Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 1 MỤC LỤC BÀI Trang BÀI 1. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG 2 BÀI 2. NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG PHẢN ỨNG PCR 7 BÀI 3. TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ 10 BÀI 4. PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG, CẮT GIỚI HẠN VÀ ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 13 BÀI 5. THU NHẬN DNA/PLASMID TINH SẠCH TỪ BỘ KIT TINH CHẾ DNA 18 BÀI 6. NỐI DNA VÀO PLASMID 20 BÀI 7. BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ E. coli 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 2 BÀI MỞ ĐẦU NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM & GIỚI THIỆU MÔN HỌC I. Những quy định chung 1. Những ngƣời không có nhiệm vụ không đƣợc vào phòng thí nghiệm 2. Vật dụng cá nhân để đúng nơi quy định 3. Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse, đeo khẩu trang, mang găng tay, cột tóc gọn gàng. 4. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm. 5. Không sử dụng trang thiết bị trong phòng thí nghệm khi chƣa đƣợc hƣớng dẫn cụ thể. 6. Không đƣợc mang hoá chất, dụng cụ khi chƣa đƣợc sự đồng ý của trƣởng phòng thí nghiệm. 7. Khi rời phòng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nƣớc, khóa cửa. II. Quy định an toàn An toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong phòng thí nghiệm. Đặc biệt đối với phòng thí nghiệm sinh học phân tử và thao tác trên gen, sinh viên cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy tắc an toàn do thƣờng xuyên phải tiếp xúc với hóa chất độc hại để đảm bảo an toàn cho bản thân và những ngƣời xung quanh. Sau đây là một số quy tắc: - Đọc kỹ tài liệu thực tập và nắm vững nguyên tắc, vật liệu, phƣơng pháp thực hành trƣớc khi vào phòng thí nghiệm. - Chỉ mang những dụng cụ tối thiểu cần cho thực tập (tài liệu, tập ghi, bút) vào chỗ làm. Tất cả vật dụng khác cần để ở vị trí riêng biệt. - Trƣớc khi bắt đầu thực tập, cần lau sạch mặt bàn với cồn 70%. - Đối với các hóa chất sử dụng trong thực tập, cần xem rõ tên hóa chất trƣớc khi dùng. Trƣờng hợp không rõ, sinh viên cần hỏi cán bộ hƣớng dẫn. Không tự ý làm thử để tìm hiểu. - Phenol, chloroform là các hóa chất nguy hiểm, có khả năng gây bỏng. Vì vậy, khi thao tác với các hóa chất này, sinh viên tuyệt đối cẩn thận, không để tiếp xúc trực tiếp với da, đặc biệt là mắt. trƣờng hợp bị dây vào da, cần rửa ngay dƣới vòi nƣớc. Trƣờng hợp nặng hơn, sinh viên phải báo ngay với cán bộ hƣớng dẫn thực tập. Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 3 - Ethidium bromide là một chất độc, có khả năng gây ung thƣ. Khi thao tác với hóa chất này, sinh viên phải mang bao tay và thao tác cực kỳ cẩn thận. Không để vƣơng vãi dung dịch ethidium bromide xung quanh vị trí làm việc. Đầu típ hút ethidium bromide, bản gel sau khi điện di và dung dịch hút bỏ trong quá trình thí nghiệm phải bỏ đúng nơi quy định, không vứt bỏ lung tung. - Trƣờng hợp lỡ tay làm đổ hóa chất lên bàn thực tập phải lau ngay tránh để ngƣời khác sơ ý đụng phải. - Lắng nghe và thực hiện nghiêm túc các hƣớng dẫn của cán bộ phụ trách thực tập trong việc dùng hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị thí nghiệm. Trƣờng hợp xảy ra tai nạn, sự cố, cần báo ngay với cán bô phụ trách thực tập để có biện pháp xử lý thích hợp. - Trƣớc khi rời phòng thí nghiệm phải rửa sạch tay. III. Giới thiệu môn học Môn học thực tập sinh học phân tử giúp sinh viên làm quen với các kỹ thuật cơ bản của công nghệ gen thông qua đó nắm vững, hiểu rõ hơn các khái niệm, kiến thức của công nghệ gen và có thể bƣớc đầu tiến hành các thí nghiệm về thao tác trên gen. 3.1. Nội dung Bài 1. Các khái niệm cơ bản về tạo dòng Bài 2. Nhân bản sao DNA/gen mục tiêu bằng phản ứng PCR Bài 3. Tách chiết plasmid từ tế bào chủ Bài 4. Phân tích plasmid bằng các phƣơng pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di trên gel agarose Bài 5. Thu nhận DNA/plasmid tinh sạch từ bộ kit tinh chế DNA Bài 6. Nối DNA vào plasmid Bài 7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ E. coli 3.2. Phƣơng pháp dạy và học - Bài học đƣợc tiến hành dƣới hình thức bài giảng và thao tác thực hành. Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 4 3.3. Phƣơng pháp đánh giá Nội dung các bài thực tập có liên quan với nhau, các kết quả thu đƣợc của bài thực tập trƣớc đƣợc dùng làm nguyên liệu để thực hiện các bài tiếp theo. Vì thế cần lƣu ý bảo quản kết quả của bài thực tập trƣớc để sử dụng cho bài sau. TT Nội dung đánh giá Tổng số Ghi chú 1 Chuyên cần (Đ1) 0.1 2 Kỹ năng thực hành (Đ2) 0.3 3 Viết báo cáo (Đ3) 0.3 4 Kiểm tra kết thúc môn (Đ4) 0.3 Điểm môn học = (Đ1 x 0.1) + (Đ2 x 0.3) + (Đ3 x 0.3) + (Đ4 x 0.3) IV. Phân công trực vệ sinh - Dọn dẹp bàn ghế - Sắp xếp đồ đạc - Đổ rác Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 5 BÀI 1. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau: - Khái niệm về tạo dòng - Ứng dụng của việc tạo dòng trong Sinh học phân tử - Các bƣớc cơ bản của tạo dòng - Khái niệm về tái tạo dòng (subcloning) - Khái niệm chung về vector và chủng chủ - Một số enzyme dùng trong tạo dòng Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau: - Sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ chuyên dụng trong sinh học phân tử - Cẩn thận, khéo léo và khả năng tập trung cao độ trong các thao tác sinh học phân tử đồng thời có khả năng tƣ duy cao - Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu Số tiết lên lớp: 10 tiết Bảng phân chia thời lƣợng TT NỘI DUNG SỐ TIẾT 1 Cơ sở lý thuyết 3 2 Nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ cho thí nghiệm sinh học phân tử 2 3 Thiết lập quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu vào tế bào chủ E. coli 5 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 6 Trọng tâm bài giảng - Mục đích của việc dòng hóa gen mục tiêu vào tế bào chủ E. coli - Vector và đặc điểm của vector - Nội dung của quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu vào tế bào chủ E. coli - Cách sử dụng các máy, dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong sinh học phân tử Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1], [2] 1.1. Tạo dòng và tái tạo dòng 1.2. Vector và chủng chủ 1.3. Các enzyme dùng trong tạo dòng 1.4. Cách thức sử dụng eppendorf, pipetman, máy điện di DNA, Đèn UV, máy ly tâm, bộ kit tinh sạch dành cho DNA, dung dịch, thuốc thử chuyên dụng trong sinh học phân tử. BÁO CÁO Viết báo cáo quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu vào tế bào chủ E. coli Câu hỏi 1. Tạo dòng là gì? 2. Mục đích của việc tạo dòng? 3. Các bƣớc cơ bản của quy trình tạo dòng 4. Vector là gì? 5. Ứng dụng của vector trong việc tạo dòng gen mục tiêu 6. Chủng chủ là gì? 7. Đặc điểm của chủng chủ 8. Vi khuẩn E. coli và ứng dụng của nó trong công nghệ gen 9. Enzyme cắt giới hạn (RE) là gi? 10. Ứng dụng của RE trong dòng hóa gen quan tâm vào vector 11. Polymerase, Ligase, Nuclease và ứng dụng của nó trong sinh học phân tử Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 7 BÀI 2. NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG PHẢN ỨNG PCR MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau: - Mục đích của việc PCR trong sinh học phân tử - Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR - Các thành phần phản ứng PCR Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau: - Sử dụng máy PCR - Thiết lập phản ứng PCR để thu nhận DNA/gen mục tiêu làm nguyên liệu cho quy trình tạo dòng - Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu Số tiết lên lớp: 5 tiết Bảng phân chia thời lƣợng TT NỘI DUNG SỐ TIẾT 1 Cơ sở lý thuyết 2 2 Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ 0.5 3 Các bƣớc tiến hành 2.5 Trọng tâm bài thực hành - Thực hiện các bƣớc trong quy trình nhân bản DNA/gen mục tiêu bằng phản ứng PCR - Giải thích đƣợc cơ chế trong phản ứng PCR - Thành phần của phản ứng PCR I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1] 1.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 8 1.2. Các thành phần phản ứng PCR 1.3. Ứng dụng của PCR II. Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ - DNA bộ gen - 1 eppendorf 0.5 ml vô trùng và giá để eppendorf - 1 eppendorf chứa mồi xuôi - 1 eppendorf chứa mồi ngƣợc - 1 eppendorf chứa dung dịch đệm cho phản ứng PCR - 1 eppendorf chứa dung dịch dNTP - 1 eppendorf chứa enzyme Taq DNA polymerase (luôn đƣợc giữ trong chậu nƣớc đá trong khi thao tác) - 1 eppendorf nƣớc cất hai lần vô trùng - Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip - 1 máy PCR III. Thực hành Sinh viên tiến hành hút lần lƣợt các thành phần phản ứng PCR vào eppendorf 0.5ml theo thứ tự và thể tích nhƣ sau: dH 2 O 16.5ul DNA bộ gen 2.0ul Buffer (10X) 2.5ul dNTP (10X) 2.5ul Mồi xuôi 0.5ul Mồi ngƣợc 0.5ul Taq polymerase 0.5ul Tổng thể tích phản ứng 25ul Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 9 Đặt eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng PCR vào máy PCR với chƣơng trình PCR nhƣ sau: 94 o C 94 o C 72 o C 72 o C 5’ 1’ 55 o C 1’ 10’ 1’ x 30 chu kỳ 4 o C ∞ BÁO CÁO Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về thiết lập phản ứng PCR, giải thích và kết quả thí nghiệm. Câu hỏi: 1. Phản ứng PCR là gì? 2. Mục đích của PCR trong bài thực hành? 3. Thành phần có trong phản ứng PCR 4. Cách thiết lập phản ứng PCR Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 10 BÀI 3. TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau: - Khái niệm cơ bản về plasmid - Quy trình tách chiết plasmid - Ứng dụng của plasmid trong việc sử dụng làm vector Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau: - Thu nhận plasmid tinh sạch làm nguyên liệu cho quy trình tạo dòng - Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu Số tiết lên lớp: 5 tiết Bảng phân chia thời lƣợng TT NỘI DUNG SỐ TIẾT 1 Cơ sở lý thuyết 1.75 2 Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ 0.25 3 Các bƣớc tiến hành 3 Trọng tâm bài thực hành - Nguyên tắc tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS-kiềm - Giải thích đƣợc các thành phần dùng để tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS-kiềm I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1] [3] 1.1. Plasmid và đặc điểm sinh học của nó 1.2. Phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ 1.3. Nguyên tắc tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS-kiềm II. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị - 1 ống nghiệm chứa 5 ml dịch nuôi cấy thể biến nạp E. coli [...]... hành để kịp thời xử lý Trang 11 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử BÁO CÁO Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về các bƣớc tách chiết plasmid, giải thích và kết quả thí nghiệm Câu hỏi: 1 Plasmid là gì? 2 Mục đích của việc tách chiết plasmid? 3 Giải thích các bƣớc của quá trình tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS- kiềm Trang 12 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử BÀI 4 PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƢƠNG... 5 tiết Bảng phân chia thời lƣợng TT NỘI DUNG SỐ TIẾT 1 Cơ sở lý thuyết 2 2 Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ 0.25 3 Các bƣớc tiến hành 1.75 4 Nhận xét kết quả thí nghiệm 1 Trọng tâm bài thực hành - Biến nạp và ứng dụng của quy trình này trong thao tác sinh học phân tử - Nắm vững các bƣớc của quy trình biến nạp plasmid vào tế bào E coli Trang 22 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử I Cơ sở... bào chủ E coli thích hợp BÁO CÁO Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về quy trình và thành phần của phản ứng nối gen vào plasmid Câu hỏi: 1 Mục đích của việc nối gen mục tiêu vào plasmid 2 Nguyên tắc và thành phần của phản ứng nối gen mục tiêu vào plasmid Trang 21 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử BÀI 7 BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ E coli MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả... kết quả thí nghiệm và xem xét mẫu DNA/plasmid sau khi tinh sạch có sạch không? Nồng độ của mẫu thu đƣợc nhƣ thế nào? Câu hỏi: 1 Quy trình tinh sạch mẫu DNA gồm các bƣớc nào? Chi tiết của từng bƣớc? 2 Mẫu sau khi tinh sạch cần có đặc điểm gì? Trang 19 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử BÀI 6 NỐI GEN MỤC TIÊU VÀO PLASMID MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: Về kiến thức: Sinh viên... Tiến hành đồng thời với mẫu đối chứng không cho plasmid BÁO CÁO Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về thành phần cũng nhƣ quy trình biến nạp plasmid vào tế bào chủ E coli Trang 23 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Câu hỏi: 1 Biến nạp là gì? 2 Tại sao quá trình biến nạp lại quan trọng trong thao tác sinh học phân tử vi sinh vật? 3 Nguyên tắc của biến nạp 4 Các bƣớc thực hiện quy trình biến nạp 5 Tế bào... Bảng phân chia thời lƣợng TT NỘI DUNG SỐ TIẾT 1 Cơ sở lý thuyết 4 2 Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ 1.5 3 Các bƣớc tiến hành 3 4 Nhận xét kết quả thí nghiệm 1,5 Trang 13 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trọng tâm bài thực hành - Nắm vững phân tích mẫu plasmid bằng các phƣơng pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di trên gel agarose I Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1] 1.1 Phân. .. trong bài thực hành 5 Gel agarose là gì? Đọc kết quả điện di trên bảng điện di gel agarose là nhƣ thế nào? Trang 17 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Bài 5 Thu nhận DNA/plasmid tinh sạch từ bộ kit tinh chế DNA MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau: - Hiểu biết quy trình tinh sạch sản phẩm DNA/plasmid... 15 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Dung dịch đệm (10X) 1ul Enzyme cắt giới hạn 0.5ul Nƣớc cất bổ sung sao cho tổng thể tích phản ứng là 10ul  Ủ hỗn hợp phản ứng này ở 37oC trong 2 giờ hoặc qua đêm II.3 Phân tích sản phẩm cắt giới hạn của plasmid bằng điện di gel agarose a Vật liệu, dụng cụ, thiết bị - Sản phẩm PCR của bài 1; Dung dịch plasmid đã tách chiết của bài 2; Sản phẩm cắt giới hạn của bài. .. dụng cụ 0.25 3 Các bƣớc tiến hành 1.75 4 Nhận xét kết quả thí nghiệm 1 Trọng tâm bài thực hành - Nắm vững các bƣớc của quy trình thiết lập phản ứng nối gen mục tiêu vào plasmid I Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1] 1.1 Mục đích của việc nối gen mục tiêu vào plasmid 1.2 Nguyên tắc của phản ứng nối Trang 20 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử II Yêu cầu nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị: - 1 eppedorf... chọn chƣơng trình đo thích hợp theo hƣớng dẫn của cán bộ - Rửa sạch buồng đo, điều chỉnh blank - Nạp 10ul mẫu vào buồng đo Nhấn nút DNA để đo nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch DNA - Ghi nhận kết quả và rút ra kết luận II.2 Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp cắt giới hạn a Vật liệu, dụng cụ, thiết bị Trang 14 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử - Dung dịch DNA plasmid thu đƣợc ở bài 2 - 1 eppedorf . của nó trong sinh học phân tử Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 7 BÀI 2. NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG PHẢN ỨNG PCR MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có. pháp dạy và học - Bài học đƣợc tiến hành dƣới hình thức bài giảng và thao tác thực hành. Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 4 3.3. Phƣơng pháp đánh giá Nội dung các bài thực tập. Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trang 10 BÀI 3. TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: Về kiến thức: Sinh viên có