Đang tải... (xem toàn văn)
Trang 1 KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMTIỂU LUẬN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨMTÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠCGVHD: Nhóm: 1 Trang 2 KHOA CÔNG NG
TRƯỜNG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC GVHD: Nhóm: Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022 TRƯỜNG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC GVHD: Nhóm: SVTH: Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022 ,3 LỜI CAM ĐOAN Chúng cam đoan báo cáo tiểu luận thực hướng dẫn cô Đinh Thị Hải Thuận Các số liệu kết phân tích báo cáo trung thực, khơng chép từ đề tài nghiên cứu khoa học TP.HCM, tháng 10 năm 2022 ,3 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tiểu luận này, trước hết chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô giáo khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm Tp Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho chúng em suốt trình học tập rèn luyện trường Trong trình thực đề tài chúng em gặp khơng khó khăn Nhưng với động viên giúp đỡ quý thầy cô, người thân bạn bè, chúng em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu có kinh nghiệm, kiến thức hữu ích cho thân Đặc biệt chúng em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đinh Thị Hải Thuận, người trực tiếp hướng dẫn tận tình giúp đỡ chúng em suốt thời gian thực đề tài Dù cố gắng tránh khỏi sai sót Rất mong thơng cảm đóng góp ý kiến quý thầy cô bạn để tiểu luận hồn thiện Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô bạn sức khỏe, thành công công việc sống Chúng em xin chân thành cảm ơn! TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 10, 2022 ,3 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Đối tượng phạm vi nghiêm cứu 1.4 Phương pháp nghiêm cứu 1.5 Ý nghĩa thực đề tài Tổng Quan Enterobacteriaceae 2.1 Nơi cư trú 2.2 Hình thể 2.3 Ni cấy 2.4 Tính chất sinh vật hóa học 2.5 Phân loại Định lượng Enterobacteriaceae phương pháp đếm khuẩn lạc 3.1 Phạm vi áp dụng 9 3.2 Nguyên tắc 10 3.3 Mơi trường hóa chất 10 3.4 Quy trình phân tích 11 3.5 Các bước tiến hành 12 3.6 Kết 14 Kết luận 15 ,3 MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài Tình trạng kháng kháng sinh sở y tế gia tăng cách đáng báo động năm gần Ths Nguyễn Quốc Thái, Phó trưởng phịng Truyền nhiễm Cấp cứu (Trung tâm Bệnh Nhiệt đới) đề cập đến Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn vi khuẩn gây kháng sinh phổ biến cộng đồng bệnh viện Chúng có mặt chủ yếu đường tiêu hố dưới, ngồi có đường sinh dục, tiết niệu họng miệng Tuy nhiên, vi khuẩn gây bệnh quan thể, gây nhiễm khuẩn cộng đồng môi trường bệnh viện Một số vi khuẩn hay gặp quan trọng lâm sàng Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae….Những trường hợp người bệnh dễ mắc nhiễm khuẩn gây họ vi khuẩn bao gồm người bệnh ghép tuỷ, suy gan, ghép tạng, đái tháo đường, bệnh phổi, thận nhân tạo chu kỳ, nhiễm HIV, điều trị thuốc corticoid… Các mầm bệnh gây lây nhiễm có dịch truyền, ống thông (catheter) dụng cụ y tế khác Qua đó, cho thấy nguy hiểm vi khuẩn Enterobacteriaceae người nên nhóm em muốn tìm hiểu thêm Enterobacteriaceae để giúp chúng em hiểu ngun tắc, mơi trường hóa chất, định lượng Đó lý nhóm em chọn đề tài định lượng Enterobacteriaceae 1.2 Mục tiêu đề tài Biết cách tiến hành định lượng Enterobacriaceae 1.3 Đối tượng phạm vi nghiêm cứu Đối tượng nghiêm cứu: vi khuẩn Enterobacriaceae Phạm vi nghiêm cứu: định lượng Enterobacriaceae sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, mẫu môi trường khu khu vực sản xuất chế biến thực phẩm 1.4 Phương pháp nghiên cứu ,3 Phương pháp phân tích tổng hợp lý thuyết: Tìm hiểu thu thập thơng tin qua sách, tài liệu tham khảo tổng hợp lại để hoàn chỉnh làm Phương pháp so sánh-đối chiếu: Nhóm tác giả đưa nội dung nghiên cứu từ nhiều nguồn tài liệu tham khảo khác liên quan đến vấn đề chứng minh, nhằm giúp cho luận thêm hấp dẫn xây dựng nên sở lý thuyết vững cho vấn đề bàn luận 1.5 Ý nghĩa thực đề tài Giúp hiểu biết thêm loại vi khuẩn Enterobacriaceae ( vi khuẩn đường ruột ) Tổng Quan Enterobacteriaceae hình 1: Vi khuẩn Enterobacteriaceae ,3 2.1 Nơi cư trú Các vi khuẩn đường ruột thường sống ống tiêu hóa người động vật, gây bệnh khơng gây bệnh Ngồi chúng sống ngoại cảnh (đất, nước) thức ăn 2.2 Hình thể Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae trực khuẩn gram âm, không sinh nha bào Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), số vi khuẩn khác di động nhờ có lơng xung quanh thân tế bào Một số giống có vỏ nhìn thấy nhờ kính hiển vi thường Klebsiella 2.3 Ni cấy Các vi khuẩn đường ruột hiếu khí kỵ khí tùy tiện, phát triển môi trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường đặc, khuẩn lạc vi khuẩn đường ruột thường nhẵn, bóng (dạng S) Tính chất biến đổi sau nhiều lần nuôi cấy liên tiếp thành khuẩn lạc có bề mặt khơ xù xì (dạng R) Các khuẩn lạc vi khuẩn có vỏ Klebsiella khuẩn lạc nhầy, lớn khuẩn lạc dạng S có xu hướng hịa lẫn vào Nghiên cứu tính chất sinh vật hóa học giúp cho việc định loại vi khuẩn 2.4 Tính chất sinh vật hóa học Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae lên men glucose, có sinh khơng sinh hơi, oxidase âm tính, catalase dương tính, khử nitrate thành nitrite Lên men khơng lên men số đường (ví dụ lactose) Có hay khơng có số enzyme urease, ,3 tryptophanase Khả sinh H2S dị hóa protein, axít amin dẫn chất có lưu huỳnh 2.5 Phân loại Có nhiều cách phân loại họ Enterobacteriaceae Theo cách phân loại Bergey’s Manual (1984) chia Enterobacteriaceae làm 13 giống sau: Các giống : I.Escherichia II.Shigella III.Edwardsiella IV.Citrobacter V.Salmonella VI.Klebsiella VII.Enterobacter VIII.Serratia IX.Proteus X.Providencia XI.Morganella XII.Yersinia XIII.Erwinia Trong giống kể giống vi khuẩn có ý nghĩa y học : Escherichia; Shigella; Salmonella; Klebsiella; Enterobacter; Proteus; Yersinia; giống khác ý nghĩa ,3 Định lượng Enterobacteriaceae phương pháp đếm khuẩn lạc 3.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae tham chiếu theo TCVN 5518 – 2:2007 ISO 21528 – 2:2004 dùng để định lượng Enterobacteriaceae mà không cần phải qua giai đoạn tiền tăng sinh Phương pháp áp dụng cho: - Các sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Các mẫu môi trường khu vực sản xuất chế biến thực phẩm Việc định lượng thực phương pháp đếm khuẩn lạc môi trường đặc sau ủ ấm 37oC (hoặc 30oC) Khi số lượng khuẩn lạc dự kiến có mặt nhiều 100 mililit gam mẫu thử, nên dùng kỹ thuật 3.2 Nguyên tắc 3.2.1 Chuẩn bị - Chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân -Từ mẫu thử chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân 3.2.2 Phân lập + Cấy lượng xác định mẫu thử sản phẩm dạng lỏng huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác vào hai đĩa petri (dùng kỹ thuật đổ đĩa) chứa thạch glucoza mật đỏ tím Phủ lên lớp mơi trường thạch + Chuẩn bị cặp đĩa thạch khác điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu + Ủ đĩa thạch 37oC (hoặc 30oC) 24 h ± h 3.2.4 Tính tốn Tính số lượng Enterobacteriaceae có mililit gam mẫu thử từ số lượng khuẩn lạc điển hình khẳng định đĩa 3.3 Mơi trường hóa chất 10 ,3 Mơi trường hóa chất Mục đích SPW (Saline Peptine Water) Pha lỗng mẫu VRBG (Violet Red Bile Glucose) Nuôi cấy Enterobacteriaceae NA/TSA Phục hồi Thạch glucoza Khẳng định Enterobacteriacease Thuốc thử oxidase 3.4 Quy trình phân tích 11 ,3 x Đồng mẫu Stomacher 60 giây Pha loãng Dịch mẫu Dịch mẫu VRBG 02 đĩa (VRBG đun chảy làm 02 đĩa nguội đến 47℃ ) Xoay nhẹ trộn mẫu, nhiệt độ phịng, chờ hỗn hợp đơng đặc, lật ngược đĩa ủ tủ ấm 24 Đọc kết Chọn đĩa mọc khuẩn lạc độ pha loãng liên tiếp Khẳng định sinh hóa thạch glucoza oxidase Tính biểu thị kết 12 ,3 3.5 Các bước tiến hành Bước Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Cân xác 10g mẫu rắn đong mẫu với thể tích 10ml mẫu lỏng phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vơ trùng (bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu Đồng mẫu dịch pha loãng SPW máy dập mẫu phút lắc bình tam giác có mẫu dịch pha loãng 2-3 phút Bước Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào ống nghiệm chứa ml dịch pha lỗng SPW vơ trùng nhiệt độ thích hợp Trộn kỹ máy vortex - 10 giây để thu dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với loại mẫu làm từ ngun chất thu dung dịch pha lỗng 10 -1) Nếu cần, lặp lại thao tác để có dung dịch pha lỗng 10 -3, 10-4, 10-5, thu lượng vi khuẩn thích hợp Bước Cấy ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng 1ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác cho vào đĩa petri Lặp lại qui trình với dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, cần Sử dụng nồng độ pha loãng liên tiếp, nồng độ đĩa petri Rót vào đĩa 10-15ml môi trường VRBG, trộn cách xoay nhẹ 13 ,3 đĩa Khi môi trường đông đặc lại phủ kín thêm lớp dày 10ml loại môi trường VRBG Để cho đông đặc lại Lật úp đĩa ủ 37°C 24 Bước Đếm chọn khuẩn lạc để khẳng định Đếm đĩa có số khuẩn lạc 150 sau 24 nuôi cấy Các khuẩn lạc đặc trưng có màu hồng đến màu đỏ đỏ tía (có khơng có quầng tủa) mơi trường VRBG Đếm khuẩn lạc Enterobacteriaceae đĩa có số đếm phù hợp Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy ria lên môi trường dinh dưỡng để thử khẳng định, ủ đĩa 370C 24 Sau 24 nuôi cấy thực phép thử khẳng định sau: - Phản ứng oxidase: dùng que cấy đũa thủy tinh, lấy phần sinh khối môi trường dinh dưỡng cấy ria lên giấy lọc tẩm thuốc thử oxidase lên đĩa bán sẵn Không dùng que cấy niken/crom Phép thử coi âm tính màu giấy lọc khơng chuyển sang màu sẫm vòng 10s Cần theo hướng dẫn nhà sản xuất sử dụng đĩa có bán sẵn - Lên men glucoza: dùng que cấy lấy loại sinh khối chọn phép thử oxidase, cấy đâm sâu vào ống chứa thạch glucoza, ủ 37 0C 24 Nếu màu vàng lan rộng khắp ống thạch phản ứng coi dương tính 3.6 Kết Các khuẩn lạc cho kết âm tính oxidase dương tính glucoza khẳng định Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae 1g/1ml mẫu (X) tính theo cơng thức: X= (C 1×R 1)+(C 2×R 2)+(C 3×R )+(C 4×R ) V ×(n1 +0,1×n2 )×d 14 (CFU/g hay CFU/ml) ,3 C1,2,4: Số khuẩn lạc Enterobacteriaceae đếm tương ứng đĩa cđộ pha loãng liên tiếp V: Thể tích dịch cấy cấy đĩa, tính mililit n1: Số đĩa độ pha loãng thứ giữ lại n2: Số đĩa độ pha loãng thứ hai giữ lại d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ giữ lại R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng đĩa hai độ pha loãng liên tiếp Kết luận Họ vi khuẩn Enterobacteriaceae loại vi khuẩn phổ biến ảnh hưởng đến ngành thực phẩm Vi khuẩn nhóm phát đếm xét nghiệm phân tích thơng thường thực phịng thí nghiệm Trong bối cảnh này, Số lượng vi khuẩn enterobacteriaceae nghiên cứu ngày quan trọng cho thấy chất lượng thực phẩm 15 ,3 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Giáo trình phân tích vi sinh Khoa Cơng nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM, 2002 [2] TCVN: 5518-2:2007 (ISO 21528-1:2004) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi- Phương pháp phát định lượng Enterobactericeae-Phần 2: Ktx thuật đếm khuẩn lạc 16 ,3 CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM Câu 1: Theo cách phân loại bergey’s manual (1984) chia Enterobacteriaceae làm bao nhiếu giống chính? A 11 B 12 C 13 D 14 Câu 2: chọn câu nơi cư trú enterobacteriaceae ? A Ống tiêu hóa người động vật B Đất, nước C Thức ăn D Tất A B C Câu 3: Chọn câu phát biểu sai? A Các vi khuẩn Enterobacteriaceae di chuyển B Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae trực khuẩn gram âm, không sinh nha bào C Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), số vi khuẩn khác di động nhờ có lông xung quanh thân tế bào D Một số giống có vỏ nhìn thấy nhờ kính hiển vi thường Klebsiella Câu 4: giống vi khuẩn họ Enterobacteriaceae có ý nghĩa y học là? A Escherichia B Shigella C Salmonella D tất đáp án 17 ,3 Câu 5: Vi khuẩn đường ruột vi khuẩn? A hiếu khí B kỵ khí tùy tiện C kỵ khí bắt buộc D hiếu khí kỵ khí tùy tiện Câu 6: Điền vào chỗ trống: Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae lên men glucose, có sinh khơng sinh hơi, oxidase … tính, catalase … tính, khử … thành nitrite A Dương; âm; nitrate B Âm; dương; nitrate C Âm; dương; nitrite D Dương; âm; nitrite Phạm vi áp dụng phương pháp định lượng Enterobacteriaceae? A TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2006) B TCVN 5518-2:2007 (ISO 21528-2:2004) C TCVN 4884:2005 (ISO 7937:2004) D TCVN 4830-1:2005 (ISO 6888-1:1999) Cần chọn đĩa có khuẩn lạc để khẳng định kết A.≤ 150 B.≥ 150 C.300 D.< 300 Các loài vi khuẩn sau thuộc họ Enterobacteriaceae? 18 ,3 A E.coli, Shigella, Proteus,Salmonella,V.cholerae B Liên cầu ruột, Shigella, Klebsiella, Yersinia C E.coli, Shigella, Salmonella, Klebsiella ,Yersinia pestis D Shigella, Klebsiella E.coli, Pseudomonas E Salmonella, Shigella, E.coli, Proteus, Brucella Những chủng thuộc họ Enterobacteriaceae có tính chất di động thì? Có nhiều lơng xung quanh thân tế bào vi khuẩn Có chùm lơng đầu tế bào vi khuẩn Có lơng đầu tế bào vi khuẩn Có lơng đầu tế bào vi khuẩn Trong định lượng Enterobacteriaceae,phép thử phản ứng oxidase xuất màu phản ứng khẳng định âm tính? Màu giấy lọc khổng chuyển sang màu sẫm vòng 10s Màu giấy lọc chuyển sang màu sẫm vòng 10s Màu giấy lọc giữ nguyên màu sẫm vòng 10s Màu giấy lọc chuyển sang màu đỏ tía vịng 10s Khẳng định Enterobacteriaceae mơi trường hóa chất gì? Thạch glucoza thuốc thử oxidase Blood agar base Arginine dehydrolase Cả mơi trường Câu 13: Mục đích mơi trường SPW là: Phục hồi Pha lỗng mẫu Khẳng định Nuôi cấy Câu 14: Thành phần môi trường VRBG: 19 ,3 Cao nấm men, dịch thủy phân mô động vật enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua Cao nấm men, dịch thủy phân mô động vật enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua, đỏ trung tính Cao nấm men, dịch thủy phân mơ động vật enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua, đỏ trung tính, tím tinh thể(crystal violet) Dịch thủy phân mơ động vật enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua, đỏ trung tính Câu 15: Mục đích NA/TSA: Pha lỗng mẫu Khẳng định Nuôi cấy Phục hồi Câu 16: Mục đích thạch glucoza oxidaza: A.Pha lỗng mẫu B Khẳng định C Nuôi cấy D Phục hồi Câu 17: Thành phần SPW: Cao thịt Dịch thủy phân mô động vật enzyme Natri clorua Nước Thạch Cao nấm men Đỏ trung tính 1, 2, 3, 4, 5, 1, 3, 4, 5, 6, 1, 2, 3, 4, 1,3,5,7 Câu 18: Mục đích VRBG: Pha lỗng mẫu Phục hồi Khẳng định 20