Đang tải... (xem toàn văn)
Quy trình định tính Samonella2.1 Phạm vi áp dụngPhương pháp này tham chiếu theo TCVN 4829:2005 dùng để phát hiện Trang 9 2.2 Nguyên tắcQuy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM -o0o BÀI TẬP LỚN/ BÀI TẬP DỰ ÁN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA NHĨM: 02 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM -o0o TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Chúng em xin cam đoan đề tài: “Định tính Salmonella” nhóm 02 nghiên cứu thực hiện Chúng em kiểm tra liệu theo quy định hiện hành Kết quả làm đề tài: “Định tính Salmonella” trung thực khơng chép từ tập nhóm khác Các tài liệu được sử dụng tiểu luận có ng̀n gớc, xuất xứ rõ ràng (Ký ghi rõ họ tên) Nhóm 02 LỜI CẢM ƠN Nhóm 02 xin chân thành cảm ơn khoa Công nghệ thực phẩm nhà trường giúp nhóm tiếp cận tìm hiểu mơn Phân tích vi sinh thực phẩm Nhóm 02 xin cảm ơn cô Đinh Thị Hải Thuận giảng dạy hướng dẫn nhóm nghiên cứu hoàn thành tiểu luận cách hoàn chỉnh Trong trình nghiên cứu làm tiểu luận kiến thức cịn hạn chế nên dẫn đến vài quan điểm cách nhìn nhận cịn thiếu sót hay chưa xác mong bạn thơng cảm bỏ qua Nhóm mong nhận được nhận xét, góp ý bạn để cải thiện luận sau Nhóm 02 xin chân thành cảm ơn MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU NỘI DUNG Tổng quan Salmonella 2 Quy trình định tính Samonella 2.1 Phạm vi áp dụng 2.2 Ngun tắc 2.3 Mơi trường hóa chất 2.4 Quy trình phân tích 2.5 Các bước tiến hành 2.6 Kết 12 KẾT LUẬN 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO 14 CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM 15 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1-1 S.typhy gây bệnh sớt thương hàn Hình 1-2 S cholera-sius gây bệnh nhiễm trùng máu Hình 1-3 S.typhymurium gây bệnh rới loạn tiêu hoá MỞ ĐẦU Trong năm gần có nhiều báo cáo cho thấy phần lớn vụ ngộ độc thực phẩm vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo, tình trạng ngộ độc thực phẩm leo thang ngày trở nên nghiêm trọng Có nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm Clostridium botulinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes, đó, Salmonella lồi vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm Salmonella gây bệnh thương hàn, nhiễm khuẩn đường ruột nhiều bệnh nghiêm trọng khác Thế nên định tính, phát hiện sự có mặt Salmonella thực phẩm vơ quan trọng NỘI DUNG Tổng quan Salmonella Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực khuẩn gram âm, hô hấp hiếu khí kị khí tuỳ ý, có khả di động (trừ S.gallinarum S.pullorum), sinh acid từ glucose manitol không lên men saccharose lactose, không sinh phân giải ure Không tạo bào tử, hầu hết chủng sinh H2S (trừ S.typhi) Salmonella tác nhân gây bệnh chủ yếu thực phẩm Có ba dạng bệnh Salmonella gây Sốt thương hàn S.typhy, nhiễm trùng máu S.cholera-sius, rới loạn tiêu hố S.typhymurium S.enteritidis Hình 1-1 S.typhy gây bệnh sốt thương hàn Hình 1-2 S cholera-sius gây bệnh nhiễm trùng máu Hình 1-3 S.typhymurium gây bệnh rối loạn tiêu hoá Hầu hết tiêu chuẩn an tồn thực phẩm khơng cho phép có sự hiện diện Salmonella 25g/25ml mẫu Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập, phục hồi khẳng định Vi khuẩn chịu nhiệt, dễ dàng bị tiêu diệt thức ăn được đun nấu phù hợp Việc làm lạnh, cấp đông, đảm bảo vệ sinh có tác dụng quan trọng làm giảm thiểu nguy nhiễm bệnh Quy trình định tính Samonella 2.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo TCVN 4829:2005 dùng để phát hiện Salmonella tất cả loại thực phẩm 2.2 Nguyên tắc Quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải qua năm giai đoạn phải sử dụng chủng đới chứng tồn q trình phân tích Tiền tăng sinh: mẫu được tiền tăng sinh môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ 370C khoảng 18h Tăng sinh chọn lọc: Sau giai đoạn tiền tăng sinh, dịch mẫu được chuyển qua môi trường tăng sinh chọn lọc RVS ủ 41,50C MKTTn ủ 370C khoảng 24h Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi trường rắn chọn lọc (XLD HE), ủ 370C khoảng 24h Phục hồi: cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella môi trường phân lập sang môi trường dinh dưỡng Khẳng định: cấy chuyển sinh khối môi trường dinh dưỡng sang mơi trường thử nghiệm sinh hóa thử nghiệm kháng huyết học 2.3 Môi trường hóa chất ⮚ Mơi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) Mơi trường XLD: khuẩn lạc có màu hờng śt, có hay khơng có tâm đen Một sớ dịng Salmonella có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc - Cao nấm men: 3g Vai trò: Cung cấp dưỡng chất ( acid amin, ) - L-lysine: 5g Vai trò: Phân biệt Salmonella với vi sinh vật không gây bệnh khác - Xylose: 3.75g Vai trị: Phân biệt lồi Salmonella - Lactose: 7.5g Vai trò: Tạo acid dư thừa để ngăn cản sự đảo ngược thành pH kiềm vi khuẩn Coliform dương tính - Sucrose: 7.5g Vai trị: Tạo acid dư thừa để ngăn cản sự đảo ngược thành pH kiềm vi khuẩn Coliform dương tính - Sodium deoxycholate: 2.5g Vai trò: Ức chế sự phát triển vi khuẩn gram dương - Ferric ammonium citrate: 0.8g Vai trò: Xác định sự sản xuất khí H2S - Sodium thiosulfate: 6.8g Vai trị: chớng nấm men, mớc - NaCl: 5g Vai trị: Duy trì, cân áp suất thẩm thấu mơi trường - Agar: 15g Vai trị: tác nhân làm đơng cứng mơi trường - Phenol red: 0.08g Vai trị: Chất thị giúp nhận biết sự phân huỷ xylose, lactose sucrose ⮚ Môi trường HE: Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay khơng có tâm đen Mơi trường thành phần HE (Hektoen Entric Agar) - Proteose Peptone: 12.0g Vai trị: Cung cấp Nitơ, ng̀n dinh dưỡng cho vi sinh vật đặc biệt amino acid - Yeast Extract: 3.0g Vai trò: Cung cấp protein (N) vitamin - Bile Salts No 3: 9.0g Vai trò: Ức chế sự sinh trường tất cả vi khuẩn gram dương - Lactose: 12.0g Vai trò: Cung cấp lượng cho sự sinh trưởng trao đổi chất - Saccharose: 12.0g Vai trò: Cung cấp lượng cho sự sinh trưởng trao đổi chất - Salicin: 2.0g Vai trò: Phân biệt làm giảm độc tính gây sớ màu để phục hồi tốt Salmonella - Sodium chloride: 5.0g Vai trò: Điều chỉnh trương lực - Ferric Ammonium Citrate: 1.5g Vai trị: Xác định sự sản xuất khí H_2S - Agar: 14.0g Vai trị: mơi trường ni dưỡng vi sinh vật - Bromthymol Blue: 65.0g Vai trò: Chất thị nhận biết khuẩn lạc - Acid Fuchsin: 0.1g Vai trò: Chất thị nhận biết khuẩn lạc • Mơi trường BS Bismuth sulfite brilliant green: ức chế gram (+) Disodium phosphate: tạo tính đệm cho môi trường Dextrose: cung cấp lượng cho vi sinh vật Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím 2.4 Quy trình phân tích Cân 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng 2.5 Các bước tiến hành Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu Thêm 225ml BPW Cân lượng 25g mẫu rắn thử đong thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số Dập mẫu phút cho phép± 5% phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vơ trùng (hoặc bình tam Ủ / (182)h giác), bổ sung 225ml môi trường BPW đồng mẫu máy dập mẫu ml 0,1 ml 10ml môi(stomacher) trường RVCtrong broth60 Ủ giây 10ml môi trường MKTTn (/(24)h broth Ủ /(24)h Bước 1: Tiền tăng sinh (tăng sinh sơ bộ) Mẫu được tiền tăng sinh môi trường sinhagar không Cấytăng lên HE Ủ ởchọn lọc (BPW) ủ Cấy lên XLD agar Ủ /(24) h /(18-24)h 37oC±3h khoảng 18h±3h Trypton e broth VP ONPG LDC Ure sugar TSI Khơng cóBước khuẩn điểnsinh hìnhchọn hoặclọc 2:lạc Tăng Đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi nghi ngờ từ mơi trường phân ngờ, cấy lên NA/TSA Ủ /(243) h lập Trộn dịch tiền tăng sinh, chuyển 0,1ml vào ống nghiệm chứa 10ml mơi Thử khuẩn lạc cịn Thử khuẩn lạc ±3h; đồng thời chuyểnlại trường RVS, ủ 41,5±1oC 24 1ml vào ống được đánhnghiệm nghi ngờ chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37±1oC 24±3h Cẩn thận không được để Thử kháng huyết nhiệt độ ủ tối đa (42,5oC) Bước 3: Phân lập Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ canh thang tăng sinh chọn lọc RVS Ủ /(243)h MKTTn lên đĩa thạch chứa môi trường chọn lọcBáo XLDcáo vàkết HE.quả Sau cấy, lậtphát ngược đĩa cho đáy hướng lên ủ 37oC±1oC 24±3h Khơng Salmonella Âm tính Sau ủ 24±3h, kiểm tra đĩa sự có mặt khuẩn lạc điển hình 25g/25ml khuẩn lạc khơng điển hình mà nghi ngờ Salmonella Trên môi trường XLD khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hờng śt, có khơng có tâm màu đen Trên mơi trường HE khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu xanh lam, có khơng có tâm đen Đánh dấu vị trí khuẩn lạc đáy đĩa Bước 4: Phục hồi môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi ngờ từ đĩa mơi trường phân lập XLD HE Nếu đĩa có khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc nghi ngờ, lấy tất cả khuẩn lạc điển hình nghi ngờ cấy ria NA/TSA Ủ 37oC±1oC 24±3h TH1: từ đĩa thử khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho kết quả thử nghiệm sinh hóa hóa phù hợp kết luận phát hiện Salmonella mẫu TH2: nếu khuẩn lạc cho kết quả thử nghiệm sinh hóa khơng phù hợp tiến hành thử bớn khuẩn lạc cịn lại được đánh dấu, bốn khuẩn lạc cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp kết luận phát hiện Salmonella mẫu ngược lại kết luận không phát hiện Salmonella mẫu Bước 5: Khẳng định sinh hóa kháng huyết Từ khuẩn lạc chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào môi trường sau: ⮚Thạch TSI Nguyên tắc: xác định khả sử dụng nguồn Carbohydrate cụ thể kết hợp với mơi trường tăng trưởng bản, có khơng có sinh hydrogen sulfide (H2S) Cách lấy mẫu: cấy ria bề mặt nghiêng thạch cấy đâm sâu xuống đáy Ủ 37±1oC 24±3h Diễn giải thay đổi môi trường sau: + Cấy đâm sâu ● Màu vàng glucose dương tính (sử dụng glucose) ● Màu đỏ không đổi màu glucose âm tính (khơng sử dụng glucose) ● Màu đen sinh hydro sunfua Bọt vết rạn sinh khí từ glucose + Cấy bề mặt nghiêng thạch ● Màu vàng lactose và/hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/hoặc sucrose) ● Màu đỏ không đổi màu lactose sucrose âm tính (khơng sử dụng lactose sucrose) Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) bề mặt nghiêng thạch cấy đâm sâu mang tính acid (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) (với khoảng 90% trường hợp) sinh hydrosunfua (thạch bị đen) ⮚Lysine decarboxylase Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện vi khuẩn sinh enzyme decarboxylase, enzyme thường tương tác với amino acid có gốc carboxyl (-COOH) cuối, tạo thành amine hay diamine carbon dioxide (CO2) Cách lấy mẫu: cấy phía bề mặt môi trường lỏng, phủ lớp paraffin hay dầu khống lên bề mặt mơi trường Ủ 37±1oC 24±3h Salmonella có phản ứng lysine decarboxylase dương tính nên sau ni cấy, mơi trường giữ nguyên màu tím Phản ứng âm tính mơi trường có màu vàng ⮚Thạch ure Ngun tắc: sử dụng để phát hiện khả phân cắt ure thành amoniac hoạt tính enzyme urease từ VSV kết quả mơi trường bị kiềm hóa NH3 được tạo Cách lấy mẫu: cấy ria bề mặt thạch nghiêng thạch Ủ 37±1oC 24±3h Nếu phản ứng dương tính, mơi trường từ màu đỏ chuyển thành màu hờng sau chuyển thành đỏ hờng Ngược lại, nếu phản ứng âm tính môi trường không đổi màu (vàng cam) ⮚Môi trường phản ứng Indol Nguyên tắc: phát hiện khả oxy hóa tryptophan thành dạng indol: Indol, Skatol (methyl indol) indol-acetate Cách lấy mẫu: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường tryptone water Ủ 37±1oC 24±3h Sau ủ, thêm 1ml thuốc thử kovac’s, nếu phản ứng dương tính bề mặt môi trường xuất hiện mặt màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính, xuất hiện màu khác phản ứng âm tính ⮚Phát β -galactosidase Nguyên tắc: xác định khả lên men lactose vi sinh vật Cách lấy mẫu: cho vòng đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào ớng vơ trùng có chứa 0,25ml dung dịch muối sinh lý Thêm giọt Toluen lắc ống Đặt ống vào nồi cách thủy 37oC để vài phút (khoảng phút) Thêm 0,25ml thuốc thử để phát hiện β -galactosidase lắc Đặt lại ống vào nồi cách thủy để 37 oC 24±3h, kiểm tra ống thường xuyên Màu vàng cho thấy phản ứng dương tính Phản ứng thường xuất hiện khoảng 20 phút Nếu sử dụng đĩa giấy bán sẵn, theo dẫn nhà sản xuất ⮚Voges – Proskauer Nguyên tắc: Xác định khả sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trình lên men glucose số vi sinh vật Cách lấy mẫu: cho vòng đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống vô trùng có chứa 3ml môi trường VP Ủ 37±1oC 24±3h Sau ủ, thêm giọt dung dịch creatine, giọt dung dịch α -naphthol sau thêm giọt dung dịch kali hydroxyde (KOH), lắc sau lần thêm loại thuốc thử Khi xuất hiện màu hồng đến màu đỏ sáng 15 phút chứng tỏ phản ứng dương tính, cịn phản ứng âm tính dịch vi khuẩn khơng đổi màu ⮚Thử phản ứng kháng huyết + Loại trừ chủng tự ngưng kết: nhỏ giọt nước muối sinh lý lên phiến kính thủy tinh được làm cách cẩn thận, dùng que cấy vòng trộn dung dịch với khuẩn lạc cần thử, để thu được huyền phù đục đờng Lắc nhẹ phiến kính 30-60 giây Quan sát kết quả tối, tốt dùng kính lúp Nếu có sự vón cục, khơng rời (ít nhiều) vi khuẩn chúng xem tự ngưng kết, không cần thử phản ứng hút tiếp theo Nếu khơng có sự vón cục vi khuẩn rời nhau, chúng xem không tự ngưng kết, cần tiếp tục thử phản ứng huyết + Kiểm tra O, H,… Nhỏ giọt anti-O H lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy sinh khới vi khuẩn từ mơi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30-60 giây, quan sát đen Phản ứng dương tính có hiện tượng ngưng kết xảy Đôi cần quan sát hiện tượng ngưng kết kính lúp kính hiển vi với độ phóng đại thấp Ngược lại, nếu vi khuẩn phân bố huyết thanh, làm cho dung dịch đục được xem kết quả âm tính Mẫu được kết luận dương tính với Salmonella có khuẩn lạc đặc trưng môi trường phân lập cho kết quả sinh hóa sau: TSI/KIA: đỏ/vàng; có/khơng có H2S sinh hơi; Ure (-); Indol (-); VP (-); ONPG (-); LDC (+) 2.6 Kết Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng KẾT LUẬN Trong thực phẩm khơng được phép có sự hiện diện Salmonella Salmonella vô nguy hiểm, tác nhân gây bệnh chủ yếu thực phẩm Sau hồn thành tiểu luận này, chúng em có thêm nhiều kiến thức chuyên sâu trực khuẩn Salmonella phương pháp định tính Salmonella (bao gờm phạm vi áp dụng, ngun tắc, mơi trường hóa chất, quy trình phân tích, bước tiến hành) Trong quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải trải qua giai đoạn phải sử dụng chủng đới chứng tồn q trình phân tích TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Giáo trình phân tích vi sinh, Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm thành phớ Hờ Chí Minh, năm 2016