Tập - Số 2021 Địa chỉ: 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội * Tel: 024.39335735 * Fax: 024.39335738 Email: tapchikntp.nifc@gmail.com * Website: nifc.gov.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 4, số 1, 2021 Vietnamese Journal of Food Control - vol 4, no 1, 2021 MỤC LỤC Trang Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex kháng kháng sinh carbapenem phân lập rau ăn sống thịt chế biến sẵn địa bàn thành phố Hà Nội Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex in ready-to-eat vegetables and meats in Hanoi Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol huyết tương thỏ sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Determination of esomeprazole in rabbit plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 10 Lactobacillus sp thử nghiệm ứng dụng bảo quản nông sản Collection of phenyllactic acid from a strain of Lactobacillus sp and application in agricultural products preservation 22 Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật sản phẩm thịt chế biến số chợ khu vực nam sông Hương thành phố Huế Assessment of microbiological contamination levels in processed meat products from markets in southern Hue city 34 Xác định đồng thời Nisin A Nisin Z sản phẩm dinh dưỡng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Simultaneous determination of Nisin A and Nisin Z in nutritional food by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 43 Đánh giá mức độ nhiễm đặc điểm kháng kháng sinh Salmonella spp phân lập từ thủy hải sản tươi sống chợ truyền thống địa bàn thành phố Hồ Chí Minh Investigation into infectability and antimicrobial susceptibility of Salmonella spp isolated from fresh seafood at traditional markets in Ho Chi Minh city Trương Huỳnh Anh Vũ, Nguyễn Hoàng Khuê Tú, Huỳnh Yên Hà, Chu Vân Hải 52 Chế tạo khảo sát khả tăng cường tín hiệu Raman đế Silic cấu trúc kim tự tháp/ nano bạc Fabrication and study of Raman signal enhancement of pyramid/nano-Ag structured Silic substrate 62 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide từ sữa mẹ thực phẩm bổ sung kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 73 dietary supplements by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) Nghiên cứu khoa học Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex kháng kháng sinh carbapenem phân lập rau ăn sống thịt chế biến sẵn địa bàn thành phố Hà Nội Tạ Thị Yến*, Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh, Vũ Thị Hải Hà Phạm Văn Quân, Nguyễn Thành Trung Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Hà Nội, Việt Nam (Ngày đến tòa soạn: 26/12/2020; Ngày chấp nhận đăng: 18/03/2021) Tóm tắt Acinetobacter spp vi khuẩn gây bệnh phổ biến người Chi Acinetobacter bao gồm khoảng 65 loài, nhóm Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex xác định nguyên nhân gây 80% trường hợp nhiễm trùng bệnh viện bệnh nhân suy giảm miễn dịch Các phân tích kiểu hình có khơng đủ để xác định xác phân biệt loài Acinetobacter spp quan trọng mặt lâm sàng Trong tổng số 480 mẫu rau ăn sống thịt chế biến sẵn thu thập 06 quận nội thành Hà Nội gồm Đống Đa, Hoàng Mai, Hai Bà Trưng, Long Biên, Hà Đơng, Cầu Giấy, có 288 mẫu (chiếm 60%) nhiễm Acinetobacter spp Kết định danh kỹ thuật MALDI-TOF MS ghi nhận 208 mẫu (43%, n = 480) nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, 156 mẫu rau ăn sống (65%, n = 240) 52 mẫu thịt (22%, n = 240) nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex Thử nghiệm kháng sinh đồ khoanh giấy kháng sinh cho thấy 82% số chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kháng với kháng sinh imipenem 30% số chủng kháng với meropenem Từ khóa: Acinetobacter spp., Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, MALDI-TOF MS, carbapenem ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn Acinetobacter spp vi khuẩn gây bệnh phổ biến gây triệu chứng nhiễm trùng máu, nhiễm khuẩn bệnh viện tiêu chảy Ngồi mơi trường bệnh viện, vi khuẩn Acinetobacter spp tìm thấy thực phẩm rau, táo, dưa, cải bắp, súp lơ, rau diếp, dưa chuột, ớt, phòng bệnh, củ cải, cà rốt loại củ khoai tây ngũ cốc ngô Acinetobacter spp xem ngun nhân gây hỏng thịt xơng khói, thịt gà, thịt lợn, cá trứng chúng bảo quản tủ lạnh sau chiếu xạ gamma [1] Trong loài vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex tập hợp gồm 04 lồi vi khuẩn có khả gây bệnh phân lập từ đất, nước thực phẩm bao gồm thịt, cá, trái rau, làm dấy lên lo ngại * Điện thoại: 0904959050 Email: yenta84@gmail.com Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii thực phẩm nguồn lây nhiễm tiềm ẩn cho người, đặc biệt sở y tế [1] Bên cạnh đó, tượng vi khuẩn kháng đa kháng sinh (MDR) vấn đề quan ngại điều trị bệnh nhiễm trùng mắc phải bệnh viện cộng đồng Tổ chức Y tế Thế giới gần xác định tình trạng kháng thuốc kháng sinh ba vấn đề quan trọng mà người phải đối mặt Các vi khuẩn kháng đa kháng sinh nghiêm trọng phổ biến xác định loài Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa Enterobacter spp [2] Tại Việt Nam, Bộ Y tế ban hành thông tư tài liệu hướng dẫn kháng sinh sử dụng điều trị Dựa Hướng dẫn sử dụng kháng kháng sinh (Ban hành kèm theo Quyết định số 708/QĐ-BYT ngày 02/3/2015) tác dụng Acinetobacter baumannii Thông tư 19/2018/TT-BYT Ban hành danh mục thuốc thiết yếu điều trị nhiễm khuẩn, kháng sinh carbapenem khuyến cáo sử dụng điều trị nhiễm khuẩn Acinetobacter baumannii, đặc biệt imipenem meropenem Rau thịt nguồn thực phẩm phổ biến sống ngày người Việt Nam Theo báo cáo Ngân hàng giới vào năm 2017, tỉ lệ tiêu thụ rau Việt Nam 0,4 kg rau ngày người tỉ lệ tiêu thụ rau Hà Nội 2.800 ngày [3] Theo Niên giám thống kê năm 2019, sản lượng giết mổ bán gia cầm, thịt lợn Hà Nội 1302,5 3328,8 nghìn [4] Từ cho thấy rau thịt nguồn tiêu thụ cho nhu cầu ăn uống ngày người dân Hà Nội Cũng loại thực phẩm khác, thịt rau ăn sống nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, lây truyền chủng vi khuẩn kháng kháng sinh lên người Vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex phát số loại thực phẩm Tuy nhiên chưa có báo cáo thực trạng nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex rau ăn sống sản phẩm thịt kháng kháng sinh tiêu thụ Hà Nội bán quán bán đồ ăn sẵn để cung cấp liệu thực trạng thực phẩm nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh carbapenem Hà Nội Việt Nam Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định lưu hành tỉ lệ kháng kháng sinh carbapenem Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex mẫu rau ăn sống thịt chế biến sẵn bán cửa hàng bán đồ ăn sẵn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các vật liệu sử dụng nghiên cứu gồm: - Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả điều tra cắt ngang, thu thập mẫu ngẫu nhiên dựa công thức cỡ mẫu để xác định lượng mẫu tiến hành nghiên cứu: + 240 mẫu thịt chế biến sẵn (sản phẩm từ thịt lợn, vịt, gà: thịt lợn quay, giò, chả, vịt nướng, gà luộc) + 240 mẫu rau ăn sống bán kèm sản phẩm thịt (rau diếp, xà lách, húng láng, húng quế, mùi ta, mùi tàu, ngổ, hành, ) - Địa điểm thu thập mẫu: cửa hàng bán đồ ăn có kèm rau ăn sống địa bàn 06 quận nội thành Hà Nội, bao gồm: Đống Đa, Hoàng Mai, Hai Bà Trưng, Long Biên, Hà Đơng, Cầu Giấy Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh, Nguyễn Thành Trung - Thời gian thu thập mẫu: Năm 2019 - 2020 - Các mẫu sau bảo quản phịng thí nghiệm nhiệt độ 4oC - 8oC phân tích ngày vào ngày hơm sau 2.2 Hóa chất, chất chuẩn 2.2.1 Hóa chất dụng cụ Các hóa chất sử dụng nghiên cứu bao gồm: Buffer Peptone water (Merck, Đức), TSA agar (Merck, Đức), chromagar Acinetobacter (Chromagar), Mueller Hinton agar (Merck, Đức), VITEK MS-CHCA (Biomerieux, Mỹ), khoanh giấy kháng sinh carbapenem (Liofilchem, Ý), mipenem (IMP, 10 µg), meropenem (MRP, 10 µg) Các dụng cụ sử dụng bao gồm: Đĩa petri vô trùng (Corning, Mỹ), que cấy vô trùng (Biologix, Mỹ), khay Vitek (Biomerieux, Mỹ) 2.2.2 Chủng chuẩn Phát Acinetobacter baumannii rau, tính kháng kháng sinh: sử dụng chủng E coli ATCC 25922, chủng Acinetobacter baumannii phân lập mẫu bệnh phẩm bệnh nhân Bệnh viện Thanh Nhàn [5] Chủng thu nhận từ Bệnh viện giải trình tự, so sánh với liệu ngân hàng Gen Hoa Kỳ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), xác định độ tương đồng 100% với chủng Acinetobacter baumannii 2008S11-069 Định danh vi khuẩn kỹ thuật khối phổ thời gian bay sử dụng nguồn tia laser với trợ giúp chất (MALDI TOF), sử dụng chủng E coli ATCC 8739 2.3 Thiết bị Nồi hấp (Hymaraya, Nhật), tủ sấy (Sanyo, Nhật), cân kỹ thuật D = 0,1 ML802 (Metter Toledor, Thụy Sĩ), tủ ấm (Memert, Đức), tủ an toàn sinh học cấp (Bio II, Anh), máy đồng mẫu (Anh), hệ thống VITEK MS (Biomerieux, Mỹ) 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phát Acinetobacter spp phương pháp nuôi cấy truyền thống Việc phát Acinetobacter spp theo phương pháp truyền thống thực theo bước sau: - Cân mẫu: Cân 25 g (từ 0,1 kg rau thịt đồng nhất) - Tăng sinh 25g mẫu 225 mL đệm peptone kép Tiến hành nuôi qua đêm 37oC/18 ± 2h - Ria lên mơi trường Chromagar Acinetobacter có bổ sung chất bổ sung [6] - Thu nhận khuẩn lạc màu đỏ Acinetobacter spp 2.4.2 Định danh Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kỹ thuật MALDI TOF Các bước tiến hành định danh vi khuẩn kỹ thuật MALDI TOF thiết bị VITEK MS theo hướng dẫn nhà sản xuất thiết bị, cụ thể sau: - Bước 1: Chủng vi khuẩn nuôi môi trường TSA 37oC/24h Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii - Bước 2: Vi khuẩn phết lên giếng khay - Bước 3: Nhỏ 0,1 μL dung dịch CHCA - Bước 4: Quét mã khay, nhập mã mẫu vào phần mềm Malditof preparation - Bước 5: Phân tích thiết bị - Bước 6: Đọc kết phần mềm Myla 2.4.3 Xác định tính kháng kháng sinh vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kỹ thuật kháng sinh đồ Tính kháng kháng sinh Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh theo qui trình hướng dẫn tổ chức sức khỏe động vật giới [7], cụ thể sau: - Bước 1: Tạo dung dịch chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex: 106 - 108 CFU/mL - Bước 2: Sử dụng tăm vô trùng dàn dịch chủng Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex lên đĩa thạch Muller Hinton agar - Bước 3: Hong khơ nhiệt độ phịng đặt khoanh giấy kháng sinh có chứa kháng sinh (nồng độ kháng sinh thể (Bảng 1) - Bước 4: Đo kích thước vịng kháng, đối chiếu với kích thước chủng đối chiếu (E coli ATCC 25922, A baumannii đối chứng) theo hướng dẫn tổ chức Phịng Thí nghiệm lâm sàng Hoa Kỳ chuẩn kháng sinh theo Bảng [8] - Bước 5: Đọc kết quả: kháng, nhạy cảm, không kháng Bảng Kháng sinh, nồng độ kháng sinh điểm đọc kháng sinh đồ (kháng, trung gian, không kháng) Kháng sinh Carbapenem Tên viết tắt Điểm đọc tiêu chuẩn Nồng độ kháng sinh (µg) S I R Imipenem IMI 10 ≥ 22 19 - 21 ≤ 18 Meropenem MRP 10 ≥ 18 13 - 17 ≤ 14 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Sự lưu hành vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex 3.1.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Acinetobacter spp thịt rau sống Nghiên cứu tiến hành phân tích phát định lượng vi khuẩn Acinetobacter spp 480 mẫu thịt chế biến sẵn rau ăn sống quán bán đồ ăn có kèm rau ăn sống thuộc 06 Quận nội thành Hà Nội từ năm 2019 - 2020 Các chủng vi khuẩn màu đỏ xuất môi trường Chromagar Acinetobacter có bổ sung kháng sinh xác định Acinetobacter spp (Hình 1) Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh, Nguyễn Thành Trung A B Hình Vi khuẩn Acinetobacter spp thạch Chromagar Acinetobacter Chủng vi khuẩn Acinetobacter phân lập từ mẫu Chủng vi khuẩn A baumannii đối chứng Kết phân tích 480 mẫu cho thấy có tới 288 mẫu (chiếm 60%) nhiễm Acinetobacter spp., có 178/240 mẫu rau (chiếm 74%) 110/240 mẫu thịt (chiếm 46%) nhiễm Acinetobacter spp Xét theo thời gian, năm 2019, tổng số 240 mẫu lấy có 165/240 mẫu rau thịt (65%) nhiễm Acinetobacter spp Năm 2020, tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp 240 mẫu thu thập cho tỉ lệ thấp với 123/240 mẫu nhiễm, chiếm 51% (Bảng 2) Bảng Tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp thịt chế biến sẵn rau ăn sống 2019 (n = 240) Thực phẩm Mẫu nhiễm Thịt chế biến sẵn (n = 240) 2020 (n = 240) Tỉ lệ nhiễm Mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm 2019 - 2020 (n = 480) Mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm 63 53% 47 39% 110 46% sống (n = 240) 102 85% 76 63% 178 74% Tổng 165 65% 123 51% 288 60% Rau ăn Kết phân tích nghiên cứu tương đồng với kết nhiều nước giới diện vi khuẩn Acinetobacter spp đối tượng rau ăn sống có tỉ lệ nhiễm cao Trong nghiên cứu Berlau cộng [9] thực năm 1999 ghi nhận tỉ lệ nhiêm Acinetobacter spp mẫu rau tươi 17% Nghiên cứu HamitonMiler Shah (2001) cho thấy xuất 02 chủng Acinetobacter spp mẫu rau salad ăn sống [10] Tại Hồng Kông (2001), 51% mẫu rau (n = 21) nhiễm Acinetobacter spp [11] Kết nghiên cứu cho thấy tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp rau ăn sống (74%) thấp nghiên cứu Carvalheira cộng (2017), thực Bồ Đào Nha, ghi nhận 86,7% rau diếp nhiễm Acinetobacter spp [12] Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii Sự nhiễm vi khuẩn Acinetobacter spp có tỉ lệ cao rau ăn sống xác định lây nhiễm trình trồng trọt bắt nguồn từ nguồn nước tưới đất, nguyên nhân thường thấy nước phát triển rau rửa nguồn nước ô nhiễm trước phân phối thị trường Trong sản xuất nông nghiệp, rau nhiễm vi sinh vật gây bệnh liên quan tới trình sử dụng nước ao nước sơng để rửa rau, cách thức xử lý rau người trồng rau lưu trữ rau nơi bị ô nhiễm Các nghiên cứu giới nước cho thấy diện vi khuẩn nước rửa rau, rau ăn sống ô nhiễm vi sinh lên sản phẩm thực vật nguồn chất thải người thực tế nước phát triển, nơng nghiệp canh tác theo mơ hình vườn ao chuồng Sự lây truyền vi khuẩn từ nguồn nước lên rau sống xảy trình trồng trọt biết đến đường lây nhiễm chuỗi cung ứng thực phẩm tượng tất yếu Điều lý giải cho nhiễm khuẩn Acinetobacter spp rau ăn sống thu thập địa bàn Hà Nội với tỉ lệ cao chiếm 74%, Việt Nam vùng thâm canh, sử dụng nguồn nước tưới chưa qua kiểm soát chất lượng để trồng rau, dễ dàng bắt gặp hình ảnh người nơng dân, người bán hàng rửa rau ao hồ, kênh mương trước đưa tiêu thụ Kết nghiên cứu chúng tơi có tương đồng có mặt vi khuẩn Acinetobacter spp với nghiên cứu tác giả khác giới thịt chế biến sẵn, khác tỉ lệ nhiễm Nghiên cứu Chalchisa Kenasa Nigeria (2019) thịt chế biến sẵn cửa hàng ăn Trường đại học Wollega, cho thấy 10.3 % mẫu nhiễm Acinetobacter spp [13] Một nghiên cứu khác Oranusl Bralde [14] cho thấy diện Acinetobacter spp bánh thịt Trong đó, chủng vi khuẩn xác định 01 03 chủng vi sinh vật nguyên nhân gây hỏng thịt nghiên cứu Lulietto cộng [15] Sự ô nhiễm Acinetobacter spp sản phẩm thịt chế biến sẵn trình xử lý, cắt lát, đóng gói, làm lạnh Nguồn gốc lây nhiễm đến từ nguyên liệu thô sử dụng dẫn đến lây nhiễm Acinetobacter spp sản phẩm thịt môi trường nhà bếp nơi chế biến sản phẩm thịt [15] 3.1.2 Định danh vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex 288 chủng vi khuẩn Acinetobacter spp thu thập từ mẫu nghiên cứu tiến hành định danh xác định nhóm vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kỹ thuật MALDI-TOF thiết bị VITEK MS Kết cho thấy 208/288 (72%) chủng Acinetobacter spp Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex xác định với độ tương đồng 99,9%, tương đương với 43% (208/480) mẫu rau thịt nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex Trong 156/178 chủng phân lập từ mẫu rau 52/110 chủng phân lập từ mẫu thịt Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, 88% 47% nhóm Acinetobacter spp phân lập; tương đương 65% (n = 240) mẫu rau ăn sống 22% (n = 240) mẫu thịt nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex 3.2 Vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kháng kháng sinh carbapenem Kết kiểm tra khoanh giấy kháng sinh thu tỉ lệ kháng carbapenem cao chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex thu thập (Bảng 3) Tỉ lệ kháng kháng sinh phát với 82% 30% chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex tương ứng với kháng với kháng sinh imipenem meropenmem Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh, Nguyễn Thành Trung Bảng Tính kháng kháng sinh carbapenem vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex Kháng sinh carbapenem Tên viết tắt Nồng độ kháng sinh (µg) Số chủng kháng Tỉ lệ kháng (%) Imipenem IMI 10 171 82 Meropenem MRP 10 62 30 Tỉ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm carbapenem (imipenem meropenem) sản phẩm thịt rau ăn sống cao với chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex phân lập mẫu bệnh phẩm bệnh nhân Trong nghiên cứu Tran cộng thực từ năm 2010 - 2014 03 bệnh viện lớn Hà Nội (Việt Đức, Thanh Nhàn Xanh Pôn), cho thấy 23/528 chủng kháng carbapenem [16] Điều cho thấy thực phẩm vật chủ trung gian lây truyền vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex lên người Tỷ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm carbapenem cao (82% với immipenem 30% với meropenem) xuất phát từ việc sử dụng kháng sinh carbapenem cho điều trị bệnh nhiễm khuẩn Acinetobacter baumannii bệnh viện Nguồn nước thải từ bệnh viện có chứa mầm bệnh, phát tán môi trường chưa xử lý, phát tán mầm bệnh chứa gen kháng kháng sinh lên thực phẩm (rau sống, thịt tươi, …) trình chăn nuôi, trồng trọt giết mổ KẾT LUẬN Kết nghiên cứu 480 mẫu rau thịt sống thu thập cửa hàng bán đồ ăn sẵn 06 quận nội thành Hà Nội cho thấy vi khuẩn Acinetobacter spp phát hành 288 mẫu (60%), đó, 208 mẫu (43%, n = 480) nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex với 156 mẫu rau ăn sống (65%, n = 240) 52 mẫu thịt (22%, n = 240) Trong đó, 82% 30% chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex phân lập (n = 208) kháng với kháng sinh imipenem meropenem TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] H J Doughari, P A Ndakidemi, I S Human, & S Benade, “The Ecology, Biology and Pathogenesis of Acinetobacter spp.: An Overview,” Microbes Environments, vol 26, no 2, pp 101-112, 2011 [2] A Howard, M O’Donoghue, A Feeney, & R D Sleator, “Acinetobacter baumannii: An emerging opportunistic pathogen,” Virulence, vol 3, no 3, pp 243-250, 2012 [3] World Bank, Vietnam food safety risks management : challenges and opportunities: Quản lý nguy an toàn thực phẩm Việt Nam : thách thức hội (Vietnamese) Washington, D.C.: World Bank Group, 2017 [4] Tổng cục thống kê, Niên giám thống kê Nhà xuất thống kê Hà Nội: Nhà xuất Thống Kê, 2019 [5] Bệnh viện Thanh Nhàn, “Đề tài: Nghiên cứu qui trình chế tạo kit Multiplex Realtime Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii PCR phát số tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện bệnh viện Hà Nội,” mã số 01C-08/02-2016, 2016 – 2018 [6] A Y Ciftci, E Karakece, A R Atasoy, G Asik, and I H Ciftci, “Culture media for detection of Acinetobacter baumannii selective media for detection of A baumannii,” Journal of Microbioly and Experimentation, vol 2, no 3, pp 87-90, 2015 [7] World Organisation for Animal Health, “Chapter 2.1.1 Laboratory Methodologies for Bacterial Antimicrobial Susceptibility Testing,” OIE Manual of diagnostic tests and vaccines for Terrestrial Animals, 2019 [8] Clinical and Laboratory Standard Institute, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 2019 [9] J Berlau, H M Aucken, E Houang, T L Pitt, “Isolation of Acinetobacter spp including A baumannii from vegetables: implications for hospital-acquired infections”, Journal of Hospital Infection, vol 42, 201-204, 1999 [10] J M T Hamilton-MillerSarojShah, “Identity and antibiotic susceptibility of enterobacterial flora of salad vegetables,” International Journal of Antimicrobial Agents, vol 18, no 1, pp 81-83, 2001 [11] E T Houang, Y W Chu, C M Leung, K Y Chu, J Berlan, K C Ng, and A F B Chong, “Epidemiology and infection control implications of Acinetobacter spp in Hong Kong,” Journal Clinical Microbiology, vol 39, no.1, pp 228-234, 2001 [12] A Carvalheira, Joana Silva, Paula Teixeira, “Acinetobacter spp in food and drinking water – A review,” Food Microbiology, 2020 [13] W Chalchisa & G Kenasa, “Microbial Quality and Safety of Ready-to-Eat Foods in Cafeterias around Wollega University, Nekemte Campus (Ethiopia),” Research & Reviews: Journal of Food and Dairy Technology, 2019 [14] U S Oranusi & W Braide, “A study of microbial safety of ready-to-eat foods vended on highways: Onitsha-Owerri, south east Nigeria,” International Research Journal of Microbiology, vol 3, no 2, pp 066-071, 2012 [15] M F Lulietto, P Sechi, E Borgogni, and B T Cenci-Goga, “Meat Spoilage: A Critical Review of a Neglected Alteration Due to Ropy Slime Producing Bacteria,” Italian Journal of Animal Science, vol 14, no 3, pp 4011, 2015 [16] D N Tran, H H Tran, M Matsui, M Suzuki, K Shibayama, T D Pham, T T Van Phuong, D A Dang, H S Trinh, C T Loan, L T V Nga, H R Van Doom, and H F L Wertheim, “Emergence of New Delhi metallo-beta-lactamase and other carbapenemase-producing Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex among patients in hospitals in Ha Noi, Viet Nam,” European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, vol 36, pp 219-225, 2017 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Chế tạo khảo sát khả tăng cường tín hiệu Raman đế Silic 3.4 Hệ số tăng cường tín hiệu (EF) đế Ag@PSi Để đánh giá khả tăng cường tín hiệu Raman đóng góp cấu trúc kim tự tháp đế Silic từ liệu Raman đế Ag@PSi so với đế Ag Si phẳng chưa có cấu trúc kim tự tháp (đế thơng thường Ag@Si), chúng tơi tính hệ số tăng cường (EF) đỉnh 1.362 cm-1 dựa vào công thức (1): 𝐸𝐸𝐸𝐸 = 𝐼𝐼𝐴𝐴𝐴𝐴@𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑁𝑁𝑃𝑃𝑃𝑃 𝐼𝐼𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑁𝑁𝐴𝐴𝐴𝐴@𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 Trong đó, IAg@PSi IAg@Si cường độ đỉnh phổ đặc trưng chất hấp phụ đế SERS đế thông thường; NAg@Si NAg@PSi số phân tử thể tích tán xạ phép đo Raman đế (Si) phép đo SERS Hình thể phổ Raman R6G đế Ag@Si Ag@PSi nồng độ tương ứng 10-3 M 10-6 M -6 Ag@PSi 10 M -3 Ag@Si 10 M Hình Phổ SERS R6G đế Ag@Si Ag@PSi Kết tính hệ số tăng cường EF đỉnh phổ đặc trưng R6G 1362 cm-1 9,7 × 10 Điều chứng tỏ đế Ag@PSi có khả phát R6G nồng độ thấp cấu trúc kim tự tháp Silic tăng cường tín hiệu tán xạ đế SERS Ag@PSi lên khoảng 103 lần KẾT LUẬN Nghiên cứu chế tạo thành cơng đế Silic có cấu trúc kim tự tháp đồng bề mặt, kích thước từ - μm với thông số tối ưu nhiệt độ ăn mòn 70oC, thời gian ăn mòn phút, nồng độ dung dịch KOH M nồng độ dung dịch IPA M Đồng thời, tạo lớp phủ hạt nano bạc có bề dày 20 nm lên đế Silic cấu trúc kim tự tháp phương pháp phún xạ cho hiệu ứng tăng cường tín hiệu Raman với dung dịch R6G nồng độ thấp (10-6 M) cấu trúc kim tự tháp tăng cường tín hiệu Raman lên 9,7 × 102 lần LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tài trợ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, với mã số đề tài T2019 - 37 70 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Đậu Trần Ánh Nguyệt, Văn Võ Kim Hiếu, Trần Thị Thanh Vân, Huỳnh Nguyễn Thanh Luận TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] B Sharma, R R.Frontiera, A I Henry, E Ringe and R P.Van Duyne, "SERS: Materials, applications, and the future," Materials Today, vol 15, no 1-2, pp 16-25, 2012 [2] I Rigo, M Veres, L Himics, S Toth, A Czitrovszky, A Nagy and P Furjes, "Comparative analysis of SERS substrates of different morphology," Procedia Engineering, vol 168, pp 371-374, 2016 [3] A M Al-Husseini and B Lahlouh, "Silicon pyramid structure as a reflectivity reduction mechanism," Journal of Applied Sciences, vol 17, pp 374-383, 2017 [4] L Sun, P Chen and L Lin, "Enhanced molecular spectroscopy via localized surface plasmon resonance," Intech, 2016 [5] M Kahraman, E R Mullen, A Korkmaz and S Wachsmann-Hogiu, "Fundamentals and applications of SERS-based bioanalytical sensing," Nanophotonics, vol 6, no 5, 2017 [6] R Nisticò, P Rivolo, C Novara and F Giorgis, "New branched flower-like Ag nanostructures for SERS analysis," Colloids and Surfaces A, vol 578, 2019 [7] S Jiang, J Guo, C Zhang, C Li, M Wang, Z Li, S Gao, P Chen, H Si and S Xu, "A sensitive, uniform, reproducible and stable SERS substrate has been presented based on MoS2@Ag nanoparticles@pyramidal silicon," RSC Advances, vol 7, pp 5764-5773, 2017 [8] Z Li, S C Xu, C Zhang, X Y Liu, S S Gao, L T Hu, J Guo, Y Ma, S Z Jiang and H P Si, "High-performance SERS substrate based on hybrid structure of graphene oxide/AgNPs/ Cu film@pyramid Si," Scientific Reports, 2016 [9] A Roy, A Maiti, T K Chini and B Satpati, "Annealing Induced Morphology of Silver Nanoparticles on Pyramidal Silicon Surface and Their Application to Surface Enhanced Raman Scattering," ACS Applied Materials and Interfaces, vol 9, no 39, 2017 [10] I T Sugiarto, Isnaeni and K Y Putri, "Analysis of dual peak emission from Rhodamine 6G organic dyes using photoluminescence," Journal of Physics: Conference Series, vol 817, 2017 [11] C Zhang, S Z Jiang, C Yang, C H Li, Y Y Huo, X Y Liu, A H Liu, Q Wei, S S Gao, X G Gao and B Y Man, "Gold@silver bimetal nanoparticles/pyramidal silicon 3D substrate with high reproducibility for highperformance SERS," Scientific Reports, Article no : 25243, 2016 [12] N Ximello, H Haverkamp and G Hahn, "A new KOH-etch solution to produce a random pyramid texture on monocrystalline silicon at elevated process temperatures and shortened process times," Materials Science, pp 1958 - 1960, 2009 [13] I Zubel, K Rola and M Kramkowska, "The effect of isopropyl alcohol concentration on the etching process of Si-subtrates in KOH solutions," Sensors and Actuators A Physical, vol 171, no 2, pp 436-445, 2011 [14] Y Wang, R Luo, J Ma and S Q Man, "Fabrication of the pyramidad microstructure on silicon substrate using KOH solution", The 5th International Conference on Advanced Engineering Materials and Technology, AEMT 2015, pp 302-307, 2015 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 71 Chế tạo khảo sát khả tăng cường tín hiệu Raman đế Silic Fabrication and study of Raman signal enhancement of pyramid/ nano-Ag structured Silic substrate Dau Tran Anh Nguyet1,2, Van Vo Kim Hieu1,2 Tran Thi Thanh Van1,2, Huynh Nguyen Thanh Luan1,2 Faculty of Material Science and Technology, University of Science, VNU-HCM, Vietnam Vietnam National University Ho Chi Minh City Abstract The pyramid-structured silicon substrate was successfully fabricated by a chemical corrosion method with an average thickness of about - μm with the optimal parameters such as corrosion temperature of 70oC, corrosion time of min, concentration KOH of M and isopropyl alcohol concentration of M After that, the silver nanoparticles layer (thickness 20 nm) was coated on the silicon substrate by a sputtering method to enhance the SERS signal The results proved that the Pyramid/nano Ag structure silicon substrate showed the enhancement effect of Raman signal, and Rhodamine 6G pigment in food at low concentration (10-6 M) was detected and the enhancement factor was 9.7 × 102 Keywords: Ag@PSi, PSi, Raman, SERS, Silic substrate 72 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Nghiên cứu khoa học Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide từ sữa mẹ (HMOs) thực phẩm bổ sung kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Nguyễn Thị Hồng Ngọc1*, Mạc Thị Thanh Hoa1, Trần Hùng Sơn1, Ngô Mạnh Dũng2 Cao Công Khánh1, Vũ Thị Thanh An1, Phạm Thị Thanh Hà2, Lê Thị Hồng Hảo1 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Hà Nội, Việt Nam Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam (Ngày đến tòa soạn: 25/12/2020; Ngày chấp nhận đăng: 19/3/2021) Tóm tắt Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần ứng dụng nhằm nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng số oligosaccharide từ sữa mẹ (Human Milk Oligosaccharides - HMOs) gồm 2’-Fucosyllactose (2’-FL), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-tetraose (LNT), 3’-Siallylactose (3’-SL) 6’-Siallylactose (6’-SL) thực phẩm bổ sung dạng bột dạng lỏng Hệ pha động sử dụng gồm kênh: kênh A (dung dịch acid formic 0,1%) kênh B (acetonitril) kết nối với cột phân tích HILIC (1,7 μm; 2,1 × 150 mm) thơng qua detector khối phổ cho thời gian phân tích ngắn, 10 phút xác định đồng thời 05 chất thuộc nhóm HMOs Phương pháp thẩm định cho thấy độ xác cao, nhanh, hiệu áp dụng vào phân tích mẫu thị trường cho thấy khả ứng dụng cao thực tế Giới hạn phát giới hạn định lượng cho chất 2’-FL, LNnT, LNT, 3’-SL, 6’-SL tương ứng 4,0 mg/kg 10,0 mg/kg Khoảng tuyến tính phương pháp nằm khoảng từ 0,4 - 40 Mg/mL Các thông số thẩm định khác bao gồm độ (R% 98,8 - 103 %); độ xác (RSD% 1,69 - 5,54 %) đáp ứng theo yêu cầu AOAC Quy trình áp dụng vào thực tế phân tích 25 mẫu thực phẩm bổ sung (TPBS) thị trường cho kết tổng HMOs mẫu TPBS dạng bột khoảng 0,1 - 0,3 g/100g TPBS dạng lỏng khoảng 0,01 - 0,03 g/100mL Từ khóa: 2’-Fucosyllactose (2’-FL), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-tetraose (LNT), 3’-Siallylactose (3’-SL), 6’-Siallylactose (6’-SL); HMOs; Thực phẩm bổ sung; HPLC; LC-MS/MS I ĐẶT VẤN ĐỀ Oligosaccharide từ sữa mẹ (Human Milk Oligosaccharide - HMOs) nhóm sinh khối dồi thứ ba sau đường sữa lipid, đạt từ đến 20 g/L sữa mẹ [1] Có tới 1% HMOs hấp thu đường tiêu hóa tìm thấy tuần hoàn toàn thân Sự đa dạng phong phú có người khơng thấy động vật có vú khác Hàm lượng HMOs phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: giai đoạn tiết sữa, chế độ dinh dưỡng người mẹ, khuynh hướng di truyền chí khu vực địa lý - thổ nhưỡng môi trường kinh tế xã hội Mặc dù HMOs cấu tạo từ 05 loại monosacaride bản, độ phức tạp cấu trúc HMOS sữa mẹ phong phú đa dạng Hiện nay, 200 loại oligosaccharide khác mặt cấu trúc tìm thấy, có 19 chất thuộc nhóm HMOs mơ tả * Tel: 0975565542 Email: hngoc1710@gmail.com Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 73 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide xác định cấu trúc Năm loại monosaccharide hình thành cấu trúc HMOs gồm có glucose (Glc), galactose (Gal), N-Acetyl-Glucosamine (GlcNAc), furcose (Fuc) acid sialic (Neu5Ac) [2-3] Hình Dựa cấu trúc cấu tạo, HMOs xem prebiotic với tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm Tác dụng HMOs sức khỏe phát triển trẻ nhỏ mơ tả tổng qt hoạt tính prebiotic, hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, hỗ trợ phát triển đường tiêu hóa… [3-4] Do đó, thị trường xuất nhiều sản phẩm bổ sung chất thuộc nhóm HMOs cơng thức bào chế Tuy nhiên, Việt Nam chưa có phương pháp phân tích xác định hàm lượng HMOs bổ sung vào sản phẩm thực phẩm bổ sung Vì vậy, việc phát triển phương pháp phân tích để kiểm soát sản phẩm thị trường điều cần thiết Hình Liên kết hình thành HMOs từ 05 monosaccharide [2] Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu xác định chất thuộc nhóm HMOs mẫu khác với kỹ thuật đa dạng Các kỹ thuật liệt kê như: kỹ thuật sắc ký mỏng (TLC), đo góc quay cực, sắc ký lỏng kết hợp với nhiều loại detector khác [10-12] Trong kỹ thuật sắc ký mỏng đo góc quay cực chủ yếu sử dụng để xác định độ tinh khiết nguyên liệu, không áp dụng cho dạng thành phẩm bán thành phẩm Kỹ thuật sắc ký lỏng với nhiều loại detector khác sử dụng rộng rãi để xác định thành phần thành phẩm bán thành phẩm Các hình thức phát định lượng đa dạng từ phân tích trực tiếp RI [5], ELSD [6], HPAEC [7-9] MS/MS 74 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo [10] đến phân tích gián tiếp PDA FLD [7] Các phương pháp nêu sử dụng hóa chất thiết bị thơng thường để tiến hành phân tích, hầu hết phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Việt Nam Phương pháp HPLC với detector FLD đơn giản có khả ứng dụng rộng trình phân tích cần sử dụng dẫn xuất tạo huỳnh quang, có thêm phần sai số ảnh hưởng hiệu suất dẫn xuất Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần phương pháp cho độ nhạy tốt nhất, đồng thời có triển vọng để phát triển phân tích đồng thời nhiều chất nhóm HMOs trực tiếp phân tích mà khơng cần thêm bước dẫn xuất Nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa trình phân tích 05 chất thuộc nhóm HMOs gồm Glc, Gal, GlcNAc, Fuc Neu5Ac thiết bị LC-MS/MS Trong đó, dung mơi chiết số bước làm khảo sát để loại bỏ tối đa ảnh hưởng mẫu đến q trình phân tích Các điều kiện phân tích tối ưu hóa tự động thiết bị LC-MS/MS để thu liệu mảnh phổ phân tích Phương pháp thẩm định để xác nhận giá trị sử dụng áp dụng thử nghiệm thực tế để phân tích mẫu TPBS thu mua thị trường II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 2.1.1 Thiết bị dụng cụ Thiết bị sử dụng q trình phân tích hệ thống sắc ký lỏng Acquity kết nối với khối phổ tứ cực Xevo TQD hang Waters, Mỹ Cột phân tích mẫu cột XBridge HILIC (3,5 μm, 2,1 mm × 150 mm) chất silica cột BEH Glycan Amide (1,7 μm, 2,1 × 150 mm) Ngồi ra, nghiên cứu cịn sử dụng số thiết bị phụ trợ dụng cụ thơng thường khác phịng thí nghiệm 2.1.2 Hóa chất, chất chuẩn: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm: Chuẩn 2’- fucosyllactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, 3’-sialylactose, 6’-sialylactose Carbosynth với độ tinh khiết ≥ 98,0 % Một số hóa chất khác sử dụng q trình phân tích xứ lý mẫu: Nước cất hai lần khử ion, methanol, chloroform, acetonitri, bột làm C18, bột carbon graphit - Agilent, Mỹ, K4Fe(CN)6.3H2O (tinh khiết phân tích), Zn(CH3COO)2 (tinh khiết phân tích), acid trichloroacetat (tinh khiết phân tích) 2.2 Mẫu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: 25 thực phẩm bổ sung (TPBS) có chứa HMOs lấy ngẫu nhiên thị trường Hà Nội, cụ thể bao gồm 15 mẫu TPBS dạng bột 10 mẫu TPBS dạng lỏng - Lựa chọn mẫu trắng: áp dụng quy trình phân tích lựa chọn tiến hành phân tích số mẫu TPBS không chứa thành phần cung cấp HMOs Chọn mẫu trắng mẫu khơng có tín hiệu trùng với thời gian lưu chất phân tích mẫu chuẩn 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Khảo sát xây dựng quy trình phân tích * Khảo sát tối ưu hóa q trình phân tích khối phổ Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 75 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide - Để tối ưu hóa điều kiện phân tích khối phổ, dung dịch chuẩn 2’-FL, LNT, LNnN, 3’- SL, 6’-SL chuẩn bị nồng độ µg/mLvà tiến hành tối ưu hóa tự động thiết bị Xevo TQD hãng Waters để thu điều kiện mảnh phổ chất phân tích - Đối với trình tách sắc ký, loại cột lựa chọn khảo sát gồm: Cột BEH Glycan Amide (1,7 μm, 2,1 × 150 mm) cột HILIC (3,5 μm, 2,1 × 150 mm) chất silica, dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm chất 2’-FL, LNT, LNnN, 3’- SL, 6’-SL nồng độ µg/mL phân tích với hệ pha động bao gồm kênh A: acid formic 0,1% kênh B: acetonitril * Khảo sát quy trình chiết làm mẫu: Mẫu sau cân với lượng thích hợp (2 – g) vào ống ly tâm 50 mL, thêm chuẩn mức nồng độ µg/mL, bổ sung thêm 40 mL dung môi thuốc thử chiết mẫu; hệ dung môi thuốc thử khảo sát bao gồm: (1) thuốc thử Cazzer, (2) acid trichloroacetat 1% nước, (3) hệ dung môi chloroform : methanol (3:1, v/v), (4) dung môi methanol 100% Sau chiết, mẫu ly tâm định mức vừa đủ 50 mL dịch chiết phân tích LC-MS/ MS để đánh giá độ thu hồi Đối với quy trình làm sạch, sau lựa chọn dung mơi chiết thích hợp, hút xác 1,0 mL dịch chiết khảo sát làm loại bột SPE khác nhau: bột carbon graphit bột C18 Ly tâm 13.000 vịng/phút, lấy phần dịch trong, phân tích LC-MS/MS đánh giá độ thu hổi 2.3.2 Thẩm định phương pháp Phương pháp thẩm định theo yêu cầu AOAC với thông số mẫu TPBS dạng lỏng dạng bột, bao gồm độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát giới hạn định lượng 2.3.3 Phân tích mẫu thực tế Sau q trình khảo sát điều kiện phân tích, quy trình áp dụng để phân tích chất HMOs 25 mẫu TPBS thu thập III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Dựa số tài liệu tham khảo [5-8] tính chất phân cực nhóm HMOs [1], 02 loại cột HILIC cột Amide lựa chọn để khảo sát điều kiện tách sắc ký lỏng chất phân tích Ngồi ra, mẫu TPBS dạng lỏng dạng bột thường chứa hàm lượng lớn protein, lipid, vitamin, khoáng chất, bước chiết làm mẫu trước phân tích LC-MS/MS cần thiết 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký Qua tham khảo tài liệu [7-8], [10] kết hợp với tiến hành khảo sát, điều kiện sắc ký để xác định đồng thời HMOs lựa chọn sau: - Cột HILIC (3,5 μm; 2,1 × 150 mm) cột BEH Glycan amide (1,7 μm; 2,1 mm × 150 mm) trước cột bảo vệ amide BEH (1,7 μm; 2,1 mm × 50 mm) - Pha động: acetonitril: acid formic - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút 76 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo - Thể tích tiêm mẫu: 10 µL - Chương trình gradient (như Bảng 1) Bảng Chương trình gradient phân tích HMOs Thời gian (min) 0,0 2,0 2,5 7,5 8,0 10,0 Kênh A (acid formic 0,1%) 40 40 80 80 40 40 Kênh B (acetonitril) 60 60 20 20 60 60 Kết sắc ký khảo sát khả phân tách chất phân tích sử dụng cột HILIC Amide thể Hình Kết cho thấy, sắc ký đồ tổng (TIC) dung dịch chuẩn phân tích cột HILIC cho thời gian lưu, thời gian phân tích khả tách tốt so với cột amide Validation_std _3 1: MRM of 27 Channels ESTIC 7.85e5 3.83 HILIC % 100 3.62 3.94 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 20201114-std 100 0.86 9.00 MRM of 22 Channels ESTIC 7.91e5 Amide 0.89 % 0.82 0.75 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Hình Sắc ký đồ tổng TIC dung dịch chuẩn hỗn hợp chất 2’-FL, LNT, LNnN, 3’- SL, 6’-SL nồng độ µg/mL 3.2 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Các mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp 05 chất gồm: 2’-FL, LNT, LNnN, 3’- SL, 6’-SL nồng độ µg/mL Sau tiến hành khảo sát điều kiện chiết mẫu sử dụng 04 dung dịch chiết khảo sát gồm: thuốc thử Carrez, dung dịch TCA 1%, methanol, CHCl3: MeOH (3 : 1,v/v) Kết độ thu hồi trình bày Bảng Bảng Kết hiệu suất thu hồi sau quy trình kháo sát dung mơi chiết mẫu  Dung môi 2-FL LNT LNnT 3-SL 6-SL Carrez 84,7% 87,7% 93,9% 94,3% 94,9% TCA 1% 95,5% 93,5% 99,1% 91,0% 92,7% CHCl3 : MeOH 99,0% 98,8% 98,0% 98,8% 99,6% MeOH 88,5% 93,7% 90,1% 99,4% 92,1% Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 77 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide Bảng cho thấy với dung môi hỗn hợp CHCl3 : MeOH (3 : 1,v/v) hiệu suất thu hồi cao nên hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH (3 : 1, v/v) lựa chọn cho bước khảo sát 3.3 Khảo sát điều kiện làm Các dịch chiết mẫu thu sau trình xử lý với hỗn hợp CHCl3: MeOH (3:1, v/v) tiếp tục làm 0,15 g bột C18 0,15 g than hoạt tính để loại bỏ thành phần cịn lại vi khoáng, chất tạo hương, chất tạo màu, Kết thu Hình Hình Kết hiệu suất thu hồi sau trình làm Kết khảo sát Hình cho thấy, sau làm với bột than hoạt tính, hiệu suất thu hồi giảm xuống đồng thời dịch làm màu so với mẫu làm bột C18 Chính thế, bột làm C18 lựa chọn để làm sau trình tách chiết trước tiến hành phân tích thiết bị LC-MS/MS Như vậy, sau bước khảo sát, quy trình phần tích số HMOs (2’-FL, LNT, LNnT, 3’SL, 6’SL) gồm bước sau: cân xác 2-5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL, thêm khoảng 35 mL dung môi chiết CHCl3: MeOH (3:1, v/v), lắc ngang 30 phút; Ly tâm lấy dịch trong, định mức vừa đủ 50 mL; lắc lọc qua giấy lọc thu dịch lọc; hút xác mL dịch lọc vào ống d-SPE chứa sẵn 0,15 g bột làm C18, lắc vortex phút, ly tâm 13.000 vòng/phút phút; thu dịch vào lọ đựng mẫu phân tích thiết bị LC-MS/MS 3.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 3.4.1 Độ đặc hiệu Tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký lựa chọn với mẫu dung dịch chuẩn nồng độ µg/mL, mẫu trắng mẫu trắng có thêm chuẩn Kết thu cho thấy, thời gian lưu 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL mẫu thêm chuẩn giống với mẫu chuẩn, sắc đồ mẫu trắng khơng xuất píc khoảng thời gian lưu chất phân tích mẫu chuẩn Hình Dựa số mảnh mẹ mảnh chất phân tích, số điểm IP thu Bảng 78 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F1:MRM of 27 channels,ES487.16 > 324.982 2.686e+004 2FL 3.65 5485.71 26862.00 100 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 100 % F2:MRM of 10 channels,ES706.223 > 178.902 7.530e+004 LNT 3.59 15576.53 75298.00 % Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F1:MRM of 27 channels,ES487.16 > 204.91 4.074e+004 2FL 3.64 8513.50 40743.00 100 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 LNT 3.59 11758.06 57333.00 100 % F2:MRM of 10 channels,ES706.223 > 112.854 5.733e+004 % 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 100 1.00 F2:MRM of 10 channels,ES706.096 > 178.907 1.030e+005 LNnT 3.59 21212.60 18759.34 9.00 2.00 3.00 5.00 6.00 7.00 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 8.00 9.00 F1:MRM of 27 channels,ES632.057 > 290.002 3.845e+005 3-SL 3.84 79635.72 39718.08 100 % 4.00 % Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F2:MRM of 10 channels,ES706.096 > 381.929 8.371e+004 LNnT 3.59 17151.25 83710.00 100 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 3-SL 3.84 75216.32 3600.87 100 % F1:MRM of 27 channels,ES632.057 > 86.788 3.617e+005 % 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 1.00 2.00 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 F1:MRM of 27 channels,ES632.121 > 289.941 4.983e+005 6-SL 3.84 105255.28 3842.33 100 3.00 % Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F1:MRM of 27 channels,ES632.121 > 86.854 3.315e+005 6-SL 3.84 69730.66 7980.94 100 % 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Hình Một số sắc kí đồ kết đánh giá độ đặc hiệu 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL Bảng Độ đặc hiệu 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL Chất phân tích 2’-FL LNT LNnT 3’-SL 6’-SL Mảnh mẹ Mảnh 487,2 487,2 706,2 706,2 706,9 706,9 632,0 632,0 632,1 632,1 325,0* 205,0 178,9* 112,8 178,9* 381,9 290,0* 86,7 298,9* 86,8 Số điểm IP 4 4 Tỷ lệ ion mẫu thêm chuẩn 0,57 Tỷ lệ ion mẫu chuẩn 0,52 0,82 0,76 0,77 0,75 0,87 0,89 0,90 0,92 Kết Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 79 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide *: Mảnh định lượng a : Tỷ lệ ion = mảnh định tính/ mảnh định lượng 3.4.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Dựa tỷ số tín hiệu/nhiễu dung dịch thêm chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng HMOs thu Bảng Bảng Kết giới hạn phát - Giới hạn định lượng Nền mẫu TPBS dạng bột TPBS dạng lỏng Chất phân tích LOD (mg/kg) LOQ (mg/kg) 2’-FL LNT LNnT 3’-SL 6’SL 2’-FL LNT LNnT 3’-SL 6’SL 4,00 2,00 2,00 2,00 2,00 4,00 2,00 2,00 2,00 2,00 10,0 5,00 5,00 5,00 5,00 10,0 5,00 5,00 5,00 5,00 3.4.3 Độ lặp lại độ tái lập nội Thực phân tích mẫu thực chứa 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL Phân tích lặp lại 06 lần để xác định độ lặp lại 10 lần kiểm nghiệm viên để tính độ tái lập hai kiểm nghiệm viên hai ngày khác Kết phân tích độ tái lập nội phương pháp trình bày Bảng Bảng Kết phân tích độ tái lập nội Chất phân tích Hàm lượng Mức yêu cầu Kết Kết luận 2’-FL 0,1% ≤ 8,0% 2,68 Đạt LNT 100 mg/kg ≤ 6,0% 3,97 Đạt LNnT 100 mg/kg ≤ 6,0% 2,14 Đạt 3’-SL 0,1 % ≤ 8,0% 3,89 Đạt 6’-SL 0,1 % ≤ 8,0% 4,19 Đạt Kết thẩm định cho thấy phương pháp có độ lặp tốt: RSD đạt đáp ứng yêu cầu AOAC [7] 3.4.4 Độ thu hồi Độ thu hồi đánh giá thêm chuẩn 02 mức hàm lượng 0,1 g/100 g (hoặc 0,1 g/100 mL) và 100 mg/kg (100 mg/L) 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL vào mẫu TPBS (dạng bột, dạng lỏng) Kết độ thu hồi tóm tắt Bảng 80 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo Bảng Kết đánh giá độ thu hồi TPBS dạng bột dạng lỏng Nền mẫu Chất phân tích Mức yêu cầu Kết 2’-FL 95 - 105% 98,8 - 102% LNT 95 - 105% 98,2 - 102% 95 - 105% 98,0 - 103% 3’-SL 95 - 105% 97,5 - 103% 6’-SL 95 - 105% 96,8 - 102% 2’-FL 90 - 107% 99,4 - 102% LNT 90 - 107% 97,6 - 102% 90 - 107% 97,8 - 102% 3’-SL 90 - 107% 97,8 - 103% 6’-SL 90 - 107% 96,4 - 102% 2’-FL 95 - 105% 98,0 - 101% LNT 95 - 105% 100 - 102% 95 - 105% 97,0 - 102% 3’-SL 95 - 105% 98,7 - 103% 6’-SL 95 - 105% 96,2 - 102% 2’-FL 90 - 107% 96,9 - 103% LNT 90 - 107% 97,3 - 101% 90 - 107% 97,8 - 103% 3’-SL 90 - 107% 97,9 - 102% 6’-SL 90 - 107% 95,5 - 102% LNnT TPBS dạng bột LNnT LNnT TPBS dạng lỏng Mức hàm lượng thêm chuẩn LNnT 0,1 g/100 g 100 mg/kg 0,1 g/100 mL 100 mg/L Kết thẩm định cho thấy độ thu hồi đạt theo yêu cầu AOAC 3.4.5 Kết phân tích mẫu thực tế Sau thẩm định đạt yêu cầu AOAC, quy trình phân tích áp dụng để phân tích hàm lượng 05 HMOs 25 mẫu bao gồm 15 mẫu TPBS dạng bột 10 mẫu TPBS dạng lỏng Các mẫu lựa chọn mẫu có công bố nhãn chứa thành phần HMOs 2’-FL Kết phân tích trình bày Bảng Bảng Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 81 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide Bảng Kết phân tích 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL mẫu dạng bột Ký hiệu mẫu SB-1 SB-2 SB-3 SB-4 SB-5 SB-6 SB-7 SB-8 SB-9 SB-10 SB-11 SB-12 SB-13 SB-14 SB-15 Hàm lượng Hàm lượng 2’-FL (mg/100g) LNT (mg/100g) 120 115 256 275 162 109 152 147 159 296 243 158 255 201 162 23,0 25,1 14,8 19,8 10,1 36,1 14,9 41,1 22,5 - Hàm lượng LNnT (mg/100g) Hàm lượng 3’SL (mg/100g) Hàm lượng 6’SL (mg/100g) 0,15 0,29 0,95 - 0,85 0,63 0,15 0,54 0,15 - 0,23 0,25 0,62 0,45 0,11 - Ghi chú: “-“: Khơng phát Bảng Kết phân tích 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL mẫu dạng lỏng Ký hiệu mẫu Hàm lượng 2’-FL (mg/L) Hàm lượng LNT (mg/L) Hàm lượng LNnT (mg/L) Hàm lượng 3’SL (mg/L) Hàm lượng 6’SL (mg/L) SL-1 SL-2 SL-3 SL-4 SL-5 SL-6 SL-7 SL-8 SL-9 SL-10 22,1 15,5 21,1 25,7 23,4 19,2 13,8 21,7 29,6 21,5 1,01 1,12 0,98 1,05 - - - - Ghi chú: “-“: Khơng phát Như thấy, thị trường, sản phẩm TPBS có bổ sung HMOs cơng bố nhãn chủ yếu tập trung vào 02 loại HMOs 2’-FL LNT; HMOs 3’-SL 6’-SL không xuất mẫu thực chiếm tỷ lệ nhỏ Tổng hàm lượng HMOs bổ sung vào TPBS dạng bột khoảng 0,1 - 0,3 g/100g, hàm lượng giảm gần 10 lần TPBS dạng lỏng với hàm lượng khoảng 0,01- 0,03 g/100mL Các kết phân tích cho thấy, với sản phẩm có cơng bố thành phần 2’- FL, 82 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo hàm lượng phân tích phù hợp với công bố nhãn sản phẩm, sản phẩm công bố tổng lượng HMOs đạt từ 85% trở lên so với công bố nhãn Tuy nhiên, chưa có mức hàm lượng khuyến cáo chất nhóm HMOs TPBS, việc kiểm sốt chất lượng cịn gặp nhiều khó khăn IV KẾT LUẬN Phương pháp định lượng đồng thời 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL LC-MS/MS mẫu thực phẩm bổ sung xây dựng thẩm định Phương pháp thẩm định độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chụm, độ đúng, độ không đảm bảo đo Kết phân tích thực tế cho thấy hầu hết mẫu phân tích có kết phù hợp với công bố nhãn nhà sản xuất với hàm lượng 05 chất phân tích khoảng 0,1- 0,3 g/100g TPBS dạng bột, 0,01-0,03 g/100mL với TPPBS dạng lỏng Phương pháp xây dựng đạt yêu cầu để áp dụng phân tích hàm lượng 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL thực phẩm bổ sung, tiến hành phân tích phịng thử nghiệm có hệ thống LC-MS/ MS phương pháp thường quy TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] American pregnance association, “Breastfeeding Overview” [Online] Availble: https:// americanpregnancy.org/healthy-pregnancy/breastfeeding/breastfeeding-overviewcopy-70904/ [Aceessed 02/19/2020] [2] M H Monaco, J Kim, and S M Donovan, “Human Milk: Composition and Nutritional Value,” Encyclopedia of Food and Health, vol 2016, pp 357-362, 2016 [3] M Li, “Human milk oligosaccharides shorten rotavirus-induced diarrhea and modulate piglet mucosal immunity and colonic microbiota,” ISME Journal, vol 8, no 8, pp 16091620, 2004 [4] A L Morrow, G M Ruiz-Palacios, X Jiang, and D S Newburg, “Human-milk glycans that inhibit pathogen binding protect breast-feeding infants against infectious diarrhea,” Journal of Nutrition, vol 135, no 5, pp 1304-130, 2005 [5] S S Leeuwen, “Challenges and Pitfalls in Human Milk Oligosaccharide Analysis,” Nutrients, vol 11, no 11, pp 2684, 2019 [6] A S Christensen,  S H Skov, S E Lendal, and B H Hornshoj, “Quantifying the human milk oligosaccharides 2’-fucosyllactose and 3-fucosyllactose in different food applications by high-performance liquid chromatography with refractive index detection,” Journal of Food Science, vol 85, no 2, pp 332-339, 2010 [7] S Austin, D Cuany, J Michaud, B Diehl, and Begoña Casado, “Determination of 2´-Fucosyllactose and Lacto-N-neotetraose in Infant Formula,” Molecules, vol 23, no 10, pp 2650, 2010 [8] S S van Leeuwen, “Challenges and Pitfalls in Human Milk Oligosaccharide Analysis,” Nutrients, vol 11, no 11, pp 2684, 2019 [9] T R I Cataldi, C Campa, and G E De Benedetto, “Carbohydrate analysis by highperformance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection: The potential is still growing,” Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol 368, no 8, pp 739– 758, 2000 [10] Y Bao, C Chen, and D S Newburg, “Quantification of neutral human milk oligosaccharides by graphitic carbon high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry”, Analytical Biochemistry, vol 433, no 1, pp 28–35, 2013 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 83 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide Method validation for simultaneous quantification of some Human Milk Oligosaccharides (HMOs) in dietary supplements by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) Nguyen Thi Hong Ngoc1, Mac Thi Thanh Hoa1, Tran Hung Son1, Ngo Manh Dung2 Cao Cong Khanh1, Vu Thi Thanh An1, Pham Thanh Ha2, Le Thi Hong Hoa1 National Institute for Food Control, Hanoi, Vietnam Hanoi University of Pharmacy, Vietnam Abstract The mobile phase system consists of channels: channel A (0.1% formic acid) and channel B (acetonitril) connected to the HILIC column (3.5 μm, 2.1mm × 150 mm) and the MS detector The time analysis is 10 minutes, this method can identify all substances belonging to the group HMOs The method of simultaneous quantification some of Human Milk Oligosaccharide in dietary supplements by LC-MS/MS is an accurate and effective method to quickly determine the content of 2’-Fucosyllactose (2 ‘-FL), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-tetraose (LNT)3’Siallylactose (3’-SL) and 6’-Siallylactose (6’-SL) in both dietary supplements powder and liquid The method has been validated to be accurate, fast, effective and has been applied to aralyris of samples on the market showing high applicability in fealyti The detection limit and quantitative limit for all 5’-FL, LNnT, LNT, 3’-SL, 6’-SL were mg/kg and 10 mg/kg, respectively The linear range of the method ranges from 0.4 µg/mL to 40 µg/mL Other validation parameters include the accuracy (R% 98.8 -103%); The precision (RSD% 1.69 - 5.54%) can meet the requirement of AOAC The method was applied in practice to analyze 25 supplementary food samples on the market gives the results of analyzing total HMOs in powdered samples about 0.1 - 0.3 g/100g and for liquid samples about 0.01 - 0.03 g/100mL Keywords: 2’-Fucosyllactose (2’-FL), lacto-N-tetraose (LNT), HMOs; dietary supplement, LC-MS/MS 84 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021