BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VI TẢO CHLORELLA VULGARIS LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIODIESEL Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN NGỌC ANH HOÀNG KHÁNH NHƯ Mã số sinh viên : 21126012 21126450 Niên khóa : 2021-2025 TP.Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VI TẢO CHLORELLA VULGARIS LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIODIESEL Giarng viên hướng dẫn Sinh viên thực HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN NGỌC ANH HOÀNG KHÁNH NHƯ TP Thủ Đức, 10/2023 ii TÓM TẮT Vi tảo đối tượng đầy tiềm nghiên cứu phổ biến giới cho mục tiêu sản xuất nhiên liệu sinh học Một số nhiên liệu sinh học nghiên cứu biodiesel phương pháp quan tâm lấy lipid từ vi tảo để làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất biodiesel Vì vậy, biện pháp nhằm nâng cao suất lipid vi tảo đặc biệt trọng Trong đề tài này, khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi trồng phịng thí nghiệm tốc độ sục khí CO2, nồng độ dinh dưỡng Nitơ, cường độ ánh sáng đến suất sinh khối hàm lượng lipid vi tảo Chlorella Vulgaris Đây chủng vi tảo tiềm cho mục tiêu kết hợp xử lý nước thải, tận dụng CO2 từ khí thải phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam Kết ban đầu cho thấy, việc tăng cường độ chiếu sáng giảm nồng độ Nitơ tăng hàm lượng lipid giảm suất sinh khối Đồng thời, việc bổ sung CO2 vào môi trường cho phép tăng suất sinh khối lipid iii MỤC LỤC Trang TÓM TẮT iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung thực CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp đo mật độ quang OD 2.2.2 Phương pháp đo nồng độ Chlorophylla 2.3 Phương pháp bảo quản giống 2.4 Phương pháp nuôi trồng 2.5 Phương pháp thu hoạch SK 2.6 Phương pháp ly trích lipid CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng CO2 đến sinh trưởng tích lũy lipid 3.2 Ảnh hưởng cường độ ánh sáng đến sinh trưởng tích lũy lipid CHƯƠNG KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT SK: Sinh khối OD: Optical density v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng SK lipid tảo ảnh hưởng tốc độ sục khí CO2 Bảng Kết SK lipid mẫu nước thải pha lỗng vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh tảo Chlorelle Vulgaris Hình 3.1 Vai trị CO2 sinh trưởng tảo vii CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nhu cầu phát triển nhiên liệu thay cho nhiên liệu có nguồn gốc từ nhiên liệu hóa thạch xu hướng phát triển tương lai Nhiên liệu hóa thạch khơng làm hạn chế nguồn tài nguyên mà việc đốt chúng tạo carbon dioxide, nguyên nhân gây tượng nóng lên tồn cầu Một nguồn lượng quan trọng nhiên liệu lỏng xăng dầu diesel Động diesel sử dụng rộng rãi để vận chuyển, cung cấp lượng cho thiết bị sản xuất điện Hoa Kỳ sử dụng 50 tỷ gallon dầu diesel năm Các lựa chọn thay cho động diesel phải dạng lỏng, tương thích với động sử dụng nay, có tính cạnh tranh mặt kinh tế có đủ số lượng Tình cờ thay, động diesel thiết kế chạy lần vào năm 1893 hai số loại nhiên liệu đề xuất cho động dầu có nguồn gốc từ thực vật (dầu lạc) than nghiền thành bột Dầu có nguồn gốc từ thực vật sử dụng thay cho dầu diesel nguồn cung hạn chế dầu tỏ nhớt để sử dụng kéo dài Do đó, dầu thực vật phải biến tính trước sử dụng, chủ yếu để giảm độ nhớt chúng bốn phương pháp sử dụng để đạt điều này; trộn với dầu diesel, hình thành vi nhũ tương dầu, dầu diesel, nước chất hoạt động bề mặt, nhiệt phân chuyển hóa este Quá trình este hóa chéo phân hủy dầu thực vật thành axit béo cấu thành chúng, làm giảm đáng kể độ nhớt chúng sản phẩm gọi dầu biodiesel Hiện nay, nguyên liệu sản xuất biodiesel Việt Nam nguồn sinh khối (SK) truyền thống (dầu ăn phế thải, mỡ cá basa, dầu hạt jatropha) có nhiều nhược điểm thu hoạch khó khăn, hàm lượng dầu thấp chiếm nhiều diện tích đất canh tác, đất rừng cần nhiều nước tưới Để khắc phục nhược điểm đó, SK vi tảo đời xem nguồn SK đầy hứa hẹn để sản xuất biodiesel Vi tảo vi sinh vật đơn bào, sinh trưởng quang tự dưỡng nhờ trình quang hợp, dị dưỡng, hai hình thức So với nguồn SK truyền thống, vi tảo có ưu điểm bật tốc độ sinh trưởng nhanh, suất thu SK thu dầu cao loại thực vật có dầu khác; dễ ni trồng, cạnh tranh với đất nơng nghiệp không cần nguồn nước sạch; thân thiện với môi trường Trung bình sản xuất kg SK tảo tiêu thụ 1,83 kg CO2 Ngồi ra, tận dụng CO2 từ khí thải cơng nghiệp với nước thải để nuôi trồng vi tảo, làm giảm đáng kể chi phí cho q trình; nguồn SK vi tảo ngồi mục đích sản xuất biodiesel cịn có nhiều ứng dụng khác, lượng dầu dao động từ 5-58% khối lượng Do vậy, với định hướng tận dụng nguồn khí thải CO2 nước thải từ hầm ủ biogas để nuôi trồng vi tảo sản xuất biodiesel, chọn Chlorella Vulgaris chủng vi tảo để nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện nuôi trồng đến suất thu hồi dầu, đồng thời định hướng nuôi môi trường nước thải 1.2 Mục tiêu đề tài Sự cạn kiệt nguồn lượng hóa thạch với gia tăng hậu ô nhiễm mơi trường động lực thúc đẩy giới tìm giải pháp hiệu cho vấn đề lượng mơi trường Sự đời biodiesel nói riêng nhiên liệu sinh học nói chung bắt nguồn từ thực tiễn 1.3 Nội dung thực Tận dụng nguồn khí thải CO2 nước thải từ hầm ủ biogas để nuôi trồng vi tảo sản xuất biodiesel, chọn Chlorella Vulgaris chủng vi tảo để nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện nuôi trồng đến suất thu hồi dầu CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu Hình 1.1 Hình ảnh tảo Chlorelle Vulgaris Chủng Chlorella Vulgaris với kích thước tế bào từ 5-10 µm, chủng vi tảo nghiên cứu nhiều cho mục tiêu sản xuất biodiesel Chlorella Vulgaris loài vi tảo xanh thuộc phận Chlorophyta Sản lượng hàng năm loài Chlorella khác giới 2000 (trọng lượng khô) vào năm 2009, với nhà sản xuất Đức, Nhật Bản Đài Loan C Vulgaris ứng cử viên cho sản xuất thương mại có sức đề kháng cao trước điều kiện bất lợi sinh vật xâm nhập Ngoài ra, việc sản xuất đại phân tử hữu khác quan tâm (protein, lipid, tinh bột) khác tùy thuộc vào kỹ thuật sử dụng để tạo sinh khối nhắm mục tiêu Trong điều kiện khắc nghiệt hơn, sinh khối giảm hàm lượng lipid tinh bột lại tăng Trong điều kiện đầy đủ chất dinh dưỡng ánh sáng, hàm lượng protein tăng lên với sinh khối Các kỹ thuật tăng trưởng khác phát triển Các phương thức tăng trưởng khác (tự dưỡng, dị dưỡng hỗn hợp) nghiên cứu Chlorella Vulgaris ; Sự tăng trưởng tự dưỡng ưa chuộng khơng cần cung cấp carbon hữu tốn dựa vào nguồn carbon vô (CO2 , cacbonat) ánh sáng để quang hợp Chlorella sp trồng phân lợn tiêu hóa xử lý trước màng có khả cải thiện hiệu suất mơi trường tăng trưởng việc nuôi cấy vi tảo mặt suất sinh khối cuối , cho thấy phát triển tảo phụ thuộc vào độ đục dịng tiêu hóa lỏng vào lượng dinh dưỡng sẵn có chúng Chlorella Vulgaris vi tảo lựa chọn cho số quy trình xử lý sinh học Nhờ khả loại bỏ nhiều loại chất gây ô nhiễm chất dinh dưỡng vô (nitrat, nitrit, photphat amoni), phân bón, chất tẩy rửa, kim loại nặng, thuốc trừ sâu, dược phẩm chất ô nhiễm khác từ nước thải nước thải, carbon dioxide chất nhiễm khí khác từ khí thải, bên cạnh tốc độ tăng trưởng cao yêu cầu canh tác đơn giản, Chlorella Vulgaris lên loại vi sinh vật tiềm nghiên cứu xử lý sinh học nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường C Vulgaris coi nguồn lượng sinh học đầy hứa hẹn Nó giải pháp thay tốt cho trồng nhiên liệu sinh học đậu tương, ngô hạt cải dầu có suất cao không cạnh tranh với sản xuất lương thực Nó tạo lượng lớn lipid , gấp 20 lần so với loại trồng có cấu hình phù hợp để sản xuất dầu diesel sinh học Loại vi tảo chứa hàm lượng tinh bột cao , tốt cho việc sản xuất ethanol sinh học 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp đo mật độ quang OD Mục đích định tính nồng độ SK môi trường, dựa vào độ hấp thụ quang sắc tố Chlorophyll tế bào Các sắc tố hấp thụ chủ yếu bước sóng tương ứng 420 nm 665 nm 2.2.2 Phương pháp đo nồng độ Chlorophylla Dựa vào khả hấp thụ ánh sáng loại sắc tố bước sóng định để xác định hàm lượng chúng có mẫu Mẫu ly tâm 15.000 vịng/phút 40oC phút để thu SK mẫu Phần SK bổ sung 1ml acetone vào ống eppendorf Sau đó, đem ly tâm 13.000 vịng/phút 40oC phút Lấy dịch đo bước sóng 664 nm, 647 nm Áp dụng công thức xác định nồng độ chlorophyll a: Chlorophyll a (µg/ml) = 11,93.E664 – 1,93.E647 2.3 Phương pháp bảo quản giống Giữ giống phương pháp bảo quản đĩa thạch dài hơn, đồng thời việc hoạt hóa giống dễ dàng 2.4 Phương pháp ni trồng Tiến hành thí nghiệm ni trồng vi tảo bình Erlen, dung tích ni lít Thể tích giống cho vào chiếm 10% thể tích môi trường Giống sử dụng giống cấp nhân vịng ngày Các mẫu thí nghiệm chiếu sáng ống đèn huỳnh quang 20W, chu kỳ chiếu sáng 12h sáng:12h tối, quang thông đo máy Advance Light Meter Nhiệt độ thí nghiệm trì 27- 280oC Khảo sát sinh trưởng cách đo OD thời điểm ngày nuôi trồng Tiến hành thu hoạch SK sinh trưởng vào giai đoạn suy vong 2.5 Phương pháp thu hoạch SK Mẫu ly tâm máy ly tâm Hettich ZENTRIFUGEN với tốc độ 6.000 vòng/phút, 10 phút Sau ly tâm, mẫu sấy khô 500oC đến khối lượng khơng đổi 2.6 Phương pháp ly trích lipid Mẫu SK khô bổ sung hỗn hợp CH3OH, CHCl3, sau siêu âm để phá vỡ màng tế bào tần số sóng 20 kHz 10 phút bổ sung nước ly tâm 6.000 vòng/phút 10 phút để phân thành lớp: lớp MeOH nước trên, lớp SK giữa, lớp Chloroform lipid hòa tan Phần Chloroform lipid chiết chưng cất để thu lipid Thể tích tổng dung mơi bổ sung vào mẫu SK lấy theo quy tắc 100 ml dung môi gam SK Tỷ lệ thể tích dung mơi bổ sung CH3OH:CHCl3:H2O = 10:10:9 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng CO2 đến sinh trưởng tích lũy lipid Ta khảo sát vai trò CO2 sinh trưởng cách tiến hành thực nghiệm mẫu: (1) hồn tồn khơng sục khí; (2) sục khơng khí; (3) sục khơng khí CO2, ánh sáng 4.000 lux Kết hình cho thấy có mặt CO2 môi trường làm tăng tốc độ sinh trưởng suất thu SK lipid Hình 3.1 Vai trò CO2 sinh trưởng tảo Để khảo sát chi tiết ảnh hưởng tốc độ sục khí CO2, ta tiến hành thí nghiệm ánh sáng 7.000 lux, tốc độ sục khơng khí 650 ml/phút Các mẫu khác tốc độ sục khí CO2: 20, 40, 60 ml/phút Kết cho thấy chu kì sống tảo 17 ngày Mật độ SK lớn vào ngày thứ 14, ứng với giá trị cực đại pha cân Kết bảng cho thấy, SK thu hàm lượng lipid giảm dần tốc độ sục CO2 tăng từ 20ml/phút đến 60ml/phút Điều cho thấy CO2 có ảnh hưởng ức chế đến sinh trưởng nồng độ lớn Khi phân tích thành phần mẫu lipid thu từ mẫu sục CO2 máy phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC Bảng SK lipid tảo ảnh hưởng tốc độ sục khí CO2 3.2 Ảnh hưởng cường độ ánh sáng đến sinh trưởng tích lũy lipid Chu kỳ sáng tối thích hợp cho sinh trưởng tích lũy lipid Chlorella Vulgaris 16h sáng : 8h tối Cường độ ánh sáng yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến quang hợp tảo CHƯƠNG KẾT LUẬN Sự thay đổi điều kiện nuôi trồng cường độ chiếu sáng, tốc độ sục khí CO2 nồng độ N (NH4+) ảnh hưởng rõ rệt đến kết thu SK lipid Kết ban đầu cho thấy, điều kiện nuôi trồng: Ánh sáng 7.000 lux, 600 mg NH4Cl/lít tốc độ sục khí 20 ml CO2/phút kết hợp với sục 650 ml khơng khí/phút cho kết khả quan Chất lượng lipid thu phù hợp cho mục tiêu sản xuất biodiesel TÀI LIỆU THAM KHẢO TUẤN, N M., LÊ THỊ BÍCH, Y Ế N., HẢI, N P., XUÂN, N T T., HOÀNG, Đ K., MINH, N H., & TUÂN, N N Nghiên cứu nuôi trồng vi tảo Chlorella vulgaris Tuân, K N N NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI TRỒNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ NĂNG SUẤT THU DẦU CỦA VI TẢO CHLORELLA VULGARIS NHẰM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIODIESEL en.wikipedia.org/wiki/Chlorella_vulgaris https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141022903002746