài ra probiotic còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu [9] Nhờ sự sản xuất các hợp chất kháng ung thư: sinh ra những acid yếu có lợi cho đường ruột như acid butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương mau lành và hồi phục chức năng Điều hòa những enzyme gây tiền chất ung thư ruột, ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch [18]

1.3.2.6 Một số tác dụng khác

Probiotic ngoài những tác động trên còn có một số tác động như: ngăn ngừa bệnh tiêu chảy, các rối loạn tiêu hóa đường ruột, giảm cholesterol trong máu, cải thiện nhu động ruột… [24]

1.3.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng probiotic trong nuôi tôm trên thế giới và Việt Nam

Khi sử dụng một loại probiotic thân thiện môi trường có tên thương mại là Environ - AC của tập đoạn Biostadt India Ltd, để xử lý sinh học môi trường ao nuôi tôm ở một trang tại tôm sú tại làng Srijang gần Chandipur nằm ở vùng duyên hải Balasore ven biển Oissa (Ấn Độ) thì khi phân tích mẫu nước trước khi sử dụng probiotic đã cho thấy sự hiện diện của NH3, H2S, NO2 và mật độ vi khuẩn Vibrio rất cao Trong khi

đó, sau khi sử dụng Probiotic thì từ ngày nuôi thứ 70 trở đi, mức độ độc hại không chỉ

giảm mà còn giảm triệt để tới bằng mức 0, số lượng Vibrio cũng giảm đi đáng kể Những

phát hiện tương tự như các quan sát thực hiện bởi Ravichandranand Jallaluddin (2000) sử dụng Environ - AC với liều lương đầu 25kg/ha, sau đó là 10 Kg cách tuần [14]

Nghiên cứu này cho thấy trong ao được xử lý probiotic, các quần thể vi khuẩn

Vibrio phát triển chậm trong khi đó, ở ao không được xử lý bằng probiotic số lượng Vibrio tăng rất nhanh Prabhu và cộng sự (1999) trong nghiên cứu của mình cũng thấy

được mức độ ammoniac andnitrie trong ao xử lý băng probiotic thấp hơn trong ao đối chứng Nghiên cứu của Jha và Naik (2007, 2008, 2009) cho thấy ao nuôi sử dụng

probiotic có tỷ lệ vi khuẩn Vibrio rất hạn chế và không hình thành các loại khí độc

hại như amoniac, nitrit hydrogen sulphide, vv, trong khi ở các ao đối chứng, vi khuẩn

Vibrio tăng nhanh và phát hiện nhiều loại khí độc hại [14]

Tất cả các tác giả trên đều khuyến cáo việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi

tôm để phân hủy các chất hữu cơ, làm giảm và kiểm soát vi khuẩn Vibrio gây bệnh cũng

như các chất chuyển hóa độc hại, từ đó duy trì điều kiệnmôi trường ao phù hơp để tôm sống sót và đạt năng suất cao hơn

Ở Việt Nam, Probiotic cũng đã được ứng dụng trong nuôi tôm sú và tôm hùm Đã có một số nghiên cứu khoa học về tác động của Probiotic trong quá trình

ương ấu trùng tôm sú Penaeus monodon, so sánh với các bể ương không sử dụng

probiotic Kết quả cho thấy, hàm lượng NH3 ở các bể thí nghiệm là 1,25 mg/L, thấp hơn ½ so với các bể đối chứng, sự chênh lệch kích cỡ tôm ở bể đối chứng cao hơn so với bể có sử dụng probiotics, tỉ lệ cơ ruột của PL15 là 85-92% đối với các bể có sử dụng Probiotic và 70 -80% đối với bể đối chứng, độ dài trung bình của PL15 đạt kích cỡ lớn hơn ở tôm ương có sử dụng probiotics và tỉ lệ sống (PL15) của bể đối chứng chỉ là 35%, trong khi đối với bể có sử dụng probiotic thì con số này là 52% Điều này chứng tỏ: probiotics đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng, phát triển, tỉ lệ sống và tình trạng sức khỏe của ấu trùng tôm sú [13]

Để đối phó với tình trạng dịch bệnh trên tôm hùm nuôi ở Việt Nam và ngăn chặn tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh để phòng, trị bệnh, Dự án về Quy trình nuôi tôm hùm khép kín đã được triển khai ở vịnh Cam Ranh (Khánh Hòa) Nhóm nghiên cứu

gồm trường Đại học Wageningen (Hà Lan), Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 3 và Trung tâm Khuyến nông Khuyến ngư Quốc gia Thí nghiệm được tiến hành trong các

lồng nuôi cá thể bố mẹ Panulirus ornatus với 03 nghiệm thức, được lặp lại hai lần

nhằm đánh giá hiệu quả của chế phẩm sinh học Probiotics

Nghiệm thức đầu là nghiệm thức đối chứng, không sử dụng Probiotics, hai nghiệm thức còn lại sử dụng Probiotics với liều lượng khác nhau Việc đánh giá mức tăng trưởng của tôm hùm được tiến hành mỗi tháng thông qua việc cân và đo mẫu Đồng thời, mẫu máu của tôm thí nghiệm cũng được đưa về Viện Kỹ thuật Sinh học tại

Hà Nội để kiểm tra các bệnh thường gặp trên tôm hùm như bệnh do Vibrio, bệnh

Taura, bệnh đốm trắng và bệnh Rickettsia (RLB) Theo kết quả bước đầu, trong điều kiện phòng thí nghiệm, sản phẩm vi sinh có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các chủng gây bệnh phân lập được trên tôm thí nghiệm Dự án vẫn tiếp tục nghiên cứu sâu thêm về khả năng ngăn chặn vi khuẩn gây bệnh trong điều kiện nuôi thực tế [13]

Bacillus là vi khuẩn gram dương, catalse dương tính, nhóm vi khuẩn này thường

tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao Phần lớn tế bào có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu, có kích thước khác nhau (0,5 - 2,5) x

(1,2 - 10) µm

Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thẩu Khi gặp điều kiện lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng

Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que Thường

thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng

Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn Bacillus có khả năng

chịu được các điều kiên khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức ăn và bảo

vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi gặp khô hạn (Trần Thị Thu Hiền, 2010)

Hầu hết các Bacillus không gây độc cho người và động vật, một số loại gây độc

cho côn trùng Chúng có khả năng sinh enzim ngoại bào do đó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp… [11]

1.4.3 Một số loại Bacillus thường gặp trong tự nhiên

1.4.3.1 Bacillus subtilis

Hình dạng: có dạng hình que, ngắn và nhỏ, kích thước 0,6 x (3 - 5) µm Bacillus

subtilis là vi khuẩn gram dương, đôi khi các tế bào nối lại với nhau tạo thành chuỗi

dài, ngắn khác nhau hoặc các tế bào đứng riêng lẻ Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thách, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch [11]

Bacillus subtilis có lớp màng nhày (giáp mạc) được cấu tạo chủ yếu từ polypeptit

chủ yếu là axit polyglutamic Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt, nhờ màng nhày có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi khô hạn Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của

Bacillus subtilis là 360C- 500C tối đa khoảng 600C, là loại ưa nhiệt cao Bào tử của

Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao Bào tử có hình bầu dục, kích thước

0,6µm - 0,9µm Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm [11]

Các vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô

thực vật và góp phần tạo ra các nốt trên củ khoai tây bị u Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu Chúng là nguyên nhân gây hỏng bánh mì và nhiều thực phẩm khác

Bacillus subtilis sinh ra rất nhiều loại enzim, đặc biệt là α- amylase và protease kiềm

có giá trị cao, ngoài ra Bacillus subtilis có khả năng sinh ra riboflavin Vì vậy chúng

được ứng dụng nhiều trong công nghiệp cũng như một số ngành khác [11]

1.4.3.2 Bacillus megaterium

Bacillus megaterium có tế bào của nó khá lớn, gấp 2 lần tế bào Bacillus subtilis,

chiều ngang (1,2 - 1,5) µm, có thể đến 2 µm, dài từ 3 - 12 µm, ở các giống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưởng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) Tế bào lơn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7 - 1) µm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 - 1,5µm Chúng nằm lệch tâm theo chiều ngang hoặc xiên cuả tế bào Khuẩn lạc tròn đều, không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, lổi nhẵn, nhưng thường có viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng

đơn giản không cần them bất kì một yếu tố sinh trưởng nào Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzim tương tự như Bacillus subtilis nên cũng được ứng dụng trong

nhiều ngành công nghiệp [11]

1.4.3.3 Bacillus mensentericus

Bacillus mensentericus rất giống Bacillus subtilis, thường có trong đất, hạt mì và

ngũ cốc, đặc biệt trên khoai tây và cỏ khô Hình dạng tế bào hình que mảnh, dài ngắn khác nhau (3 - 10) x (0,5 - 0,6) µm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi dài Khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, nhăn nhúm, khô không mọc lan ra môi trường thường có màu xám nhạt hoặc trắng hơi vàng kem, vàng nâu, hồng hoặc

đen Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus mensentericus là

36 - 45oC tối đa là 50 - 55oC, ở pH từ 4.5 - 5 thì nó ngừng phát triển Bào tử của

Bacillus mensentericus thường có hình bầu dục và dài khoảng 0,5 - 0,9 µm, nằm ở vị

trí bất kì trong tế bào, tế bào không phình ra khi mang bào tử Bacillus mensentericus có hoạt tính enzim amylase và protease cao hơn hẳn Bacillis subtilis nhưng lên men

đường kém hơn Đây cũng là loại ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuât enzim protease và amylase…

Ngoài ra nó còn sinh ra một số hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn (như

Vibrio) gọi là Bacterioxin [11]

1.4.3.4 Bacillus cereus

Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 - 1,5) x (3 - 5) µm, có khi dày hơn,

chúng thường đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi Bào tử có hình bầu dục có kích thước 0,9 x (1,2 - 1,5) µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào

Khuẩn lạc của Bacillus cereus là khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục,

mép lồi lõm Bào tử của nó phát tán khắp nơi trong đất, nước và không khí… thường sinh sôi và nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm Nó còn được áp dụng để sản xuất thuốc kháng sinh [11]

1.4.3.5 Bacillus pumilu

Bào tử phát tán rộng khắp moi nơi, thường Bacillus pumilus có mặt trong đất nhiều hơn Bacillus subtilis Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mở lan không ranh giới Tế bào của nó gần giống với tế bào của Bacillus subtilis

1.4.3.6 Bacillus polymyxa

Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 - 1) x (2 - 7) µm đứng riêng rẽ

hay xếp thành đôi hoặc chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình

quả chanh Khuẩn lạc của Bacillus polymyxa không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày,

lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 - 2,6) µm, nằm giữa tế bào Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaacrit trong cây, chúng còn có khả năng cố định đạm Chúng thường sinh trưởng và phát triển trên thực vật đang bị hỏng Vì vậy, người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Môi trường kem và những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này Chúng là nguồn để sản xuất thuốc kháng sinh polimixin Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược [11]

1.4.3.7 Bacillus brevis

Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm Bacillus brevis

là trực khuẩn kích thước (0,7 - 1) x (3 - 5) µm Chúng thường đứng riêng rẽ Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ (0,8 - 1) µm, nằm cuối tế bào làm cho tế bào hơi bị phồng to lên Khuẩn lạc thường màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép

răng cưa giống dạng mỡ đặc Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu hỗn hợp

axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [11]

1.4.3.8 Bacillus simplex

Tế bào của Bacillus simplex thường nhỏ bé, có kích thước (2 - 5) x 0,6 µm,

thường đứng riêng rẽ không kết nối thàng chuỗi Khuẩn lạc giống khuẩn lạc của

Bacillus cereus, phẳng khá khuếch tán, với bề mặt hơi xù xì, hơi lõm, màu đục, mép

lồi lõm Đặc biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng

và tiết vào môi trường Bào tử có hình bầu dục, có kích thước từ 0,6 - 0,9 µm [11]

1.4.3.9 Bacillus linchenniformis

Bào tử của chúng chủ yếu phát tán trong đất Chúng sinh trưởng và phát triển trên các loại thực phẩm Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra Bacitracin, một loại kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được úng dụng phổ biến trong nông nghiệp dược và sản xuất kháng sinh dung trong chăn nuôi làm chất kích thích sinh trưởng

[11]

1.4.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn thuộc chi Bacillus

1.4.4.1 Cải thiện sức khỏe

- Đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa:

+ C ng cấp dinh dưỡng trực tiếp: Bacillus đã trực tiếp cung cấp chất dinh dưỡng

cho vật nuôi đặc biệt là acid béo và vitamin Nghiên cứu tương tự trên tôm thẻ trưởng

thành (Penaeus chinensis) cho thấy hệ vi sinh vật đã cung cấp nguồn dinh dưỡng và là nguồn thức ăn trực tiếp cho tôm Vì vậy, ứng dụng vi khuẩn Bacillus trong nuôi trồng

thủy sản thường cho kết quả cao về tỉ lệ sống, tăng trưởng và hiệu quả kinh tế

+ Hỗ trợ tiê hó : vài loài vi khuẩn đã được nghiên cứu trên động vật hai mãnh

vỏ cho thấy vi khuẩn còn góp phần hỗ trợ tiêu hóa do chúng sản sinh các enzyme như proteases, lipases, giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn [23]

- Tăng cường các phản ứng miễn dịch:

Vi khuẩn có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Một nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow trout), kết quả làm

tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng hoạt động thực bào của bạch cầu Một nghiên cứu khác của Rengpipat et al., (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho rằng sử dụng Bacillus spp giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã

tiết ra các chất làm tăng đáp ứng cả miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể Balcázar

(2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống

chế Vibrio harveyi và virus đốm trắng Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei et al., (2009) trộn Bacillus subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ Bacillus subtilis cũng

tăng nhanh trong hệ tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm

1.4.4.2 Cải thiện môi trường

Phân hủy các chất thải: Bacillus tiết ra enzyme phân hủy các chất như carbohydrate,

chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn Chúng cũng có khả năng phân hủy các

chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm Bacillus có tác dụng làm giảm CO2, H2S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi Do nhóm vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn vi

khuẩn gram (+) thường phân hủy vật chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn nhóm gram (-) Urê và axit uric có trong thành phần chất thải của động vật nuôi thủy sản Quá trình amôn hóa urê trãi qua 2 giai đoạn, urê sẽ bị thủy phân tạo thành muối carbonate amôn Ở giai đoạn 2, carbonate amôn chuyển hóa thành NH3, CO2 và H2O Axit uric bị các vi sinh vật phân giải thành urê và acid tactronic Sau đó urê sẽ tiếp tục bị phân giải thành NH3 Bacillus tham gia trong quá trình amôn hóa protein là quá trình phân giải các hợp

chất hữu cơ chứa nitơ, giải phóng NH3 Ban đầu protein bị phân cắt thành pepton, polypeptid oligopeptid, dipeptid và acid amin Một phần axit amin sẽ được tế

bào Bacillus hấp thu làm chất dinh dưỡng, phần khác sẽ thông qua quá trình khử amin

tạo thành NH3 và nhiều sản phẩm trung gian khác tùy theo điều kiện Sản phẩm cuối cùng chủ yếu của quá trình vô cơ hóa hiếu khí protein là ammonia, carbonic, các muối của acid sulfuric và acid phosphoric [23]

Giảm chất độc NH3, H2S: trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô

cơ hóa hoàn toàn, bên cạnh NH3 và CO2 còn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ khác như acid hữu cơ, rượu, H2S và những dẫn suất của nó như mecaptan, các chất độc như diamin và tomain, indon và scaton Đây là lý do người nuôi luôn phải duy trì hàm lượng oxy hòa tan cao, nhất là oxy ở đáy ao luôn cao để đảm bảo quá trình phân hủy

hữu cơ xảy ra hoàn toàn Ứng dụng Bacillus trong trường hợp này làm tăng quá trình

phân hủy hữu cơ tránh đáy ao, làm giảm các chất dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi đáy ao [23]