THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE PHẦN 1: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 1. ĐỊNH NGHĨA: Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO- NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin 2. phân loại Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại: - Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit. - Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase dược chia thành 4 nhóm: - Serin proteinase: là những proteinase có chứa nhóm (-OH) của gốc serin có vai trò quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. - Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm (-SH). - Aspartic proteinase: thuộc nhón pepsin ( pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như chimosin, rennin, pepsin…) - Metallo proteinase: là nhóm được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc 3. Đặc điểm và tính chất Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: P-xerin; P-thiol; P-kim loại; P-acid Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1 NHÓM: MHNK TRANG 1 Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE Bảng 1.1 Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật Nhóm Nguồn E Chất kìm hãm Đặc điểm TTHĐ pH tối thích P Xerin Bac.subtilis Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.flavus Asp.sojae E.coli DFP + Xerin Kiềm P-tiol Streplococcus Clostridium histoly- ticum Indoaxeta-mit Ps.cloromer- curbenzoat -SH 7,5 7,0 P kim loại Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac. Subtilisamy Losaccarilicis Bac. Megaterium Psuedomonasaerugin oa Atreptomeces naraensis Asp. Oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolyti um EDTA ++ 1,10octa- fenantrolin Kim loại hóa trị hai Trung tính NHÓM: MHNK TRANG 2 THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE P Acid Asp.niger Asp.Awamori Sailoi,penicillium Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pucillus Endothia parasilica Dizoaxetil Dlnorlox-inmetil este COOH Acid 3.1. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: - TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. + Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 0 A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. + Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20 0 A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. NHÓM: MHNK TRANG 3 THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P 1 : Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P 2 : Là sản phẩm thứ hai của phản ứng. 3.2. nguồn thu nhận protease Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau: + Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm. + Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao. + Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao. 3.3. đặc điểm nguồn vi sinh vật để sản xuất enzyme protease: Trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme có một số kỹ thuật chung và một số kỹ thuật riêng. Những kỹ thuật chung bao gồm: NHÓM: MHNK TRANG 4 E + S enzyme – S enzyme – S + P 1 enzyme + P 2 Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme Hình 1 Baccillus subtilis THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE + Kỹ thuật tạo giống + Lựa chọn phương pháp nuôi cấy + Thiết kế thiết bị nuôi cấy + Kỹ thuật lên men + Tách, tinh chế thu nhận Enzyme. - Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số Protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học. - Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. Vi khuẩn: Protease trong vi khuẩn có thể sinh ra 2 loai enzyme endopeptidase và exopeptidase. Do đó Protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Bacillus subtilis là chưng vi khuẩn có khả năng tổng hợp manh nhất protease Ngoài ra còn có một số chủng khác B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridiu. NHÓM: MHNK TRANG 5 THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE Nấm mốc: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn Protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicilliumchysogenum)…các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại P: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các Protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp Protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát. Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp Protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus… Các chế phẩm xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành acid amin NHÓM: MHNK TRANG 6 Hình 2: Aspergillus oryzae Hình 3: Condium of Aspergillus oryzae Hình 4: Xạ khuẩn THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE Bảng 1.2 Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease (P) VSV Ghi chú Vi khuẩn Bac. Subtilispha Bac. Cireulans Bac. Sphaericus Bac. Thermophilus Bac. Aerothermophilus Bac. Thermoacidurans Bac.Thermoproteoly ticus Bac. Brevis Bac. Licheniformis Bac. Mesenlericus Bac. Megaterium Bac. Cereus Bac. Pumilus Cl. Perfringens Cl. Histolyticum Cl. Sporogens Ps. Aerruginosa P trung tính, P kiềm (subtillzin) P kiềm P trung tính P Trung tính, P acid P acid và P kiềm { colagenase P trung tính,P kiềm Xạ khuẩn Str. Griseus Str. Rimosus Str. fradiae Str. faeca is Str. reetus var. pro-teolyticus Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, Mỹ, gồm ít nhất 11 enzyme với cơ chất procolagen phân giải 70% đến aa có 5 P, hai peptidase (lơxinamino-peptidase, cacboxypeptidase), hai P: P- serin. Nấm mốc Asp. Oryzae Asp. Satoi Asp. Awamori Asp. Niegr Asp. Shirousami P-kim loại, P xerin, có 3 loại P acid, P trung tính, P kiềm. P acid (aspergilopepti- dase A) P acid Hai P acid P acid NHÓM: MHNK TRANG 7 THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE Asp. Fumigatus Asp. Tericola Asp. Candidus Asp. Ochraceus Asp. Sojae Asp. Flavus Pen. Janthinellum Pen. Chrysogenum Pen. Cyaneo fulvum Mucor. Pusillus Rh. Chinensis Ph. Delemar Ph. Niveus Ph. Nodous Ph. Pseudokinensis Ph. Peka Phymatorrichum omnivorum Hai P: Pacid, và P kiềm P acid có tác dụng làm đông sữa P trung tính P kiềm Hai P: P kiềm và P trung tính P acid P kiềm P acid có tác dụng làm đông sữa đã được dùng ở Nhật để thay thế cho rennin. NHÓM: MHNK TRANG 8 THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE Chương II: sản xuất enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae: 1. giới thiệu chung về nấm mốc Aspergillus oryzae: Aspergillus oryzae Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau… Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng NHÓM: MHNK TRANG 9 THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. NHÓM: MHNK TRANG 10 [...]... trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn Thử nhìn thống kê sơ bộ sau đây về các lãnh vực đã dùng Protease ta có thể thấy được sự đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công. .. Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…) Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ Ta thấy sử dụng nấm mốc để sản xuất protease là một bước dọt phá mới của nghành công nghệ sinh học và qua bài tiểu luận cho ta hiểu hơng vai trò của vi sinh vật trong đời sống của xã hội cung như trong tương lai khi công. .. III: KẾT LUẬN Qua bài tiểu luận ta thấy việc ứng dụng các vi sinh vật vào công nghiệp của thế giới là thành quả mới nhằm giảm thiểu sử dụng các chất hóa học để sản xuất công nghiệp gây ra ô nhiểm môi trường sống của con người Ở Việt Nam bước đầu đa có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp... lọc vào các khoang, còn các tiểu phần rắn của huyền phù bị giữ lại trên bề mặt của băng tải Sơ đồ thiết bị lọc chân không dạng thùng quay tác động liên tục NHÓM: MHNK TRANG 17 THU NHẬN PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.ORYZAE CHƯƠNG III: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC APS ORYZAE: Protease không những được ứng dụng nhiều trong y dược, hóa học, trong nông nghiệp, mà trong công nghiệp Protease chiếm vai... khác từ khối môi trường nuôi cấy Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này  Kết tủa enzym protease Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả... và qua bài tiểu luận cho ta hiểu hơng vai trò của vi sinh vật trong đời sống của xã hội cung như trong tương lai khi công nghệ sinh học đang phát triển Nắm được đặc tính sinh lý của vi sinh vật Biết được một số nhóm vi sinh vật chính có thể sản xuất enzyme Protease ứng dụng trong công nghiệp NHÓM: MHNK TRANG 20 ... nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học… Nhưng chủ yếu enzyme protease chiết xuất từ nấm mốc Aps oryzae trong sản xuất Bia: - Chế phẩm Protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian... Ta tiến hành thanh trùng trong thời gian 45- 60 phút, áp suất 1at, nhiệt độ 118 – 1250C  Máy nghiền búa: Loại thiết bị này được dùng để nghiên cứu các chủng nấm mốc Sản phẩm ban đầu có kích thước các tiểu phần nhỏ đến 50 mm qua đoạn ống ở trên nắp của thiết bị, được cho vào tâm rôto một cách liên tục, dưới tác động của lực ly tâm sản phẩm qua khoảng giữa các búa bị va đập nhiều lần và bị vỡ ra Thiết . được sự đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương. chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…). Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng được. dọt phá mới của nghành công nghệ sinh học và qua bài tiểu luận cho ta hiểu hơng vai trò của vi sinh vật trong đời sống của xã hội cung như trong tương lai khi công nghệ sinh học đang phát