Ứng dụng enzyme trong ngành công nghiệp Phân loại protease và subtilisin Protease hay peptidase (EC.3.4 ) là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp (Hình 1.1). Trong hệ thống hệ thống danh pháp MEROPS (www.merops.ac.uk) phân loại protease, subtilisin (EC.3.4.21.62) thuộc phân nhánh SB của nhóm serine protease (EC.3.4.21 ) với điểm đặc trưng là sử dụng đơn phân serine (Ser) nằm trong trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme. Ngoài subtilisin, trong phân nhánh SB còn có các protease liên quan đến quá trình xử lý tiền hormone như KEX2 protease, furin, và PC2. Hiện nay, người ta đã xác định được 97 loại substilisin từ 1659 trình tự trong đó có 16 substilisin đã được xây dựng cấu trúc không gian. Những protease trong họ S8A này đều có một domain bảo thủ với 7 nếp gấp β được bao bọc bởi 9 vòng xoắn α. Trung tâm hoạt động của enzyme này là bộ 3 amino acid truyền thống của serine proease theo thứ tự là Asp-His-Ser (Hình 1.2. Bộ 3 xúc tác Asp-His-Ser đặc trưng của serine protease). Cơ chế xúc tác của subtilisin Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994): · Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử cácbon trong nhóm cácboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl-enzyme, vòng imidazole và một amine (phản ứng khử) (Fastrez and Fersht, 1973). · Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme (Hình 1.2). Một số loại subtilisin Subtilisin là một nhóm enzyme protease kiềm (serine protease) với 2 đại diện được nghiên cứu nhiều nhất là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN''. · Subtilisin Carlsberg. Enzyme này được tìm thấy khi nuôi cấy B. licheniformis vào năm 1947 bởi Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg (Phadarate et al., 1997). Nó được thu lần đầu tiên ở dạng kết tinh vào năm 1952 và từ đó đến nay, subtilisin là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, được sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa. Hoạt tính của enzyme Carlsberg bị kìm hãm bởi các chất phản ứng, 3,4- dichloroisocoumarin (3,4-DCI), L-3-carboxytrans 2,3-epoxypropyl- leucylamido (4-guanidine) butane (E.64), di-isopropylfluorophosphate (DFP), phenylmethyl-sulfonyl fluoride (PMSF) và tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK). Một số khác lại bị kìm hãm bởi thuốc thử thiol ví dụ như p-chloromercuribenzoate (PCMB), đặc trưng đối với tất cả các serine protease (Govind et al., 1981). Subtilisin Carlsberg có tính đặc hiệu rộng, thủy phân nhiều loại liên kết peptide cũng như các liên kết ester, nhất là những liên kết được tạo thành từ các amino acid thơm. Dưới tác dụng của enzyme này, một số triglyceride cũng có thể bị thủy phân như tripropionin và tributyrin. Subtilisin Carlsberg thủy phân từ 30 đến 40% liên kết peptide của casein. Giống như các serine protease khác, Ca2+ không ảnh hưởng đến độ bền của enzyme này, có pH tối ưu là 8,0-9,0 và bền trong phạm vi pH rộng từ 5,0 đến 11,0 (Zuidweg et al., 1972). · Subtilisin BPN''. Enzyme này đã được làm sạch và thu được ở trạng thái kết tinh từ chế phẩm công nghiệp BPN'' (bacterial protease Nagase). Từ chế phẩm BP Novo (bacterial protease Novo) đã tách được enzyme có thành phần amino acid tương tự subtilisin Novo (Forgarty, 1983). Subtilisin BPN'' được tổng hợp từ các loài B. amyloliquefaciens, B. subtilis và B. stearothermophilus (Zuidweg et al., 1972). Subtilisin BPN'' và subtilisin Carlberg khác nhau 58 amino acid nhưng C và pH 10 (Smith et al.,°chúng hoạt động tối ưu ở cùng một điều kiện là 60 1968; Phadarate et al., 1997; Siezen and Leunissen, 1997). Khác với subtilisin Carlberg độ bền của subtilisin BPN'' lại phụ thuộc vào Ca2+. Subtilisin BPN'' còn là một enzyme ngoại bào nên có thể dễ dàng thu hồi và tinh sạch hơn các enzyme nội bào, do vậy việc ứng dụng enzyme này ngày một phổ biến . Ứng dụng enzyme trong ngành công nghiệp Phân loại protease và subtilisin Protease hay peptidase (EC.3.4 ) là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong. là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, được sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa. Hoạt tính của enzyme Carlsberg bị kìm hãm bởi các chất phản ứng, 3,4- dichloroisocoumarin. protease (EC.3.4.21 ) với điểm đặc trưng là sử dụng đơn phân serine (Ser) nằm trong trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme. Ngoài subtilisin, trong phân nhánh SB còn có các protease liên quan