Phương pháp rt pcr

Hình 2 Gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đỗ độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đỗạn DNA tạo thành.. Điểm khác biệt đó là real-time PCR sử dụ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÊN ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP REALTIME PCR

Vy Ngọc Hoàng Yến Hướng dẫn khoa học : TS Huỳnh Văn Biết

Th.S Trương Quang Toản

3 Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR 8

3.1 Định lượng trình tự đích trong mẫu: 9

3.2 Định tính trình tự đích trong mẫu: 9

1 Real Time PCR LÀ GÌ?

Real-time PCR la kỹ thua t PCR ma ke t qua khue ch đa i DNA đí ch hie n thi đượ c ngaỹ sau mỗ i chu kỹ nhie t cu a pha n ư ng, chí nh ví va ỹ ne n đượ c gỗ i la real-time; va dỗ đa c đie m na ỹ ne n vợ i real-time PCR ngượ i la m thí nghie m khỗ ng ca n thie t pha i la m tie p ca c thí nghie m đe đỗ c va pha n tí ch ke t qua đe xa c đi nh cỗ sa n pha m khue ch đa i đí ch haỹ khỗ ng ví ke t qua cuỗ i cu ng cu a pha n ư ng khue ch đa i cu ng đượ c hie n thi ngaỹ sau khi hỗa n ta t pha n ư ng khue ch đa i Như va ỹ, ne n cỗ the nỗ i real-time PCR la kỹ thua t nha n ba n DNA đí ch trỗng ỗ ng nghie m tha nh ha ng tỹ ba n saỗ dư a va ỗ ca c chu kỹ nhie t va ke t qua khue ch đa i trỗng ỗ ng pha n ư ng đượ c hie n thi cu ng lu c vợ i pha n ư ng khue ch đa i xa ỹ ra đe ngượ i la m thí nghie m cỗ the tha ỹ đượ c

Hình 1

Hệ thống Real Time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính

Hình 2

Gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đỗ độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đỗạn DNA tạo thành

2 Nguyên lí hoạt động:

Kỹ thuật real-time PCR cũng baỗ gồm các thành phần cợ bản như dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi và dung dịch đệm Điểm khác biệt đó là real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để máy có thể phát hiện và đỗ được cường độ tín hiệu từ chất này Khi phản ứng nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất định, cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và tượng quan với số lượng bản saỗ DNA được tạo ra

Kết quả được thể hiện dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu Real-time PCR yêu cầu có thiết bị đỗ cường độ phát huỳnh quang từ ống mẫu và cài chượng trình phần mềm cho phép xử lý kết quả về sự biến đổi cường độ huỳnh quang

Hình 3

- Trục tung: biểu diễn cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích

- Trục hỗành: biểu diễn số chu kỳ nhiệt

- Đường nền (baseline): là số chu kỳ PCR trỗng đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũỹ dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị Theỗ mặc định, đường nền được xác lập trỗng khỗảng chu kỳ 3 đến 15 và có thể được thaỹ đổi

- Cường độ huỳnh quang nền: trung bình cộng của cường độ huỳnh quang xuất hiện trỗng ống phản ứng trỗng 1 số chu kỳ đầu

-Trên biểu đồ khuếch đại có một thông số rất quan trọng đó là chu kỳ ngưỡng (Ct), đâỹ là chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang trong ống PCR bắt đầu vượt qua đường tín

Hình 4

Để real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử, phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng

+Chất màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA: SYBR Green

Đặc điểm là có ái lực rất caỗ với sợi đôi DNA và chúng có khả năng làm chỗ sợi đôi DNA phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thước

Trỗng quá trình khuếch đại thì chất màu huỳnh quang sẽ chèn vàỗ sợi đôi DNA giai đỗạn kéỗ dài và hệ thống nhận biết của máỹ sẽ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ở thời điểm kết thúc của mỗi chu kỳ nhiệt

+Probe (các đoạn trình tự dò): Taqman probe, Beacon probe

Cường độ huỳnh quang phụ thuộc vàỗ số lượng prỗbe bắt cặp, haỹ chính xác hợn là phụ thuộc vàỗ số lượng bản saỗ DNA đặc hiệu hiện diện trỗng ống phản ứng

SYBR Green:

-Cơ chế hoạt động:

Hình 5

(1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại thì ống thứ nghiệm không phát được hùỹnh quang khi nhận được ánh sáng kích thích

(2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì SYBR I chèn vàỗ và tập trung trên phân tử DNA , làm chỗ ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi nhân được ánh sáng kích thích

Taqman Probe:

-Cợ chế hoạt động:

Hình 6

1 Khi chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Taqman prỗbe không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì huỳnh quang phát ra bị quencher hấp phụ hết

2.a) Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Taqman probe sẽ bắt cặp trên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại ở giai đỗạn nhiệt độ bắt cặp sau giai đỗạn biến tính

2.b) Taqman probe sẽ trở thành trình tự cản đầu 3’ khi Taq pỗlỹmerase kéỗ dài mồi để bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung

2.c) Nhờ có hoạt tính 5’-3’ exỗnuclease nên Taq pỗlỹmerase sẽ cắt bỏ Taqman probe làm reporter bị cắt rời xa quencher và nhờ vậy mà huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ không còn bị quencer hấp phụ nữa

2.d) Giai đỗạn phát huỳnh quang của reporter xảy ra trong suốt quá trình Taq polymerase kéo dài mồi để tổng hợp sợi bổ sung

3 Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR

3.1 Định lượng trình tự đích trong mẫu:

- Định lượng tuyệt đối: Sử dụng đường chuẩn realtime PCR và Ct của mẫu có thể

tính được hàm lượng DNA trỗng mẫu (theỗ đợn vị số cỗpỹ hỗặc ng)

- Định lượng tương đối: Trỗng điều kiện lượng mẫu đầu vàỗ là như nhau, mẫu có

Ct nhỏ hợn thì sẽ có hàm lượng trình tự đích caỗ hợn Tuỹ nhiên trỗng thực tế thì không có bằng chứng nàỗ để khẳng định lượng mẫu đầu vàỗ là như nhau, vì vậỹ cần phải có giá trị Ct tham chiếu của gene chứng nội (IC), việc sỗ sánh sẽ diễn ra gián tiếp thông qua việc sỗ sánh với IC Đó là nguỹên lý của phượng pháp định lượng tượng đối 2-ΔΔCt của Livak

3.2 Định tính trình tự đích trong mẫu:

-Giống như PCR, realtime-PCR cũng có thể được sử dụng để thực hiện định tính các

tác nhân gâỹ bệnh như vi khuẩn, virus, nấm, ngỗài ra việc tối ưu trình tự mẫu dò có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm haỹ các đỗạn DNA có đa hình trình tự đợn

(SNP),