Đang tải... (xem toàn văn)
Chăn nuôi gà là nghề sản xuất truyền thống lâu đời và chiếm vị trí quan trọng thứ hai sau chăn nuôi lợn trong ngành chăn nuôi của Việt Nam, hằng năm cung cấp khoảng 350 450 nghìn tấn thịt và hơn 2,5 3,5 tỷ quả trứng. Tuy nhiên, chăn nuôi gà ở nuớc ta vẫn còn trong tình trạng sản xuất nhỏ, phân tán, năng suất thấp, dịch bệnh nhiều, sản phẩm hàng hoá còn nhỏ. Bình quân sản lượng thịt xẻ, trứng chỉ đạt 4,5 5,4 kgnguờinăm và 35 trứng nguời năm. Trong vài thập kỷ qua, mặc dù công tác chọn giống đã cải thiện một cách đáng kể thành tích sản xuất chăn nuôi gà như tăng trưởng nhanh, hiệu quả sử dụng thức ăn cao, khả năng sản xuất thịt tốt, tỷ lệ thịt ngực cao hơn nhưng sự tăng nhanh về năng suất sản xuất đã đi cùng với việc tăng dịch bệnh, dẫn đến gà bị mắc nhiều bệnh về rối loạn chuyển hóa và mắc nhiều bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ chết cao. Trong đó có thể kể đến bệnh Gumboro do một lọai virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1, chúng có khả năng phá huỷ túi Fabracius, do đó làm giảm khả năng miễn dịch của gà. Nhiều báo cáo khoa học đã cho biết gà ở giai đọan từ 1 12 tuần tuổi, nhất là ở giai đọan 3 6 tuần tuổi đều có khả năng mắc bệnh. Gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi mắc bệnh không biểu hiện triệu chứng nhưng sẽ làm gà suy giảm miễn dịch. Tỷ lệ mắc bệnh là 100%, tỷ lệ chết từ 10 – 50% hoặc cao hơn nếu kết hợp với các bệnh khác. Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kỳ phương thuốc nào mà chỉ có thể khắc phục bằng biện pháp phòng trừ. Vì vậy thiệt hại do bệnh Gumboro gây ra là rất đáng kể đối với chăn nuôi gà của các nước lớn trên thế giới nói chung và của Việt Nam nói riêng. Cùng với sự phát triền vượt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh ngày nay có thể giúp ta chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh do virus. Khởi phát từ các vấn đề nêu trên, được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm KIT chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro trên đàn gà nuôi tại Thái Nguyên”
i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp trước hết em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể thầy giáo Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên truyền đạt cho em kiến thức quý báu bổ ích suốt năm học vừa qua Em xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới Thầy giáo GS.TS Nguyễn Quang Tuyên, ThS Đỗ Bích Duệ tận tình giúp đỡ hướng dẫn em suốt q trình thực tập để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn tới thầy, cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y Đặc biệt thầy, cô giáo công tác Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh - Viện Khoa học sống - Đại học Thái Ngun giúp đỡ em hồn thành khóa luận thực tập tốt nghiệp Trong trình thực tập chưa có nhiều kinh nghiệm thực tế, dựa vào kiến thức học với thời gian hạn hẹp nên khóa luận khơng tránh khỏi sai sót Kính mong góp ý nhận xét quý thầy để giúp em kiến thức hồn thiện khóa luận có nhiều kinh nghiệm bổ ích cho cơng việc sau Em xin chân thành cảm ơn Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Kiều Trang ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Xác định hiệu giá huyết nồng độ kháng nguyên tối ưu cho phản ứng ELISA (S/N) 45 Bảng 4.2 Kết OD phản ứng ELISA thời điểm ủ huyết khác 46 Bảng 4.3 Kết OD phản ứng ELISA thời điểm ủ anti-bovine IgG:HRPO khác 47 Bảng 4.4 Giá trị OD nồng độ kháng thể khác 49 Bảng 4.5 Kết thực đĩa ELISA với thời gian rửa kháng thể khác 50 Bảng: 4.6 Kết thực phản ứng ELISA với thời gian ủ conjugate khác 51 Bảng: 4.7 Kết thực đĩa ELISA với thời gian rửa kháng thể khác .53 Bảng 4.8 Kết phản ứng ELISA để xác định độ nhạy đặc hiệu 54 Bảng 4.9 Kết xác định mức độ lặp lại kết phản ứng ELISA 54 Bảng 4.10 Kết ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến độ nhạy đặc hiệu KIT ELISA (%) 57 iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Hình thái virus Gumboro .4 Hình 2.2: Cấu trúc phân tử virus Gumboro .4 Hình 2.3: Hệ gen virus Gumboro Hình 2.4: Biểu gà bị nhiễm virus Gumboro 11 Hình 2.5: Túi Fabicius nang lympho 14 Hình 2.6: Xuất huyết ngực, đùi 15 Hình 2.7 : Xuất huyết dày tuyến dày 16 Hình 2.8: Bệnh tích phơi gà 20 Hình 2.9: Hình ảnh minh họa cho phản ứng ELISA .26 Hình 3.1 Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA xác định hiệu giá kháng thể 40 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định thời gian ủ conjugate .41 Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định thời gian rửa kháng thể phù hợp để chẩn đoán bệnh Gumboro KIT ELISA chế tạo 41 Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian rửa conjugate phù hợp để chẩn đoán bệnh Gumboro KIT ELISA chế tạo 42 Hình 4.1 Kết OD phản ứng ELISA thời điểm ủ huyết khác 47 Hình 4.2 Kết OD phản ứng ELISA thời điểm ủ anti-bovine IgG:HRPO khác 48 Hình 4.3 Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể 49 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ab : Antibody Ag : Antigen CAM : chorioallantic mem brance Cs : Cộng EIA : Enzyme Immuno Assay ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Gs : Group Specific IB : Infecttious Brochitis IBDV : Infectious bursal disease virus Nxb : Nhà xuất ORF : overlapping open reading frame PCR : polymerase Chain Reaction RdRp : RNA dependent RNA polymerase RIA : Radio Immuno Assay Se : Sensitivity Sp : Specificity Ts : Type-Secific VP : Viral Protein v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .iv MỤC LỤC v PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .2 PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .3 2.1 Cơ sở khoa học 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 30 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 30 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 32 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .35 3.1 Đối tượng nghiên cứu 35 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 35 3.2.1 Địa điểm tiến hành 35 3.2.2 Thời gian tiến hành 35 3.3 Nội dung nghiên cứu 35 3.4 Phương pháp nghiên cứu tiêu theo dõi .35 3.4.1 Nguyên liệu 35 vi 3.4.2 Thiết bị hóa chất 35 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu 36 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 44 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Kết xác định điều kiện sản xuất KIT chẩn đoán huyết học từ kháng nguyên Gumboro 45 4.1.1 Xác định hàm lượng kháng ngun độ pha lỗng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA 45 4.1.2 Kết xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu virus Gumboro anti-bovine IgG: HRPO 46 4.1.3 Xác định độ pha loãng kháng thể phù hợp để chẩn đoán bệnh Gumboro KIT ELISA chế tạo 48 4.1.4 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng ELISA 53 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Tồn 59 5.3 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Chăn nuôi gà nghề sản xuất truyền thống lâu đời chiếm vị trí quan trọng thứ hai sau chăn nuôi lợn ngành chăn nuôi Việt Nam, năm cung cấp khoảng 350 - 450 nghìn thịt 2,5 - 3,5 tỷ trứng Tuy nhiên, chăn ni gà nuớc ta cịn tình trạng sản xuất nhỏ, phân tán, suất thấp, dịch bệnh nhiều, sản phẩm hàng hố cịn nhỏ Bình qn sản lượng thịt xẻ, trứng đạt 4,5 - 5,4 kg/nguời/năm 35 trứng/ nguời/ năm Trong vài thập kỷ qua, công tác chọn giống cải thiện cách đáng kể thành tích sản xuất chăn ni gà tăng trưởng nhanh, hiệu sử dụng thức ăn cao, khả sản xuất thịt tốt, tỷ lệ thịt ngực cao tăng nhanh suất sản xuất với việc tăng dịch bệnh, dẫn đến gà bị mắc nhiều bệnh rối loạn chuyển hóa mắc nhiều bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ chết cao Trong kể đến bệnh Gumboro lọai virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1, chúng có khả phá huỷ túi Fabracius, làm giảm khả miễn dịch gà Nhiều báo cáo khoa học cho biết gà giai đọan từ - 12 tuần tuổi, giai đọan - tuần tuổi có khả mắc bệnh Gà nhỏ tuần tuổi mắc bệnh không biểu triệu chứng làm gà suy giảm miễn dịch Tỷ lệ mắc bệnh 100%, tỷ lệ chết từ 10 – 50% cao kết hợp với bệnh khác Do tính chất gây bệnh đặc trưng virus lây lan nhanh khơng thể kiểm sốt hóa chất hay phương thuốc mà khắc phục biện pháp phịng trừ Vì thiệt hại bệnh Gumboro gây đáng kể chăn nuôi gà nước lớn giới nói chung Việt Nam nói riêng Cùng với phát triền vượt bậc công nghệ sinh học, kỹ thuật phân tử chẩn đoán bệnh ngày giúp ta chẩn đốn nhanh, sớm cách xác nhiều bệnh virus Khởi phát từ vấn đề nêu trên, trí Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em thực đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm KIT chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro đàn gà nuôi Thái Nguyên” 1.2 Mục tiêu đề tài Nghiên cứu thành cơng KIT chẩn đốn nhanh bệnh Gumboro đánh giá kết thông qua thử nghiệm với quy mơ phịng thí nghiệm 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Kết đề tài cung cấp thông tin khoa học điều kiện sản xuất KIT thông số kỹ thuật ứng dụng để sản xuất KIT chẩn đoán bệnh Gumboro 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro ứng dụng thực tế góp phần chẩn đốn sớm điều trị kịp thời, giảm thiệt hại tới mức tối đa cho người chăn nuôi PHẦN TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Tổng quan bệnh Gumboro Bệnh Gumboro bệnh truyền nhiễm cấp tính gà, chủ yếu gà từ - tuần tuổi gà tây (Hitchner, S B, 1970) [18] Bệnh loại virus tác động vào túi Fabricius gây suy giảm miễn dịch gà, khiến cho gà dễ bị mắc chứng viêm da hoại tử, hội chứng thiếu máu - viêm gan thể bao hàm, bệnh E.coli khả sản sinh đáp ứng miễn dịch sau sử dụng loại vắc xin 2.1.1.1 Căn bệnh a Phân loại Theo Dobos, P (1979) [13], virus Gumboro thuộc họ Birnaviridae Họ gồm có giống: giống Apubirnavirus gây bệnh hoại tử tuyến tụy cho cá, lồi giáp xác; có IBDV gây bệnh cho gà; giống Entomobirnairus, có virus Drosophia X gây bệnh cho côn trùng (Mac Donald, R D, 1980) [27] Các virus thuộc họ đặc trưng cấu tạo nhân gồm đoạn ARN sợi đơi tên gọi họ virus Birnavirus (Bottcher, B cs, 1997) [10] Trước đây, hình thái cấu trúc virus chưa nghiên cứu đầy đủ nên IBDV xếp vào họ Picornaviridae Reoviridae b Đặc điểm hình thái, cấu trúc virus Gumboro Virus Gumboro hay gọi virus gây viêm túi truyền nhiễm (Infectious bursal disease virus - IBDV) Virus Gumboro lọai virus dạng trần, khơng có vỏ bọc bên ngồi, kích thước khoảng 50 – 60 nm có hình khối đa diện, nhiều góc cạnh trông giống tổ ong xếp đặn cạnh nhau, gồm chuỗi RNA quấn chéo nhau, vỏ capsid bao bọc bên vỏ chứa thành phần kháng ngun virus khơng có vỏ bọc bên ngồi nên đề kháng với việc sát trùng (Delmas, B cs, 2004) [12] Theo (Ozel, M H Gelderblom, 1985) [34] cấu trúc virus đơn giản hoàn thiện có khả chống chịu lại tác động bất lợi môi trường Mặt khác kích thước nhỏ bé cấu trúc linh hoạt (hệ gen đơn giản), virus thích ứng xâm nhập truyền lây quần thể vật chủ cách nhanh chóng dễ dàng khỏi miễn dịch tự nhiên thể Hình 2.1: Hình thái virus Gumboro Virus Gumboro có cấu tạo đối xứng, quanh nhân vỏ capsid (vỏ protein) Lớp vỏ capsid hợp thành 32 capsome (đơn vị hình thái) Capsid virus lớp vỏ protein đơn lớp Virus vỏ bọc ngồi mà thơng thường lớp vỏ lipoproterin nên nhạy cảm với formalin khơng nhạy cảm với ether chloroform Mỗi capsome tạo loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 VP5 (Viral Protein-VP) Về mặt di truyền học cách xếp nucleotid acid ribonucleic virus Gumboro cuộn lại tạo thành sợi đôi phân đoạn Đây tính đặc trưng virus RNA, người ta xếp vào họ Birnaviridae hệ thống phân loại virus động vật người Lukert, P D Y M Saif (1997) [26] Hình 2.2: Cấu trúc phân tử virus Gumboro