Ứng dụng kỹ thuật realtime pcr phát hiện asfv

Trong realtime PCR tín hiệu huỳnh quang được đo sau mỗi chu kỳ và cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ phản ánh lượng DNA được khuếch đại trong mẫu tại thời điểm cụ thể đó Kralik và Ricchi,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR TRONG PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ASFV

NGUYỄN HỒ MINH THƯ ĐẶNG THỊ HẰNG

TP Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR TRONG PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ASFV

ĐẶNG THỊ HẰNG

2.1.1 African Swine Fever Virus (ASFV) 2

2.1.2 Cơ chế xâm nhiễm của ASFV 3

2.1.3 Triệu chứng của dịch tả lợn Châu Phi 4

2.1.4 Khả năng lây nhiễm của ASFV 5

2.2 Kỹ thuật realtime PCR 6

2.2.1 Realtime PCR sử dụng đoạn dò (probe) 6

2.2.2 Realtime PCR sử dụng chất phát huỳnh quang bám vào sợi đôi DNA 7

2.2.3 Biểu đồ khuếch đại của realtime PCR 8

2.2.4 Định lượng trong realtime PCR 10

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11

DANHSÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASF: African Swine Fever

ASFV: African Swine Fever Virus Bp: Basepair

DNA: Deoxyribonucleoic Acid

ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent assay EthBr: Ethidium bromide

HPV: Human Papilloma Virus Kbp: Kilobasepair

LAMP: Loop-mediated isothermal amplification PCR: Polymerase Chain Reaction

qPCR: Realtime PCR

RPA: Recombinase Polymerase Amplification SDS: Sodium Dodecyl Sulfate

VF: Virus Factory

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Lịch sử phát hiện của ASFV 2

Hình 2.2 Cấu tạo của ASFV 3

Hình 2.3 Cơ chế xâm nhiễm của ASFV vào tế bào vật chủ 4

Hình 2.4 Triệu chứng lâm sàng trên lợn do ASFV gây ra 5

Hình 2.5 Đoạn dò có nhãn huỳnh quang (probe) 7

Hình 2.6 Chất phát huỳnh quang bám vào sợi đôi DNA 8

Hình 2.7 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng realtime PCR 10

Hình 4.1 Kết quả của realtime PCR 13

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Chăn nuôi lợn cùng với lúa nước có vai trò quan trọng trong hệ thống sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam Nói chung lợn có một số vai trò nổi bật như cung cấp thực phẩm, cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp chế biến Và cung cấp phân bón cho cây trồng, phân lợn là một trong những nguồn phân hữu cơ tốt, có thể cải tạo và nâng cao độ phì của đất, đặc biệt là đất nông nghiệp Chăn nuôi lợn có thể tạo ra nguồn nguyên liệu cho y học trong công nghệ sinh học y học, lợn đã được nhân bản gen để phục vụ cho mục đích nâng cao sức khỏe cho con người

Bảo vệ được đàn lợn an toàn trước mọi khó khăn, cải thiện năng suất hàng ngày để có chi phí sản xuất thấp nhất, chất lượng cao là những mục tiêu người chăn nuôi hướng tới Nhưng trong quá trình chăn nuôi, vấn đề dịch bệnh vẫn là một trở ngại rất lớn đối với việc chăn nuôi lợn Trong đó dịch tả lợn Châu Phi ASF là bệnh truyền nhiễm gây ra bởi ASFV là bệnh nguy hiểm cần được chú ý vì tỉ lệ gây chết cao có thể lên đến 100% đối với mọi độ tuổi Dịch tả lợn Châu Phi đang lây lan rất nhanh và gây thiệt hại khá lớn về kinh tế cho người nông dân dù đã có vắc-xin phòng trừ

Vậy nên đứng trước tình hình đó việc tìm ra phương pháp phát hiện nhanh chóng để khống chế tình hình dịch bệnh kịp thời là rất quan trọng và cấp thiết Với vấn đề này nhóm em tập trung tìm hiểu: “Ứng dụng kỹ thuật real time PCR trong việc phát hiện và định lượng virus gây dịch tả lợn Châu Phi”

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử dịch tả lợn Châu phi

Dịch tả lợn Châu Phi (ASF) là một bệnh dịch trên lợn rất dễ lây lan do African Swine Fever Virus (ASFV) gây ra, trong đó vật chủ tự nhiên duy nhất là lợn ASFV là thành viên duy nhất của họ Asfarviridae và là virus arbovirus DNA duy nhất được biết đến

ASFV được phát hiện lần đầu tiên ở Kenya vào năm 1921 Giữa cuối những năm 1950 và đầu những năm 1980, ASFV được xuất hiện ở Châu Âu, Nga và Nam Mỹ Kể từ năm 2018, AFSV đã được tìm thấy tại Trung Quốc Bệnh bùng phát lần đầu tiên tại Việt Nam vào đầu tháng 2 năm 2019, sau đó nhanh chóng lan rộng ra khắp các tỉnh thành trên toàn quốc, bệnh đã đe dọa nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam Do cấu trúc phức tạp của virion và bộ gen ASFV cũng như vòng đời của nó, khiến mầm bệnh này trở thành mối đe dọa nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn toàn cầu và nền kinh tế quốc gia

2.1.1 African Swine Fever Virus (ASFV)

African Swine Fever Virus (ASFV) là virus DNA icosahedral, có đường kính khoảng 200 nm bao gồm vỏ bọc, capsid, màng nang trong, vỏ lõi và lõi trong Bộ gen của virus là một phân tử DNA sợi đôi dài 170 – 190 kb tuyến tính với các đầu đóng cộng hóa trị, kích thước của DNA là 170 – 190 kb tùy thuộc vào chủng virus và mã hóa 150-200 protein virus, bao gồm 68 protein cấu trúc và hơn 100 protein phi cấu trúc Đường kính của các hạt virus nằm trong khoảng 260 – 300 nm

Bộ gen của các chủng phân lập khác nhau có chiều dài khác nhau trong khoảng từ 170 - 190 kb và mã hóa từ 151 - 167 khung đọc mở với vùng bảo tồn có kích thước

Hình 2.1 Lịch sử phát hiện của ASFV

khoảng 125 kb và hai đầu biến đổi có kích thước lần lượt là 38 – 48 kb và 13 – 22 kb mã hóa ra hơn 50 protein khác nhau tùy vào từng chủng virus Bộ gen của ASFV mã hóa hơn 50 protein và các biến thể trình tự ở một số vùng nhất định của bộ gen được sử dụng để xác định kiểu gen Các chủng ASFV lưu hành trên toàn thế giới đã được phân loại thành 24 kiểu gen khác nhau, gen p72 (B646L), p54 (E183L), CD2v (EP402R), vùng biến trung tâm của pB602L và vùng trình tự lặp lại song song giữa các gen I73R và I329L

Capsid bao gồm một protein chính (p72) và bốn protein nhỏ (pM1249L, p17, p49 và pH240R) Vỏ capsid của virus được tạo thành từ protein p72, là một trong số các protein của virus có tính kháng nguyên cao protein p72 được mã hóa bởi gen B646L đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành vỏ capsid trong quá trình xâm nhiễm của virus Đây cũng là đặc tính quan trọng để có thể phát hiện đươc ASFV

2.1.2 Cơ chế xâm nhiễm của ASFV

Sự sao chép bộ gen của ASFV xảy ra đầu tiên là ở trong nhân, nhưng sau đó chủ yếu ở tế bào chất ASFV xâm nhập vào tế bào chủ thông qua hai cơ chế là endocytosis (I) và macropinocytosis (II)

Hình 1.2 Cấu tạo của ASFV

Cơ chế lây nhiễm của ASFV thông qua sự xâm nhập, vận chuyển, sao chép bộ gen, phiên mã, dịch mã, hình thành VF và lắp ráp và giải phóng các virion mới Đại thực bào bạch cầu đơn nhân là tế bào chủ chính của ASFV

Chu kỳ lây nhiễm ASFV bắt đầu bằng việc virus sẽ tiếp xúc với bề mặt và xâm nhập vào tế bào chủ Để lây nhiễm tế bào chủ thành công, virus phải trải qua sáu sự kiện bao gồm bám, xâm nhập, mở lớp, sinh tổng hợp, đóng gói và phát tán

2.1.3 Triệu chứng của dịch tả lợn Châu Phi

Có các triệu chứng lâm sàng khá đa dạng tuy nhiên các triệu chứng thường xuyên Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc bệnh dịch tả lợn Châu Phi là bỏ ăn hoặc kén ăn, sốt cao, khi quan sát thấy tình trạng xuất huyết dưới da phổ biến ở các vùng da mỏng như tai, đùi, bụng và ngực Các nốt xuất huyết xuất hiện được xem là dấu hiệu đặc trưng của hoại tử tím đen ở vùng trung tâm Hậu môn dính máu, máu chảy từ hai lỗ mũi từ ngày thứ 2-3 kể từ khi phát sốt Một số con có biểu hiện nôn ói trước khi chết, lợn thường chết cấp tính sau 2-3 ngày có các biểu hiện của triệu chứng lâm sàng trên Một số ít lợn vượt qua giai đoạn này nhưng chúng thường run rẩy, tụ lại và nằm tập trung dưới đèn sưởi

Phần lớn các lợn khi bệnh mổ sẽ xuất hiện các tổn thương điển hình của bệnh như: thận xuất huyết điểm nghiêm trọng, lách phì đại nằm vắt ngang xoang bụng Hệ thống hạch lympho như: hạch dưới hàm, hạch trung thất, hạch bẹn nông, hạch màng treo ruột, … đều xuất huyết ngiêm trọng (riêng hạch dạ dày – gan và hạch thận sưng, xuất

Hình 2.3 Cơ chế xâm nhiễm của ASFV vào tế bào vật chủ

huyết nghiêm trọng như khối máu tụ) Cơ tim, túi mật, bóng đái, dạ dày và ruột đều xuất huyết ở các mức độ khác nhau

Tổn thương vi thể ở một số cơ quan của lợn mắc bệnh dịch tả lợn Châu Phi Các hiện tượng hoại tử các tế bào lympho, teo nhỏ nang lympho ở hệ thống hạch lympho và lách, xuất huyết tràn lan các cơ quan nội tạng

2.1.4 Khả năng lây nhiễm của ASFV

Khả năng lây lan đến 85 % khi trong chuồng trại có xuất hiện dịch Tiếp xúc trực tiếp qua đường miệng-mũi hoặc qua các vết trầy da, dịch cơ thể, lây qua đường tiêu hóa, nhân lên ở các hạch vùng họng, đi qua máu dẫn đến nhiễm trùng máu và đi khắp các bộ phận cơ thể gây xuất huyết ngoài da, mắt, các bộ phận nội tạng, có thể xâm nhập vào bào thai, lây truyền gián tiếp từ lợn rừng sang lợn nhà (và ngược lại) qua bọ ve mềm thuộc loài Ornithodoros là ổ chứa virus, lây truyền dọc từ mẹ sang con, virus di chuyển, tồn tại và phát triển ở mọi cơ quan lợn Khi thành thực phẩm có thể tồn tại và giữ nguyên độc lực 6 năm nếu được bảo quản ở nhiệt độ lạnh và tồn tại 4 - 6 tuần khi bảo quản ở nhiệt độ phòng

Hình 2.4 Triệu chứng lâm sàng trên lợn do ASFV gây ra a) Lợn hôn mê có biểu hiện tím tái ở tai, bụng; b) Các chấm xuất huyết ở thận;c) Lá lách to, màu tím đen đi qua toàn bộ khoang bụng; d) Xuất huyết hạch bạch huyết ở gan

2.2 Kỹ thuật realtime PCR

Realtime PCR hay có tên gọi khác là Quantitative PCR (qPCR), đây kỹ thuật PCR định lượng nhờ sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR truyền thống và kỹ thuật phát hiện tín hiệu huỳnh quang Trong realtime PCR tín hiệu huỳnh quang được đo sau mỗi chu kỳ và cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ phản ánh lượng DNA được khuếch đại trong mẫu tại thời điểm cụ thể đó (Kralik và Ricchi, 2017) Chất phát huỳnh quang thường dùng để theo dõi các đoạn DNA mới được khuếch đại trong thời gian thực là thuốc nhuộm DNA huỳnh quang không đặc hiệu và đầu dò oligonucleotide có nhãn huỳnh quang (probe) Realtime PCR có thể sử dụng để định tính hoặc định lượng gồm hai cấp độ là: định lượng tương đối và định lượng tuyệt đối

2.2.1 Realtime PCR sử dụng đoạn dò (probe)

Probe hay đoạn dò, là các đoạn oligonucleotides sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với DNA đích, ở đầu 5’ gắn với chất phát huỳnh quang (Reporter) và đầu 3’ gắn với chất hấp thụ huỳnh quang (Quencher) Khi có mặt DNA đích, probe sẽ bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với DNA đích một cách đặt hiệu và phát ra tính hiệu huỳnh quang khi nhận được nguồn ánh sáng kích thích Vì vậy cường độ phát quang sẽ thay đổi sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR Qua đó máy realtime giúp định lượng được số bản sao được nhân lên tại mỗi thời điểm Probe có nhiều loại tùy thuộc vào cấu tạo và cách thức phát tín hiệu huỳnh quang, bao gồm: Taqman Probe, Beacon Probe, Molecular Probe, (Phạm Hùng Vân, 2009)

2.2.2 Realtime PCR sử dụng chất phát huỳnh quang bám vào sợi đôi DNA

Chất phát huỳnh quang là chất có ai lực cao đối với DNA sợi đôi, chúng sẽ liên kết bằng cách chèn vào khoảng trống giữa các nucleotide trong DNA sợi đôi, sau đó phát ra ánh sáng huỳnh quang nếu nhận được nguồn sáng kích thích Trước đây, Ethidium bromide (EthBr) là chất phát huỳnh quang được sử dụng để chèn vào DNA Tuy nhiên, EthBr được xem là một chất độc di truyền, nó gây đột biến trong quá trình dịch mã, và là chất độc gây ra hiện tượng vô sinh và loạn dưỡng phôi Chính vì thế, ngày nay, người ta thay thế EthBr bằng các hóa chất cũng có tính chất liên kết với DNA và không gây hại cho người sử dụng khi thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử, tiêu biểu là SYBR Green Độ huỳnh quang của SYBR Green tăng lên tới 1.000 lần khi xen kẽ với DNA sợi đôi Khi quá trình khuếch đại diễn ra, lượng sản phẩm DNA tăng lên và do đó số lượng phân tử SYBR Green được kết hợp vào DNA cũng tăng lên Vì mức tăng huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm tích lũy nên SYBR Green có thể được sử dụng để định lượng DNA tương đối

Do các phân tử SYBR Green chèn vào DNA đợi đôi bất kỳ kể cả không phải Hình 2.5 Đoạn dò có nhãn huỳnh quang (probe)

quang cho realtime PCR, cần phải thực hiện thêm bước phân tích đường cong nóng chảy (Melting Curve) để xác định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó 50% sản phẩm DNA bị biến tính hoàn toàn, nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào tỷ lệ G-C và chiều dài của sản phẩm Với primer dimer thường sẽ có chiều dài ngắn hơn DNA mục tiêu, chính vì thế nhiệt độ nóng chảy sẽ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của DNA mục tiêu Từ việc phân tích đường cong nóng chảy có thể phát hiện được tín hiệu huỳnh quang trong ống phản ứng có phải là tín hiệu của DNA mục tiêu hay không để tránh hiện tượng dương tính giả Kết thúc quá trình luân nhiệt máy sẽ tăng nhiệt độ lên cao hơn Tm của primer, và ở mỗi mốc nhiệt độ, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận để biểu diễn trên biểu đồ

2.2.3 Biểu đồ khuếch đại của realtime PCR

Trong realtime PCR, hiển thị cơ bản để có thể quan sát được quá trình khuếch đại DNA là một biểu đồ khuếch đại (amplification graph) Biểu đồ này có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt

Trên biểu đồ khuếch đại ứng với từng tube phản ứng, cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận được trong những chu kỳ đầu sẽ rất thấp và hầu như không thay đổi, hiển thị bằng một đường thẳng nằm ngang, vì trong giai đoạn này dù DNA đích được khuếch

Hình 2.6 Chất phát huỳnh quang bám vào sợi đôi DNA

đại nhưng do số lượng tín hiệu huỳnh quang chưa đủ để máy ghi nhận Nhưng khi tín hiệu huỳnh quang đạt đến một ngưỡng nhất định mà máy ghi nhận được thì lúc này đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu đi lên

Cường độ huỳnh quang trong tube phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ Chúng ta gọi giai đoạn này là “giai đoạn lũy thừa” về cường độ huỳnh quang, không phải là giai đoạn tăng trưởng lũy thừa về số lượng bản sao của DNA đích Cường độ huỳnh quang trong tube phản ứng sẽ tăng trưởng đến một mức nào đó thì độ tăng trưởng sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên vì các bản sao của DNA đích, do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme Taq polymerase không hoạt động hiệu quả nữa, nên sẽ không còn gia tăng số lượng theo cấp số 2 nữa Chúng ta gọi giai đoạn này là “giai đoạn bình nguyên” Phân tích một đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) của một ống phản ứng sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, thấy một thông số hết sức quan trọng luôn đi kèm là chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) Chu kỳ ngưỡng là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm này thiết bị realtime ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ tube phản ứng bắt đầu vượt qua tín hiệu huỳnh quang nền Để có thể xác định được cường độ huỳnh quang nền, thiết bị realtime thường ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất hiện trong tube phản ứng trong một số chu kỳ đầu, chúng ta gọi là các chu kỳ nền (basal cycle), và lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này làm cường độ huỳnh quang nền Đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền này được gọi là đường nền (base line) Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biển diễn khuếch đại Do được tính toán như vậy nên chu kỳ ngưỡng thường là một số lẻ (ví dụ: Ct = 28.35) chứ ít khi là một số chẵn

2.2.4 Định lượng trong realtime PCR

Realtime PCR vượt trội hơn so với PCR truyền thống bởi vì khả năng sử dụng để định lượng được số lượng DNA ban đầu trong mẫu bằng cách phân tích mối liên hệ giữa Ct và tín hiệu huỳnh quang phát ra Mục đích của việc này là biết được có tồn tại hay không DNA mục tiêu và biết chính xác số lượng của chúng nhằm phục vụ cho các công tác chẩn đoán bệnh như biết được tải lượng virus, thời gian nhiễm bệnh, … và được sử dụng nhiều trong bệnh viện, phòng thí nghiệm chẩn đoán như định lượng virus viêm gan B, virus HPV hay SARS - CoV, … trong mẫu bệnh phẩm (Miller và ctv, 2020)

Để định lượng trong realtime PCR, người làm thí nghiệm phải thực hiện phản ứng realtime PCR với một số mẫu chuẩn đã biết trước số copies (thường là dãy pha loãng) Sau đó tiến hành dựng đường chuẩn dựa vào kết quả Ct của số copies ban đầu, đường chuẩn là cơ sở để tiến hành định lượng trong realtime PCR

Đường chuẩn là một đường thẳng tuyến tính có phương trình Y= slope(X) + intercept với Y là Ct, X là trị số Log10 của số lượng DNA đích ban đầu trong ống phản ứng, slope là hệ số dốc của phương trình

Hình 2.7 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng realtime PCR