Nấm trichodema

tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm gây bệnh, sinh độc tố trên nông sản và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học đem lại ý nghĩa thực tiễn, dần thay thế được các loại thuốc hóa học độc hại

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

ĐỖ THỊ DINH

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

Trichoderma PHÒNG CHỐNG NẤM

Aspergillus flavus GÂY HỎNG MỘT SỐ NÔNG SẢN

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy Ngành Công nghệ sinh học

(Chương trình đào tạo chuẩn)

HÀ NỘI 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

ĐỖ THỊ DINH

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM Trichoderma PHÒNG CHÔNG NẤM Aspergillus flavus GÂY HỎNG

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp cử nhân Đại học của mình, em vô cùng biết ơn tập thể các thầy cô giáo Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu và tạo mọi điền kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phạm Đức Ngọc – Bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp này Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các chị Nguyễn Thị Hồng, Phạm Thị Tuyến học viên cao học K25 và các bạn sinh viên K59 trong viện IRIAT đã giúp đỡ, hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khuyến khích em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2018

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Số lượng chủng Trichoderma phân lập được từ các mẫu đất 23

Bảng 2: Khả năng đối kháng nấm A flavus của các chủng Trichoderma 26 Bảng 3: Kích thước vòng đối kháng nấm A flavus từ dịch chiết ngoại bào của các

Hình 6: Hình thái T harzianum trên kính hiển vi 11

Hình 7: Sợi nấm Trichoderma kí sinh trên nấm gây bệnh Rhizoctonia solani 13

Hình 8: Mô hình pha loãng mẫu để phân lập các chủng Trichoderma từ đất 19

Hình 9: Hình thái khuẩn lạc các chủng Trichoderma đã phân lập được trên môi trường PDA 24

Hình 10: Hình thái các chủng Trichoderma dưới kính hiển vi điện tử 25

Hình 11: Khả năng kháng nấm A flavus của các chủng Trichoderma đã phân lập được 27

Hình 12: Khả năng sử dụng một số nguồn cơ chất của các chủng Trichoderma 28

Hình 13: Khả năng kháng nấm A flavus của dịch chiết ngoại bào 29

Hình 14: Khả năng phân giải cơ chất từ dịch ngoại bào của một số chủng Trichoderma 29

Hình 15: Khả năng kháng A flavus sau 7 ngày của chủng Trichoderma D4 31

Hình 16: Nấm Trichoderma D4 trên cơ chất thóc sau 12 ngày ủ 32

Hình 17: Chế phẩm Trichoderma D4 33

Hình 18: Trichoderma D4 phân lập từ chế phẩm phát triển bình thường trên đĩa môi trường PDA 33

Hình 19: Khả năng kháng A flavus của nấm Trichoderma trong chế phẩm 34

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.1 Tổng quan về nấm A flavus 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đăc điểm hình thái 3

1.1.3 Sinh thái của nấm A flavus 4

1.1.4 Độc tố aflatoxin do nấm A flavus sản sinh 5

1.1.4.1 Các loại độc tố aflatoxin 5

1.1.4.2 Sự nhiễm aflatoxin trên một số nông sản 6

1.1.4.3 Hậu quả nhiễm độc tố aflatoxxin 7

1.2 Các biện pháp phòng chống nấm A flavus gây hỏng nông sản hiện nay 7

1.2.1 Biện pháp vật lý 7

1.2.2 Biện pháp hóa học 8

1.2.3 Biện pháp sinh học 8

1.3 Giới thiệu về nấm Trichoderma 10

1.3.1 Phân loại nấm Trichoderma 10

1.3.2 Đặc điểm hình thái 10

1.3.3 Sinh thái 11

1.3.4 Vai trò của nấm Trichoderma 12

1.3.4.1 Trichoderma là tác nhân kiểm soát sinh học (BCA) 12

1.3.4.2 Trichoderma thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPR) 13

1.3.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ nấm gây hại cây trồng và nông sản 14

2.1 Nguyên liệu 16

2.1.1 Các chủng vi sinh vật 16

2.2.2 Thiết bị và hóa chất 16

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 18

2.3.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma đối kháng từ đất vùng rễ 18

2.3.2.1 Phương pháp phân lập 18

2.3.2.2 Phương pháp tuyển chọn chủng Trichoderma đối kháng nấm A flavus gây hỏng một số nông sản 19

2.3.3 Phương pháp định danh vi nấm Trichoderma 20

2.3.3.1 Phân tích đặc điểm hình thái 20

2.3.4 Xác định khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau để sinh trưởng và phát triển 20

2.3.5 Xác định hoạt tính đối kháng nấm A flavus và khả năng phân giải cơ chất của dịch ngoại bào 20

2.4.1 Lựa chọn cơ chất phù hợp 21

2.4.2 Kiểm tra hoạt tính kháng nấm A flavus của nấm Trichoderma phân lập được từ chế phẩm đã sản xuất 22

3.1 Phân lập các chủng Trichoderma từ vùng rễ của một số cây trồng 23

3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Trichoderma phân lập được 24

3.3 Kết quả sàng lọc các chủng Trichoderma có khả năng kháng nấm A flavus 26

3.4 Khả năng sử dụng một số nguồn cacbon khác nhau của các chủng Trichoderma để sinh trưởng 27

3.5.1 Hoạt tính đối kháng nấm A flavus của dịch ngoại bào 29

3.5.2 Khả năng phân giải một số cơ chất của dịch ngoại bào 29

3.6 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Trichoderma kháng nấm A flavus 31

3.6.1 Lựa chọn cơ chất phù hợp làm chế phẩm bằng cách lên men trên cơ chất

MỞ ĐẦU

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm là điều kiện thuận lợi để trồng nhiều loại nông sản khác nhau, nhưng bên cạnh đó đây cũng là môi trường lý tưởng để nhiều loại nấm mốc phát triển Ngoài một số nấm có lợi phục vụ cho đời sống con người thì vẫn còn tồn tại nhiều nấm gây thiệt hại về kinh tế cũng như sức khỏe của chính chúng ta, điển hình trong số đó phải kể

đến nấm mốc Aspergillus flavus- nguyên nhân hàng đầu gây hỏng nhiều nồng sản trước và sau thu hoạch như: ngô, lạc, thóc…Bên cạnh đó, A flavus còn có khả năng

hình thành độc tố aflatoxin tích tụ trong nông sản, đây là độc tố có thể làm suy giảm hệ thống miễn dịch, chậm phát triển, ung thư và thậm chí là gây tử vong đối với con người và vật nuôi

Với sự phát triển của khoa học công nghệ, có rất nhiều biện pháp được sử

dụng để phòng trừ nấm A flavus cũng như độc tố mốc trên nông sản, tiêu biểu phải

kể đến các biện pháp vật lí: sấy, lọc, bức xạ tử ngoại, bức xạ ion hóa… và biện pháp hóa học sử dụng một số hóa chất như: thiosulfit, amoniac, natriprobionat hay canxipropionat …Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp vật lý đòi hỏi chi phí cao

để có thể kiểm soát được khả năng nhiễm A flavus cũng như độc tố aflatoxin trên

nông sản, trong khi đó phương pháp hóa học đem lại nhiều bất cập như: hình thành nhiều loại nấm kháng thuốc, hóa chất tồn dư ảnh hưởng đến đất nuôi trồng, ô nhiễm môi trường, đe dọa sức khỏe con người…Trong khi đó các biện pháp phòng trừ sinh học đang rất được ưa chuộng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp do hiệu quả phòng trừ tốt và lợi ích bền vững mà nó đem lại

Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu trong việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm gây bệnh, sinh độc tố trên nông sản và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học đem lại ý nghĩa thực tiễn, dần thay thế được các loại

thuốc hóa học độc hại Dựa trên cơ sở này chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu

sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng nấm Trichoderma phòng chống nấm Aspergilus flavus gây hỏng một số nông sản.”

Mục tiêu của đề tài là phân lập và tuyển chọn được một số chủng

Trichoderma có khả năng kháng nấm A flavus và bước đầu sản xuất chế phẩm sinh học chứa Trichoderma với quy mô phòng thí nghiệm mang tính ứng dụng cao

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập và sàng lọc các chủng Trichoderma từ vùng rễ cây có hoạt tính

kháng nấm

- Tuyển chọn, định danh các chủng có hoạt tính kháng nấm A flavus mạnh

- Đánh giá khả năng kháng nấm A flavus của hoạt chất có trong dịch nuôi từ

các chủng nghiên cứu

- Nghiên cứu sản xuất chế phẩm quy mô trong phòng thí nghiệm từ chủng

Trichoderma được chọn

1.1.2 Đăc điểm hình thái

Nấm A flavus dễ dàng nhận biết bởi màu vàng hơi lục, có dạng ít nhiều vón

cục của tán Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng có vách sần sùi, hình thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài Các thể chai hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua một lớp thể bình trung gian (thể bình hai lớp) đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7µm), hình cầu màu vàng nâu đến

hơi lục, hơi sần sùi Đôi khi người ta coi A flavus là những loài nấm có cuống bào

tử đính xù xì và hai lớp thể bình [4]

Hình 1: (A)Nấm A flavus trên môi trường nuôi cấy, (B) Hình thái nấm A flavus

trên kính hiển vi [32]

1.1.3 Sinh thái của nấm A flavus

A flavus có ở trong đất, trong không khí, trên các chất hữu cơ và các loại hạt

nhất là các loại hạt có dầu Từ lâu người ta đã phát hiện thấy sự có mặt của chúng ở trong đất: trong rừng, vùng than bùn, đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hệ rễ lúa mì hoặc ngay kể cả đất vùng hoang sa mạc [32] Đất đai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài này hơn đất đai vùng ôn đới Chúng thường gặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường

chứa loại này A flavus cũng có rất nhiều trên sợi bông và nhất là trên hạt bông,

xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp hoặc nhờ các vết thương do côn trùng gây ra

Ngoài ra người ta còn thấy A flauvs trên: lạc, hạt và khô dầu tương, củi dừa, sắn,

nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường, quả lê, giăm bông, dồi thịt và

nhiều thức ăn khác Nếu gặp điều kiện thuận lợi, A flavus sinh sôi và phát triển

rất nhanh: trên lúa mì tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2% đến 17% bào tử của chúng chiếm 50-70% tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón

lại thành một lớp vỏ cứng 0.6m và A flavus cũng thường xuất hiện trên hạt ngô khi

độ ẩm vượt quá 15,5% [5]

Hình 2: Một số nông sản nhiễm nấm A.flavus [21, 23]

(A) Lạc nhiễm nấm mốc A flavus; (B) A flavus trên bắp ngô; (C) A flavus trên đậu

tương

Bào tử của nấm A flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước

và trong đất Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn

Nấm A flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn, trên

một số loại hạt làm thực phẩm như: lạc, đậu, vừng ; trên thực phẩm như: các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị

dập như: thanh long, nhãn, xoài, vải,… Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển, chúng sản xuất ra độc tố aflatoxin [18]

1.1.4 Độc tố aflatoxin do nấm A flavus sản sinh

Aflatoxin là đại diện nổi bật cho nhóm độc tố nấm mycotoxin và A flavus là

một trong những nấm quan trọng sản xuất ra độc tố này (ngoài ra còn có một số

nấm khác như: A parasiticus, A nomius,…) [27] Aflatoxin được tích lũy trong một

số nông sản như: ngô, đậu phộng, hạt bông Trong các độc tố nấm mycotoxin, afltoxin được biết đến sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương

diện [15]

1.1.4.1 Các loại độc tố aflatoxin

Có bốn loại aflatoxin thường xuất hiện trong các hạt nông sản và thực phẩm là: AFB1, AFB2 (phát huỳnh quang màu xanh blue dưởi tia UV) và AFG1, AFG2( phát huỳnh quang màu xanh lá cây green) Aflatoxin B1, B2 trong cơ thể động vật có vú được chuyển hóa thành aflatoxin M1, M2 Trong đó độc tố AFB1 được biết đến với nồng độ cao nhất và cũng là loại có khả năng gây độc và gây ung thư cao nhất[22]

Hình 3: Các loại độc tố aflatoxin chính [8]

Hình 4: Độc tố aflatoxin do A flavus sinh ra phát huỳnh quang màu xanh dưới tia

UV [36]

1.1.4.2 Sự nhiễm aflatoxin trên một số nông sản

Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trên các thực phẩm khác nhau nhưng sự nhiễm hầu hết tập trung ở lạc và các hạt có dầu khác bao gồm: hạt dẻ, bông, ngô…Các điều tra ở Mỹ với trên 1500 mẫu ngô thu hoạch được ở các vụ mùa trong giai đoạn 1969-1970, chủ yếu từ các nguồn thương mại, đã cho thấy rằng từ 2-3% mẫu nhiễm aflatoxin B1 và G1 ở khoảng từ 3-37 µg/kg Trong nghiên cứu tiếp theo từ vùng đông-nam của Mỹ, tìm thấy 21/60 mẫu ngô nghiên cứu nhiễm aflatoxin ở mức từ 6-308 µg/kg cũng trong các năm từ 1969-1970 Ở một số bang đông nam nước Mỹ, ngô ngoài đồng bị nhiễm aflatoxin với tần số cao, ở một số mẫu có mức độ nhiễm aflatoxin B1 dao động từ vài nghìn ppg/kg hoặc cao hơn [8] Ở Thái Lan đã tìm thấy 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 400 µg/kg) [35], Uganda là 40% (mức trung bình 133 µg/kg) và con số lên dến 97% ở đảo Sebu của Philippin với mức trung bình đạt 213 µg/kg [8, 11]

Theo Goto và cộng sự, 85% số mẫu ngô sau thu hoạch thu thập được trong các kho bảo quản vào mùa mưa ở Thái Lan năm 1984-1985 đã bị nhiễm aflatoxin B1 với lượng 6,3-1310 ppb và 0,6-767 ppb tương ứng Trong khi đó ở Việt Nam, Đào Ngọc Hậu và các công sự đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc và độc tố aflatoxin trên ngô ở các tỉnh Thanh Hóa và Sơn La cho thấy: kết quả nghiên cứu 24

mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột đã bị nhiễm A flavus với tần số cao từ 50-80%, ngoài ra còn một số loại nấm khác như A glacus, A fumigatus, A candidus…Và

mức nhiễm aflatoxin B1 trên mẫu ngô hạt là 33% với lượng từ 10-40 ppb, con số này lên tới 72% đối với mẫu ngô bột (lượng từ 25-250 bbp), 8,3% mẫu ngô hạt

nhiễm aflatoxin B2 với lượng 10-20 ppb và trên ngô bột là 9.5% (lượng từ 10-20 bbp) [3]

1.1.4.3 Hậu quả nhiễm độc tố aflatoxxin

Các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thử nghiệm phòng thí nghiệm cho thấy sự nhiễm độc độc tố này thể hiện qua hàng loạt các triệu chứng cấp tính hoặc mãn tính Nhiễm độc cấp tính hậu quả nặng nhất có thể làm chết vật bị nhiễm Sự nhiễm độc mãn tính có tính di truyền theo ba kiểu: gây ung thư, quái thai và gây đột biến Hậu quả nhiễm độc tố aflatoxin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau và L50 (Lethal Dose- liều lượng gây chết cho 50% vật phơi nhiễm) cũng rất khác nhau tùy theo loài: 0.5 mg/kg cho vịt con, 60 mg/kg đối với chuột nhắt Những rối loạn do nhiễm độc aflatoxin mãn tính thể hiện đầu tiên ở sự chán ăn, chậm lớn sụt cân nhưng rối loạn lớn nhất xảy ra là ở gan Người ta đã tìm thấy bằng chứng liên quan giữa aflatoxin và ung thư gan tiên phát, một trong những bệnh gây tử vong cao ở Châu Á và Châu Phi Ngoài u ở gan, aflatoxin còn có khả năng gây tổn thương ở rất nhiều cơ quan khác Điển hình aflatoxin B1 có thể cảm ứng tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh [7]

1.2 Các biện pháp phòng chống nấm A flavus gây hỏng nông sản hiện nay

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm mưa nhiều

là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc nói chung và A flavus nói riêng phát triển gây

hại nông sản Chúng có khả năng phát triển tốt trên các loại nông sản có độ ẩm cao đồng thời sản sinh ra độc tố có khả năng lây nhiễm sang người và động vật Để hạn chế và loại trừ chúng nhiễm trên nống sản cần có biện pháp kiểm soát, bảo quản hữu hiệu từ giống, phân bón, đồng ruộng, thu hoạch, vận chuyển, bảo quản, chế biến,…[6]

1.2.1 Biện pháp vật lý

Các biện pháp vật lí được sử dụng bao gồm: sấy khô (có thể phơi trực tiếp nông sản dưới ánh nắng mặt trời hoặc sử dụng máy sấy khô làm cho cơ chất đạt lượng nước cho phép khoảng 12-14%), chiếu xạ (sử dụng các loại tia có bước sóng ngắn thường sử dụng là tia cực tím giúp tiêu diệt các loại vi khuẩn, nấm mốc có trên nông sản) hay sử dụng một số loại khí tiếp xúc liên tục với nông sản như CO2,

ozon,…cũng có khả năng ngăn cản sự phát triển của nấm mốc nói chung và A flavus nói riêng [29]

1.2.2 Biện pháp hóa học

Có rất nhiều chất hóa học khác nhau có thể hạn chế sự nhiễm nấm mốc trên một số nông sản Trong đó phải kể đến một số axit hữu cơ như: axit propionic, axitaxetic, axit benzoic, axit sorbic hay các muối natri và canxi của chúng như natriprobionat hay canxipropionat Các axit hoặc muối của các axit trên với nồng độ từ 1-3% có thể ức chế sự phát triển nấm mốc trong thời gian dài, làm chúng không thể lây lan và phát triển lan rộng trong nông sản Một số hợp chất hóa học hữu cơ khác như: thiosulfit, NaHSO3, Na2SO3, thiabendazon, tinh dầu thực vật (tinh dầu cam ở liều 0.2%), mentho liều 1,1% và một số tinh dầu khác như: tinh dầu hôi, tinh dầu được chiết xuất từ cây tỏi Chúng đều có khả năng ức chế được sự phát triển của nhiều loài nấm mốc [24]

1.2.3 Biện pháp sinh học

Trong khi các biện pháp vật lý, hóa học còn những nhược điểm như: chi phí thực hiện cao, không đảm bảo do có thể tồn dư lượng thuốc hóa học trong thực phẩm, môi trường…thì phương pháp sinh học luôn là sự lựa chọn bền vững và lâu dài Trong đó việc sử dụng các loài vi sinh vật có lợi có khả năng kháng nấm và kích thích sinh trưởng đang rất được quan tâm Những vi sinh vật này sẽ được bổ sung dưới dạng chế phẩm sinh học để phòng trừ nấm gây hại nông sản ngay trên đồng ruộng, ngoài ra chúng còn có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng Một

số vi sinh vật thường được sử dụng như: Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Trichoderma spp…Các chế phẩm sinh học hiện nay được xem là tiềm năng cho nền

nông nghiệp xanh, bền vững khắc phục được những hậu quả do thuốc bảo vệ thực vật

Sự tương tác giữa thực vật với các vi sinh vật vùng rễ có thể giúp thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và khả năng kháng bệnh hại Các vi sinh vật có ích vùng rễ được chia thành hai nhóm theo vai trò: vi sinh vật có vai trò kích thích sinh trưởng của thực vật (PGPR) và vi sinh vật có vai trò như tác nhân kiểm soát sinh học (BCA) Tuy nhiên, một số vi sinh vật có cả hoạt tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật

và kiểm soát sinh học, ví dụ loài Sinorhizobium: PGPR được biết đến với khả năng

cố định đạm giúp cây tăng trưởng đồng thời chúng cũng tiết ra các hợp chất bảo vệ thực vật có vai trò kiểm soát mầm bệnh (BCA) [12]

PGPR thúc đẩy tăng trưởng thực vật theo các cách khác nhau, PGPR có thể sử dụng làm phân bón sinh học, kích thích sinh trưởng, yếu tố kiểm soát sinh học hoặc kết hợp cả ba vai trò trên [37] Phân bón sinh học thúc đẩy tăng trưởng thực vật bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp cung cấp chất dinh dưỡng cho thực vật Cụ thể PGPR có thể cung cấp các chất dinh dưỡng hạn chế trong đất như nitơ, sắt, phốt pho Nitơ chủ yếu được cung cấp cho cây nhờ PGPRs có khả năng cố định nitơ trong khí quyển thành dạng amoni [16] Đất chứa một lượng lớn phốt pho nhưng ở dạng khó hòa tan cây không sử dụng được, vi sinh vật chuyển phốt pho từ dạng khó hòa tan thành dạng hòa tan bằng cách sử dụng photphatase hoặc axit hữu cơ, do đó cây có thể hấp thụ được [10] Vi sinh vật có khả năng cạnh tranh với nguyên tố dinh dưỡng Fe nhờ khả năng sinh siderophores- những hợp chất có phân tử lượng thấp do vi sinh vật sinh ra và có khả năng tạo phức với Fe3+, làm tăng tính chống chịu của cây, sản sinh ra các chất kích thích sinh trưởng và có khả năng phân giải độc tố do vi sinh vật gây bệnh sinh ra PGPR thúc đẩy tăng trưởng thực vật trực tiếp bằng cách tiết ra hormone tăng trưởng, indole-3-acetic acid (IAA) là auxin thực vật phổ biến nhất có khả năng mở rộng, biệt hóa các tế bào thực vật và các mô và kích thích sự kéo dài rễ [20]

Kiểm soát sinh học (BCA): kiểm soát sinh học là kết quả của nhiều loại tương tác khác nhau giữa các sinh vật, những tương tác này có thể ảnh hưởng đáng kể đến cây trồng BCA được nghiên cứu để đối kháng lại các tác nhân gây bệnh bằng nhiều cơ chế: kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng, enzymes lytic… Kháng sinh là phương thức ức chế trung gian và kháng sinh do vi sinh vật tiết ra phụ thuộc vào nồng độ, thể tích có thể ức chế các tác nhân gây bệnh cây trồng Thông thường vi khuẩn có thể tiết ra một hoặc nhiều loại hợp chất có hoạt tính kháng sinh Bên cạnh tiết các hợp chất có hoạt tính kháng sinh nhiều vi sinh vật còn sinh ra các enzyme lytic có thể thủy phân một số hợp chất cao phân tử bao gồm chitin, protein,

cellulose, hemicellulose Ví dụ như kiểm soát Sclerotium rolfsii bởi Serratia marcescens do hoạt động của enzyme lytic phân giải chitin Các vi sinh vật có thể

cạnh tranh dinh dưỡng với các tác nhân gây bệnh làm ức chế quá trình sinh trưởng của chúng Sự kết hợp của BCAs với các phương pháp trước đây đã thực hiện một

cuộc cách mạng trong công nghiệp Các vi sinh vật BCA chủ yếu là: Bacillus thuringiensis, Trichoderma spp [14]

1.3 Giới thiệu về nấm Trichoderma 1.3.1 Phân loại nấm Trichoderma

Phân loại khoa học của nấm Trichoderma:

Trichoderma được phân thành năm nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum [33]

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Trichoderma được nhận biết trên môi trường nuôi cấy ở giai đoạn đầu là có

màu trắng sau đó chuyển dần thành màu xanh hoặc xanh vàng Sợi nấm

Trichoderma phân nhánh, thường được hình thành ở dạng gần như vòng tròn đồng

tâm ở phần trục chính gần cực [33]

Hình 5: Màu sắc và hình thái khuẩn lạc của một số chủng Trichoderma trên PDA

Hầu hết các loài Trichoderma sinh sản vô tính, bào tử đính là một khối tròn mọc lên ở đỉnh của cuống sinh bào tử mang các bào tử trần bên trong Trichoderma

có đặc điểm nổi bật là cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, phân nhánh, có vách ngăn và bào tử nhiều,có màu xanh đặc trưng , một số ít thì có màu trắng (như

Trichoderma Viride), vàng hoặc xanh xám Bào tử nấm mịn, thường xuất hiện ở

dạng khô tuy nhiên một số loài chúng có thể được nằm trong giọt có màu xanh lá

cây hoặc màu vàng như: Trichoderma viride, Trichoderma flavofuscum… Bào tử

đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy theo từng loài Đa số bào tử trơn láng, kích thước không vượt quá 5µm [14]

Hình 6: Hình thái T harzianum trên kính hiển vi: (a) cuống bào tử, (b) bào tử đính,

(c) bào tử [13]

1.3.3 Sinh thái

Trichoderma spp là nhóm vi nấm phổ biến ở đất tự nhiên, đất nông nghiệp,

đồng cỏ, rừng ngập mặn và đất sa mạc Chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực Bắc đến các vùng núi cao cũng như vùng nhiệt đới Tuy nhiên, có một sự tương quan giữa sự phân bố các loài và các điều kiện môi trường

Trichoderma là vi nấm ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt

Tuy nhiên thường không chịu được độ ẩm quá thấp và điều này được cho là một

yếu tố góp phần làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rệt ở những nơi có độ ẩm

thấp Nhiệt độ thích hợp để phát triển mạnh là từ 25-300

C, song các loài

Trichoderma spp khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau [33]

1.3.4 Vai trò của nấm Trichoderma

Trichoderma là vi sinh vật vùng rễ cây trồng được biết đến vừa có vai trò thúc

đẩy tăng trưởng của thực vật (PGPR) và vừa có vai trò như tác nhân kiểm soát sinh

học (BCA) [30]

1.3.4.1 Trichoderma là tác nhân kiểm soát sinh học (BCA)

Trong các tài liệu nghiên cứu trước đây, Trichoderma được biết đến là một

nấm đối kháng và chúng có khả năng kháng lại một số nấm gây bệnh cây trồng

thường gặp như: Fusarium, Sclerotium, Các cơ chế kiểm soát sinh học khác nhau

của nấm bao gồm: cạnh tranh sinh trưởng, ký sinh và tiết kháng sinh[40]

Trichoderma cạnh tranh sinh trưởng với nấm gây hại bằng cách cạnh tranh

và hấp thụ các ion sắt bằng cách giải phóng các siderphores Bên cạnh đó các

Trichoderma còn cạnh tranh về dinh dưỡng đối với các vi sinh vật sống trong đất

hay trên bề mặt rễ cây khi xảy ra sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng [40]

Một cơ chế khác nữa của Trichoderma đối kháng nấm gây bệnh là ký sinh

nấm Kí sinh nấm là một quá trình phức tạp khi đó một loại nấm tồn tại bằng cách sử dụng một loại nấm khác như là nguồn dinh dưỡng, quá trình này liên quan đến một chuỗi các thay đổi trong chuyển hóa ở cả hai đối tượng [38] Năm 1932,

Weinding đã mô tả hiện tượng Tricoderma kí sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho nó

là: “Giao thoa sợi nấm” (Cnyder 1976) Hiện tượng này gồm ba giai đoạn như sau:

(1) sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh, (2) sau đó sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi gây bệnh, (3) cuối cùng là sợi nấm Trichoderma

đâm xuyên làm thủng lớp tế bào của nấm gây bệnh làm nấm gây bệnh chết Cho

đến nay, nghiên cứu về ký sinh nấm được tập trung chủ yếu trên nấm Trichoderma spp Trichoderma tiết ra enzyme làm tan vách tế bào của các nấm khác, sau đó

những sợ nấm có thể xâm nhập vào bên trong và sử dụng đối tượng nấm khác làm nguồn dinh dưỡng cho chúng Vách tế bào nấm là một cấu trúc phức tạp, chứa 80-90% carbohydrate (chủ yếu là polysaccharides như glucans, chitin, cellulose và mannans) và 10-20% protein, lipid, các ion và các chất màu hữu cơ Nấm thuộc chi

Trichoderma sinh ra các enzyme ngoại bào có tác dụng làm tan vách tế bào của nấm

bệnh như N-β- acetylglucosaminidases, chitinase, β-1,3-glucanases [39] Thành phần của thành tế bào trên nấm gây bệnh là một đặc tính quan trọng để cảm ứng trong quá trình sản xuất enzyme

Hình 7: Sợi nấm Trichoderma kí sinh trên nấm gây bệnh Rhizoctonia solani: (A)

hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên nấm bệnh; (B) hệ enzyme của nấm Trichoderma phân giải vách sợi nấm bệnh tạo thành những lỗ trên bề mặt tạo điều kiện thuận lợi cho Tricoderma thâm nhập [34]

Cơ chế thứ ba là tiết kháng sinh, kháng sinh là kết quả của quá trình tiết ra các hợp chất kháng khuẩn của nấm đối kháng để ngăn chặn hoặc diệt các nấm gây bệnh ở vùng lân cận, gần khu vực tăng trưởng của nó Các chất chuyển hóa do

Trichoderma sinh ra như: các chất bay hơi, enzyme ngoại bào hoặc các chất kháng

sinh được coi là các yếu tố liên quan đến cơ chế kháng sinh Các chất này có tác dụng phá vỡ màng lipid, tham gia vào hoạt động kháng khuẩn và cảm ứng kháng các tác nhân gây bệnh cây trồng [39]

Nấm Trichoderma có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp như: nấm đối kháng

để phân giải chất hữu cơ trong đất, phòng trừ tuyến trùng và nhiều loại nấm hại cây

trong đất Một số loài tiêu biểu như Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, Trichoderma hamatum, Trichoderma reesei, Trichoderma virens [40]

1.3.4.2 Trichoderma thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPR)

Ngoài khả năng kháng lại một số nấm hại, Trichoderma còn giúp kích thích sự tăng trưởng cây trồng.Vi nấm Trichoderma có thể có ảnh hưởng trực tiếp hoặc

gián tiếp đến sự kích thích sinh trưởng của cây trồng Ảnh hưởng của vi nấm

Trichoderma spp với sự kích thích sinh trưởng của cây trồng bao gồm ảnh hưởng trực tiếp và ảnh hưởng gián tiếp Nấm Trichoderma spp ảnh hưởng trực tiếp bằng

hình thức sản xuất các chất chuyển hóa Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu về khả

năng kích thích sinh trưởng của Trichoderma spp và một số nhà nghiên cứu đã đề

nghị sản xuất hoocmon tăng trưởng và tăng cường chuyển hóa của vùng rễ thực vật

dựa vào tác động trực tiếp của Trichoderma spp lên thực vật Ví dụ như Trichoderma harzianum có tác dụng trong kích thước sinh trưởng của dâu tây [28]

Bên cạnh đó sự cộng sinh của nấm và rễ cây cũng có ảnh hưởng đến kích

thích sinh trưởng thực vật Sự hiện diện của nấm Trichoderma spp trong rễ cũng

như trong phần phụ của rễ có chức năng tăng cường hấp thu dinh dưỡng cho cây và

Trichoderma spp Cũng dễ dàng có được các chất dinh dưỡng từ các chất nền như

protein-tanin và glucosamine trong đất do quan hệ cộng sinh với rễ Do đó,

Trichoderma spp được sử dụng phổ biến làm chất thải ủ trong đất nông nghiệp giúp

kích thích sinh trưởng thực vật [31] Một số báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng, một

số chủng Trichoderma có khả năng tiết indole-3-acetic acid (IAA) chất có khả năng

mở rộng và biệt hóa của các tế bào thực vật và các mô và kích thích sự kéo dài rễ

[19, 26] Trichoderma spp được công nhận là nấm có khả năng ký sinh nấm tốt,

chúng cảm ứng và kháng lại các tác nhân gây bệnh thực vật và chúng được xem như một yếu tố gián tiếp kích thích sinh trưởng thực vật [40]

1.3.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ

nấm gây hại cây trồng và nông sản

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều nước đã có những nghiên cứu sử dụng

nấm Trichoderma để trừ bệnh hại trên cây trồng và nông sản Ở Nam Mỹ, người ta dùng nấm T.harzianum phòng trừ các nấm Pythium spp và R solani gây bệnh chết héo đậu và củ cải (Chet và cộng sự,1981) Ở Ấn Độ, hiệu quả ức chế bệnh do R Solani gây trên khoai tây của nấm T harzianum đạt tới 89.1% Ở Thái Lan, sử dụng nấm T.viride phòng trừ bệnh thối thân cà chua do nấm S rolfsii: tỷ lệ cây sống đạt 91.7%; trong khi đó ở đối chứng chỉ đạt 61.9% Ở Philippin, nấm T harzianum làm giảm đáng kể tỷ lệ bị bệnh do nấm R.Solani ở đậu xanh: tỷ lệ bị bệnh khi dùng T harzianum là 14-19%; đối chứng là 79-86% (Davide, 1991) Hiện nay tại Mỹ, các chế phẩm PlantshieldTM và RootshieldTM từ loài Trichoderma harzianum chủng T22 đã được khuyến cáo để sử dụng phòng trừ một số bệnh do nấm Phytophthora, Pythium, Fusarium trên một số cây trồng Chế phẩm được sử dụng bằng cách phun lên lá, tưới hay bón vào đất Promote Plus cũng là một chế phẩm Trichodermma (Trichoderma koningii và Trichoderma harzianum) được khuyến cáo sử dụng tại

đây để phòng trừ nấm Rhizoctonia solani, một số loài Pythium, Phytophthora [25]

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu

thành công trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số bệnh hại cây trồng như: chế phẩm Trichoderma thử nghiệm trên cây rau tại huyện Củ Chi, TP Hồ Chí Minh của Viện Sinh học Nhiệt đới, chế phẩm Trichoderma thử

nghiệm trên cây xà lách xoong ở Vĩnh Long của Bộ môn Bảo vệ thực vật - trường

Đại học Cần Thơ, chế phẩm Trichoderma sử dụng trên cây rau của bộ môn Bảo vệ

thực vật - trường Đại học Nông Lâm TP HCM Chế phẩm sinh học đa chức năng

MT1 của Viện Bảo vệ thực vật ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do nấm Phytophthora spp., chế phẩm Trichoderma spp phòng trừ bệnh thối quả ca cao do nấm Phytophthora palmivora của Viện Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên Theo Nguyễn Minh Châu (2009), sử dụng nấm Trichoderma trộn với phân hữu cơ

bón vào đất, tưới nước giữ ẩm để phòng trừ một số bệnh thối rễ, vàng lá, nứt

gốc…cho vườn cây ăn quả khá tốt Các vương ươm sử dụng nấm Trichoderma

phòng trừ được bệnh do nấm gây hại trên cây giống Phối trộn

nấm Trichoderma với phân chuồng bón cho vườn cây theo định kỳ thì hiệu quả

càng tăng lên [2] Không những có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh,

nấm Trichoderma còn giúp thúc đẩy tiến trình phân giải chất hữu cơ nhanh hơn

được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gian hoai mục [1]