BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ận Lu n vă Hồ Trường Giang ạc th sỹ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN MỘT SỐ EXON CỦA GEN DJ-1 TRÊN NGƯỜI BỆNH PARKINSON nh Si LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC c họ Hà Nội, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ận Lu n vă Hồ Trường Giang ạc th sỹ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN MỘT SỐ EXON CỦA GEN DJ-1 TRÊN NGƯỜI BỆNH PARKINSON nh Si Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm họ Mã số: 8420114 c LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Võ Thị Bích Thủy Hà Nội, 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học PGS TS Võ Thị Bích Thủy Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2020 ận Lu n vă th ạc HỒ TRƯỜNG GIANG sỹ nh Si c họ LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tơi thực Phịng Hệ gen học Vi sinh – Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo điều kiện để công việc chuyên môn đề tài tiến hành thuận lợi ận Lu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Võ Thị Bích Thủy, người đã tận tình hướng dẫn tơi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn góp ý, dẫn, chia sẻ kinh nghiệm cán nghiên cứu thuộc phòng Hệ gen học Vi sinh thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ nhiều q trình thực nghiên cứu, điều khiến tơi thực cảm kích biết ơn n vă ạc th Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô thuộc Khoa Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy, truyền thụ kiến thức để tơi hồn thành khóa học nghiên cứu sỹ nh Si Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình người thân đã ln bên tơi, động lực để tơi vượt qua khó khăn để hoàn thành nghiên cứu c họ Hà Nội, ngày tháng năm 2020 HỒ TRƯỜNG GIANG MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 Lu 1.1 BỆNH PARKINSON 11 ận 1.1.1 Khái niệm 11 vă 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh 11 n th 1.1.3 Nguyên nhân và các yếu tố nguy 18 ạc 1.1.4 Một số đặc điểm lâm sàng bệnh Parkinson 20 sỹ 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN BỆNH PARKINSON 21 nh Si 1.2.1 Tình hình nghiên cứu thế giới 21 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 24 họ c 1.3 CƠ SỞ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH PARKINSON 25 1.3.1 Vai trò của số gen bệnh Parkinson 25 1.3.2 Cấu trúc, chức và chế hoạt động của gen DJ-1 26 1.3.3 Vai trò gen DJ-1 bảo vệ chớng oxy hóa tế bào thần kinh 29 1.3.4 Tương tác của DJ-1 ty thể 30 1.3.5 Sự thiếu hụt gen DJ-1 32 1.3.6 Đột biến gen DJ-1 bệnh Parkinson 32 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng mẫu nghiên cứu 33 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 33 2.1.3 Thiết kế nghiên cứu 34 2.1.4 Sơ đồ nghiên cứu 34 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 35 Lu 2.2.1 Hóa chất 35 ận 2.2.2 Thiết bị 35 vă 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 n 2.3.1 Thu thập đối tượng nghiên cứu 35 th ạc 2.3.2 Thu thập và bảo quản mẫu 36 2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 37 sỹ Si 2.3.4 Xác định độ tinh và hàm lượng DNA tổng số 38 nh 2.3.5 Thiết kế mồi 39 họ 2.3.6 Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR 40 c 2.3.7 Giải trình tự DNA 41 2.3.8 Phân tích số liệu 45 2.3.9 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 45 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 46 3.1.1 Phân bố bệnh nhân Parkinson theo độ tuổi và giới tính 46 3.1.2 Phân bố bệnh nhân theo thời gian mắc bệnh và giai đoạn bệnh 48 3.2 KHUẾCH ĐẠI VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC EXON TRONG GEN DJ-1 49 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 49 3.2.2 Khuếch đại exon gen DJ-1 50 3.2.3 Xác định trình tự các đoạn exon gen DJ-1 53 3.3 PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN DJ-1 54 3.3.1 Kết xác định các đột biến exon gen DJ-1 57 3.3.2 Kết xác định các đột biến exon gen DJ-1 59 Lu 3.3.3 Đột biến intron intron của gen DJ-1 61 ận 3.4 ĐỐI CHIẾU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG ĐIỂN HÌNH TRÊN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU………………………………………………63 vă n CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 th 4.1 KẾT LUẬN 66 ạc 4.1.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 66 sỹ nh Si 4.1.2 Phân tích và đánh giá các đột biến gen DJ-1 và đối chiếu lâm sàng bệnh nhân Parkinson 66 4.2 KIẾN NGHỊ 67 họ TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 c PHỤ LỤC 78 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Ammonium persulphate ATP Adenosine triphosphate Bcl-xL B-cell lymphoma-extra large U lympho tế bào B cực lớn BLB blood lysis buffer Dung dịch đệm phân giải tế bào máu ận Lu APS Cặp bazơ nitơ base pair CMA Chaperone-mediated autophagy DA Dopamine DNA Deoxyribonucleic Acid Acid deoxyribonucleic dNTP deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphotphat EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid GSH Glutathione Kb Kilobase Kilobazơ LAMP2A Lysosomal associated membrane protein 2A Lysosome liên kết màng protein 2A NF-kB Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B vă bp n Tự thực bào qua trung gian chaperone ạc th sỹ nh Si c PCR họ NST Nhiễm sắc thể Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraza nhờ PD Parkinson disease Bệnh Parkinson RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic RNase Ribonuclease Ribonuclease ROS Reaction oxidative species Các chất có tính oxy hóa SNc Substantia Nigra pars compacta Phần đặc liềm đen TAE Tris – acetic acid – EDTA TE Tris – EDTA VTA Ventral tegmental area Lu UCP Vùng trần trung não Uncoupling protein Protein không ghép cặp ận n vă ạc th sỹ nh Si c họ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các gen chính và loci liên quan đến bệnh Parkinson Bảng 2.1 Trình tự mồi tương ứng của exon 2, 3, 4, 5, 6, gen DJ-1 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng PCR Bảng 2.3 Thành phần phản ứng giải trình tự Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo độ tuổi giới tính Bảng 3.2 Phân bớ bệnh nhân theo thời gian mắc bệnh và giai đoạn bệnh Lu Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của exon 2, 3, 4, 5, 6, gen DJ-1 ận Bảng 3.4 Thông tin bệnh nhân và các đột biến gen DJ-1 n vă Bảng 3.5 Các đột biến xác định exon của gen DJ-1 th Bảng 3.6 Một số triệu chứng lâm sàng của nhóm bệnh nhân Parkinson ạc Bảng 3.7 Đối chiếu số đặc điểm lâm sàng nhóm bệnh nhân có đột biến gen DJ-1 sỹ nh Si c họ L u ậ n v ă n t h c sỹ S i n h h ọ c Lu ận n vă ạc th sỹ nh Si c họ L u ậ n v ă n t h c sỹ S i n h h ọ c Lu ận n vă ạc th sỹ nh Si c họ L u ậ n v ă n t h c sỹ S i n h h ọ c Lu ận n vă ạc th sỹ nh Si c họ L u ậ n v ă n t h c sỹ S i n h h ọ c Lu ận n vă ạc th sỹ nh Si c họ L u ậ n v ă n t h c sỹ S i n h h ọ c Lu ận n vă ạc th sỹ nh Si c họ L u ậ n v ă n t h c sỹ S i n h h ọ c Lu ận n vă ạc th sỹ nh Si c họ L u ậ n v ă n t h c sỹ S i n h h ọ c VIỆN HÀN LÂM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ BẢN GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THEO KẾT QUẢ CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ ận Lu Học tên học viên: Hồ Trường Giang Tên luận văn: "Nghiên cứu đột biến số exon gen DJ-1 người bệnh Parkinson” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 42 01 14 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Võ Thị Bích Thủy Ngày bảo vệ luận văn: 7/10/2020 Căn biên họp hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ, học viên chỉnh sửa luận văn sau: n vă ạc th Nội dung đề nghị bổ sung, chỉnh sửa Nội dung bổ sung, chỉnh sửa sỹ STT Si nh Đã sửa nội dung tổng quan Tính logic tổng quan Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang chọn mẫu thuận tiện Mục tiêu cần thu hẹp Mục tiêu 2: Đánh giá mối liên quan đột biến xác định với số biểu lâm sàng điển hình người bệnh Parkinson Danh mục viết tắt chưa thống Bổ sung thích số bảng biểu Đã sửa bổ sung bảng 3.1 3.2 c họ Đã sửa Bổ sung thành phần đệm Phương pháp tách chiết DNA tổng số Đã bổ sung proteinase K 1U Thu gọn Phương pháp giải trình tự Đã sửa thu gọn Phương pháp viết thành đoạn văn Đã sửa thành đoạn văn 10 Kết luận viết gọn lại Đã sửa 11 Thống trích dẫn TLTK Đã sửa 12 Lỗi tả ận Lu Việt hóa hình vă Các hình luận văn trích xuất từ nguồn gốc xác định, giữ nguyên nội dung giải thích nội dung luận văn n ạc th Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2020 sỹ CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Đã sửa NGƯỜI HƯỚNG DẪN nh Si c họ XÁC NHẬN CỦA CƠ SỞ ĐÀO TẠO HỌC VIÊN