KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN BACILLUS VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE, PROTEASE

Khoa Học Tự Nhiên - Y khoa - Dược - Sư phạm hóa UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ – HÓA – SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Tên đề tài KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CUẨ VI KHUẨN BACILLUS VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE, PROTEASE Sinh viên thực hiện VÕ DUY UY MSSV: 2113012740 CHUYÊN NGÀNH: SƯ PHẠM SINH – KTNN KHÓA 2013 - 2017 Cán bộ hướng dẫn: Ths. PHAN THỊ THANH DIỄM MSCB:………………. Quảng Nam, tháng 05 năm 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng của bản thân còn nhờ vào sự chỉ dẫn, động viên tận tình từ quý thầy cô cũng như sự ủng hộ của gia đình và bạn bè. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo trường đại học Quảng Nam đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể sử dụng các thiết bị ở phòng thí nghiệm và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Th.S Phan Thị Thanh Diễm đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Mặc dù đã có nhiều nỗ lực để hoàn thành đề tài nhưng do hạn chế về khả năng của bản thân và thời gian thực hiên nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của quý thầy cô giáo và ý kiến đóng góp của các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn. Quảng Nam, Tháng 5 năm 2017 Võ Duy Uy MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................................................. 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................................................. 1 2. Mục đích của đề tài ......................................................................................................................... 1 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................................................... 2 3.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................................2 3.2. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................................................2 4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................................. 2 PHẦN 2: NỘI DUNG ............................................................................................................................. 3 Chương 1: Tổng quan tài liệu.............................................................................................................. 3 1.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus ........................................................................................................ 3 1.1.1. Đặc điểm phân loại .................................................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm sinh học .................................................................................................................3 1.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên ............................................................................4 1.1.3.1. Bacillus subtilis ...................................................................................................................4 1.1.3.2. Bacillus megaterium ............................................................................................................5 1.1.3.3. Bacillus mensentericus ........................................................................................................6 1.1.3.4. Bacillus cereus ....................................................................................................................6 1.1.3.5. Bacillus pumilus ..................................................................................................................7 1.1.3.6. Bacillus polymyxa ...............................................................................................................7 1.1.3.7. Bacillus brevis .....................................................................................................................7 1.1.3.8. Bacillus simplex...................................................................................................................8 1.1.3.9. Bacillus lincheniformis ........................................................................................................8 1.1.4. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus ............................................................8 1.1.4.1. Cấu tạo bào tử .....................................................................................................................8 1.1.5.2. Khả năng tạo bào tử ............................................................................................................9 1.2. Lịch sử nghiên cứu enzyme từ vi sinh vật .................................................................................... 9 1.3. Giới thiệu về enzyme amylase ................................................................................................... 11 1.3.1. Amylase từ vi sinh vật ..........................................................................................................11 1.3.2. Đặc tính của amylase............................................................................................................12 1.3.2.1. α-amylase ..........................................................................................................................12 1.3.2.2. β-amylase .........................................................................................................................13 1.3.2.3. Glucoamylase ....................................................................................................................13 1.3.3. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.....................................................................................14 1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật ........................14 1.3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy .................................................................................14 1.3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp amylase .........................15 1.3.5. Ứng dụng amylase sản xuất từ vi sinh vật ............................................................................15 1.4. Giới thiệu về enzyme protease ................................................................................................... 15 1.4.1. Vi sinh vật tạo protease ........................................................................................................15 1.4.2. Đặc tính của protease ...........................................................................................................16 1.4.3. Sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật ....................................................................................17 1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật .......................17 1.4.4.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường .............................................................................17 1.4.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp protease ........................................17 1.4.5. Ứng dụng protease từ vi sinh vật..........................................................................................17 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu............................................................................... 19 2.1. Vật liệu ....................................................................................................................................... 19 2.2. Hóa chất và dụng cụ ................................................................................................................... 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................................ 19 2.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân .........................................................19 2.3.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn .............................................................................19 2.3.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus ..........................................................................19 2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập được ....................................................20 2.3.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập được .....................................................21 2.3.3.1. Thử catalase trên lam kính ................................................................................................21 2.3.3.2. Thử phản ứng sinh hóa citrate ...........................................................................................21 2.3.3.3. Thử phản ứng sinh hóa nitrate ...........................................................................................22 2.3.3.4. Thử phản ứng sinh hóa maltose ........................................................................................22 2.3.4. Phương pháp cấy dòng thuần ...............................................................................................22 2.3.5. Phương pháp kiểm tra hoạt độ của enzym amylase (bằng phương pháp Wolhge muth) .....23 2.3.5.1. Nguyên tắc: .......................................................................................................................23 2.3.5.2 Nguyên liệu: .......................................................................................................................23 2.3.5.3. Tiến hành:..........................................................................................................................23 2.3.5.4. Tính kết quả:......................................................................................................................24 2.3.6. Kiểm tra hoạt độ enzyme protease (bằng phương pháp Gross + Fluld) ...............................24 2.3.6.1. Nguyên tắc: .......................................................................................................................24 2.3.6.2. Nguyên liệu: ......................................................................................................................25 2.3.6.3. Tiến hành:..........................................................................................................................25 2.3.6.4. Tính kết quả.......................................................................................................................27 2.3.7. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .27 2.3.7.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .....27 2.3.7.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .............................27 2.3.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .....................28 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................................. 29 3.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus phân lập được ............................................. 29 3.1.1. Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ..................................................29 3.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus .........................................................31 3.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis ...............................34 3.2. Thử hoạt tính enzyme amylase các chủng tuyển chọn ............................................................... 34 3.3. Thử hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn ............................................................................. 37 3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .............. 40 3.4.1 . Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .......40 3.4.2. Ảnh hưởng điều kiện pH cho sự sản xuất enzyme của chủng tuyển chọn ...........................41 3.4.3. Kết quả của nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản xuất enzyme của các chủng tuyển chọn..........43 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 46 1. Kết luận ......................................................................................................................................... 46 2. Kiến nghị ....................................................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................................... 47 PHỤ LỤC ................................................................................................................................................... DANH SÁCH CÁC BẢNG STT TÊN CÁC BẢNG Ghi chú 1 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus 29 2 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus 31 3 Bảng 3.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa các chủng nghi ngờ là Bacillus subtilis 34 4 Bảng 3.4 Quan sát ống nghiệm khi thử hoạt tính enzyme amylase chủng tuyển chọn 35 5 Bảng 3.5 Hoạt độ enzyme amylase của chủng tuyển chọn 36 6 Bảng 3.6 Quan sát ống nghiệm khi thử hoạt tính enzyme protease của chủng tuyển chọn 38 7 Bảng 3.7 Hoạt độ enzyme protese của chủng tuyển chọn 39 8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn 40 9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng điều kiện pH cho sự sản xuất enzyme của chủng tuyển chọn 42 10 Bảng 3.10 Kết quả của nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản xuất enzyme của các chủng tuyển chọn 44 DANH SÁCH CÁC HÌNH STT TÊN CÁC HÌNH Ghi chú 1 Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2 Hình 1.2 Bào tử của Bacillus cereus và Bacillus anihracis 9 3 Hình 2.1 Sơ đồ pha loãng vi khuẩn 20 4 Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng để thử hoạt tính enzyme amylase 24 5 Hình 2.3 Sơ đồ pha loãng để thử hoạt tính enzyme protease 26 6 Hình 3.1 Khuẩn lạc B1 30 7 Hình 3.2 Khuẩn lạc B2 30 8 Hình 3.3 Khuẩn lạc B3 30 9 Hình 3.4 Khuẩn lạc B4 30 10 Hình 3.5 Khuẩn lạc B5 30 11 Hình 3.6 Khuẩn lạc B6 30 12 Hình 3.7 Chủng Bacillus B1 32 13 Hình 3.8 Chủng Bacillus B2 32 14 Hình 3.9 Chủng Bacillus B3 32 15 Hình 3.10 Chủng Bacillus B4 33 16 Hình 3.11 Chủng Bacillus B5 33 17 Hình 3.12 Chủng Bacillus B6 33 18 Hình 3.13 Thử hoạt tính enzyme amylase chủng tuyển chọn 36 19 Hình 3.14 Biểu đồ hoạt độ enzyme amylase của các chủng tuyển chọn 37 20 Hình 3.15 Thử hoạt tính enzyme protease chủng tuyển chọn 38 21 Hình 3.16 Biểu đồ hoạt độ enzyme protease của các chủng tuyển chọn 39 22 Hình 3.17 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đên khả năng sinh enyme của vi khuẩn tuyển chọn 41 23 Hình 3.18 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enyme của vi khuẩn tuyển chọn 43 24 Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enyme của vi khuẩn tuyển chọn 45 1 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nguồn vi khuẩn trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Từ khi những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện đến nay, lĩnh vực nghiên cứu vi sinh vật không ngừng phát triển vượt bậc và mạnh mẽ 9. Người ta đã tìm ra nhiều ứng dụng về vi sinh vật để áp dụng vào đời sống và đạt rất nhiều thành công như: sản xuất thực phẩm cho người và thức ăn cho gia súc, phân giải các chất độc, cải thiện công nghệp thuộc da… Trong đó một trong những ứng dụng quan trọng trong thực tiễn đó là sản xuất enzyme từ vi sinh vật 9. Khi khó thu được enzyme từ các động vật, thực vật đa bào bậc cao, đặc biệt trong điều kiện hiện nay enzyme được ứng dụng rất nhiều trong thực tiễn sản xuất. Vì thế người ta sử dụng những chủng vi sinh vật vốn sản xuất enzyme có hoạt độ cao, thời gian sinh trưởng ngắn để dễ dàng thu được enzyme đồng thời tăng chất lượng của chúng, từ đó giảm giá thành sản phẩm. Ở vi sinh vật, vi khuẩn Bacillus rất phong phú và đa dạng về loài và đặc điểm sinh học. Người ta đã tìm ra nhiều chủng vi khuẩn Bacillus dễ nuôi cấy, có khả năng sinh enzyme cao. Vì vậy vi khuẩn Bacillus luôn đóng vai trò quan trọng trong thực tiễn sản xuất và được nghiên cứu ngày một rộng rãi. Do đó, tận dụng nguồn vi khuẩn Bacillus phong phú trong tự nhiên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩ n Bacillus và tìm hiểu khả năng sinh enzyme amylase, protease” từ đó sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học để ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất, tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. 2. Mục đích của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân. 2 - Tìm hiểu khả năng sinh enzyme amylase và protease của vi khuẩn nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu - Vi khuẩn Bacillus - Khả năng sinh enzyme amylase, enzyme protease của vi khuẩn 3.2. Phạm vi nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân. 4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thực nghiệm: Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm trường Đại học Quảng Nam. - Phương pháp nghiên cứu lý thuyết: đọc, phân tích, so sánh, tổng hợp tài liệu. - Phương pháp thống kê và xử lý số liệu 3 PHẦN 2: NỘI DUNG Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus 1.1.1. Đặc điểm phân loại Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus sp. 8 Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis (https:upload.wikimedia.orgwikipediacommons bb9BacillussubtilisGram.jpg) 1.1.2. Đặc điểm sinh học Bacillus là vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này thường được tìm thấy trong môi trường có độ biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, sử dụng khí oxi làm chất nhận khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao. Phần lớn tế 4 bào có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu có kích thước khác nhau (0,5 - 2,5) x (1,2 – 10) μm. Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu, khi gặp điều kiện lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Vi khuẩn Bacillus có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit giúp chúng có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt 6. Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật, một số gây độc cho côn trùng. Chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào do đó được ứng dụng niều trong công nghệp, nông nghiệp và bảo vệ môi trường… 1.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 1.1.3.1. Bacillus subtilis Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 8. Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô. Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis 8. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 μm. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi 8. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360 C – 500 C, tối đa 5 khoảng 60 0 C, là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6μm – 0,9μm. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà Bacillus subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) 5. Đặc biệt, Bacillus subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe 7. 1.1.3.2. Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn”. Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis , chiều ngang (1,2 – 1,5) μm có thể đến 2 μm, dài từ 3 – 12 μm, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) 8. Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1) μm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 μm 8. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần them bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự Bacillus subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp. 6 1.1.3.3. Bacillus mensentericus Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó có mặt chủ yếu trên khoai tây. Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis , mảnh dài hoặc ngắn (3- 10) x (0,5 – 0,6) μm, có thể đứng riêng rẽ hoặc chuỗi dài. Bào từ hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 μm, nằm ở vị trí bất kỳ trong tế bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào tử. Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có thể màu Crem, vàng nâu, hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger (đen), Bacillus mensentericus ruber (hồng). Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450 C tối đa 50 – 550 C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển. Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis , nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn khác ( như Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin hay Irutin A, B 8. 1.1.3.4. Bacillus cereus Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis . Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩm 8. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5) μm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 – 1,5) μm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm 3. 7 1.1.3.5. Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Bacillus pumilus có mặt trong đất nhiều hơn Bacilus subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào Bacillus subtilis. 1.1.3.6. Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7)μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. 3 Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6) μm, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. 8 Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược. 1.1.3.7. Bacillus brevis Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm. Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc. Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)μm. Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1) μm, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên 3. Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin 8. 8 1.1.3.8. Bacillus simplex Khuẩn lạc giống khuẩn lạc Bacillus cereus , phẳng, khá khuyếch tán, với bề mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường 3. Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6 μm, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 μm, nằm lệch tâm. 1.1.3.9. Bacillus lincheniformis Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D – glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác. Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược 8. 1.1.4. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus 1.1.4.1. Cấu tạo bào tử Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm. Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý. 9 Hình 1.2 Bào tử của Bacillus cereus và Bacillus anihracis 1.1.5.2. Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ). Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử. Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử. 1.2. Lịch sử nghiên cứu enzyme từ vi sinh vật Trước thế kỷ thứ XVII, người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Đó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm. Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men. Từ thế kỷ XVII đến thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã bắt đầu tìm hiểu bản chất của các quá trình lên men. Thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như 10 là hiện tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men. Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên cố gắng tìm hiểu bản chất của quá trình lên men. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Mười chín năm sau (1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz đã chứng minh chất có thể phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Danh từ Diastase là do hai nhà khoa học dùng để gọi cho enzyme amylase ở lúc bấy giờ. Tiếp đó, người ta cũng đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác như Pepsin (Emberle và Shwan). Năm 1857, Convisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease thực vật. Từ 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn. Tuy nhiên ban đầu protease từ vi sinh vật không được coi trọng. Mãi đến những năm 50 của thế kỷ XX protease mới được sử dụng cực kỳ phổ biến trong các ngành công nghiệp… 6 Giai đoạn từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX, ở giai đoạn này một số lượng lớn các enzyme hòa tan đã được tách chiết. Trong thời kỳ này có hai trường thái đấu tranh với nhau đó là trường phái Pasteur và trường phái Liebig. Trường phái Pasteur cho rằng không thể tách enzyme ra khỏi tế bào, tác dụng và tính chất của enzyme gắn liền với sự sống. Trường phái Liebig chống lại trường phái Pasteur, ông cho rằng không có hoạt động của tế bào vi sinh vật cũng có thể lên men, tức là enzyme có thể tách ra khỏi hoạt động sống của tế bào, cũng là một chất hóa học tương tự như các chất xúc tác. Giai đoạn này, công trình của nhà bác học vĩ đại người đức E. Fisher đã đặt nền móng cho những khái niệm 11 hiện đại về tính đặc hiệu của enzyme về sự tương tác không gian giữa enzyme và cơ chất. Từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay, bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn sau khi kết tinh được enzyme. Công trình của hai nhà khoa học người Mỹ là Summer và Northrop đã khẳng định một cách dứt khoát bản chất hóa học của enzyme là protein. Năm 1981, Cech đã chứng minh được enzyme không nhất thiết phải là Protein bằng các xác định được một ARN có tính chất hoạt hóa như enzyme. Hiện nay, nghiên cứu enzyme phát triển rất mạnh nhờ áp dụng thành quả khoa học hiện đại như điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ đã cho phép nghiên cứu cấu trúc cũng như tác động của nhiều loại enzyme. 1.3. Giới thiệu về enzyme amylase 1.3.1. Amylase từ vi sinh vật Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các giống vi sinh vật sau: + Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus. + Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces . + Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum, Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,… 2 Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác. Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và hiếu khí này. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 370 C. 12 1.3.2. Đặc tính của amylase Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó αamylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α –1,4- glucoside của tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine –6- glucanhidrolase, amilopectin -6- glucanhidrolase, oligodexin -6- glucanhidrolase hay dextrinase) thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối. Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân. 1.3.2.1. α-amylase α-amylase: α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α –1,4- glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α- amylase. 9 α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá). Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose (hoặc glucogen) (nhiều) (ít) α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng, α - amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+ , Ag+ , Hg2+ . So với α-amylase của nấm mốc, amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa. α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn 13 hồ tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc. Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25. Mức pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0). Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 500 C. Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92 0 C, trong khi đó amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 70 0 C. Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao. 1.3.2.2. β-amylase β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào. β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy mầm). Vi khuẩn không có β-amylase. 1.3.2.3. Glucoamylase Glucoamylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α –1,4 và α –1,6-glucan trong polysaccharide. Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose. Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5 9. Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác dụng của rượu etylic, aceton. 14 1.3.3. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân. 1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase củ a vi sinh vật 1.3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6 tinh bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2 tinh bột. Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô. Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác. 15 Ca 2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase khỏi tác động của protease. Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Coban kích thích tổng hợp amylase. Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật 1. 1.3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợ p amylase Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào đặc tính của chủng vi sinh vật. Mức pH m...