TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “Phân tích trình tự nucleotit gen mã hóa protein kháng nguyên ORF5 virus gây Hội chứng hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) từ số mẫu thu thập Việt Nam” LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn kết luận văn tơi trực tiếp thực Các số liệu kết cơng bố luận văn hồn tồn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả Bùi Phương Linh năm 2012 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Hữu Đức – Phó Trưởng khoa Cơng nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ Sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội TS Nguyễn Thị Diệu Thúy, Phó Trưởng phịng Công nghệ Gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Thầy, Cơ trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới KS Nguyễn Thị Thu – Cán nghiên cứu phịng Cơng nghệ Gen Động vật – Viện Cơng nghệ sinh học, người ln tận tình bảo, động viên cho lời khuyên quý báu công việc sống Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán nghiên cứu, kỹ thuật viên phịng Cơng nghệ Gen Động vật – Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận cách thuận lợi Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội, tận tình bảo cho tơi suốt q trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn đến người thân gia đình bạn bè hỗ trợ, động viên, khuyến khích tơi suốt thời gian qua Tơi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Bùi Phương Linh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .2 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một vài nét khái quát hội chứng hô hấp sinh sản lợn 2.1.1 Sự xuất bệnh 2.1.2 Triệu chứng lâm sàng 2.1.3 Tác hại bệnh 2.1.4 Đường truyền lây .7 2.2 Đặc điểm cấu trúc PRRSV 2.2.1 Đặc điểm virus 2.2.2 Cấu trúc virus 2.2.3 Các chủng PRRSV phân bố chúng 2.2.4 Protein kháng nguyên ORF5 10 2.3 Một số kỹ thuật dùng cho phân tích di truyền 11 2.3.1 Kỹ thuật tách chiết ARN 11 2.3.2 Kỹ thuật RT – PCR hai bước tạo cDNA chép ngược .11 2.4 Tình hình nghiên cứu PRRSV gen ORF5 giới Việt Nam 13 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 2.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu .22 3.2.1 Mẫu bệnh 22 3.2.2 Mồi sử dụng .23 3.2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 24 3.3 Phương pháp nghiên cứu 25 3.3.1 Tách ARN 25 3.3.2 RT – PCR hai bước 26 3.3.3 Tinh đoạn ORF5 gửi mẫu giải trình tự 28 3.3.4 Phân tích trình tự gen axít amin tương ứng chủng PRRSV 28 PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 4.1 Kết tách ARN 30 4.2 Kết thực phản ứng RT – PCR 30 4.3 Kết giải trình tự gen ORF5 mẫu phân lập .31 4.4 Kết giải trình tự gen ORF5 mẫu phân lập .34 4.5 Kết so sánh trình tự tương đồng axít amin 23 mẫu phân lập với với số chủng giới 43 4.6 Kết phân tích phả hệ gen ORF5 mẫu phân lập .50 4.7 Kết phân tích trình tự phả hệ so sánh với chủng giới 52 4.8 Đăng ký trình tự vào Ngân hàng gen 55 PHẦN VI: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 62 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ký hiệu địa điểm thu mẫu mẫu ORF5 phân lập 22 Bảng 3.2 Trình tự để giải trình tự ORF5 23 Bảng 3.3 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm 23 Bảng 3.4 Các dung dịch đệm .24 Bảng 3.5 Các hóa chất sử dụng 25 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .26 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .26 Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 26 Bảng 3.9 Thành phần phản ứng khuếch đại cDNA 27 Bảng 3.10 Chu trình phản ứng khuếch đại cDNA 28 Bảng 3.11 Danh sách chủng lựa chọn so sánh với mẫu phân lập Việt Nam.29 Bảng 4.1 Phần trăm tương đồng nucleotit gen ORF5 chủng PRRSV phân lập Việt Nam với số chủng giới 38 Bảng 4.2 Vị trí nucleotit đột biến 22 mẫu phân lập so với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332 .40 Bảng 4.3 Vị trí nucleotit đột biến 22 mẫu phân lập so với chủng vắc xin JXA1 – R 42 Bảng 4.4 Vị trí nucleotit đột biến mẫu HG2012.RV1 so với chủng vắc xin JXA1 – R .43 Bảng 4.5 Phần trăm tương đồng axít amin gen ORF5 chủng PRRSV phân lập Việt Nam với số chủng giới 47 Bảng 4.6 Vị trí axít amin đột biến 22 mẫu phân lập so với chủng VR2332 50 Bảng 4.7 Vị trí axít amin đột biến mẫu HG2012.RV so với chủng vắc xin JXA1 – R 51 Bảng 4.8 Vị trí axít amin đột biến 22 mẫu phân lập so với chủng vắc xin JXA1 – R 52 Bảng 4.9 Haplotype 23 mẫu phân lập 55 Bảng 4.10 Tên mã số đăng ký Ngân hàng gen mẫu lựa chọn so sánh 56 Bảng 4.11 Ký hiệu chủng số đăng ký Ngân hàng gen mẫu phân lập 59 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Điểm tụ máu phổi thận lợn bị nhiễm bệnh Hình 2.2 Đại thực bào tế bào bị nhiễm PRRSV tế bào bình thường .8 Hình 2.3 Cấu trúc genome PRRSV .8 Hình 2.4 Cây phân loại lịch sử tiến hóa tất dịng thuộc virus dòng Bắc Mỹ 17 Hình 3.1 Sơ đồ vị trí vùng gen ORF5 .23 Hình 4.1 Kết điện di ARN tổng số .30 Hình 4.2 Kết diện di sản phẩm RT – PCR gen ORF5 31 Hình 4.3 Giản đồ giải trình tự tự động (chromatogram) thành phần nucleotit gen ORF5 mẫu HG2012.RV1 32 Hình 4.4 So sánh trình tự nucleotit chuỗi gen ORF5 PRRSV phân lập Việt Nam với số chủng giới 36 Hình 4.5 So sánh thành phần axít amin gen ORF5 23 mẫu phân lập Việt Nam với số chủng giới 46 Hình 4.6 Phân tích phả hệ nguồn gốc chủng PRRSV Việt Nam số chủng khác giới sử dụng thành phần nucleotit gen ORF5 .54 Hình 4.7 Cây phả hệ chủng PRRSV Việt Nam số chủng khác giới sử dụng thành phần nucleotit gen ORF5 57 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT (Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành) Tên µl bp ADN ARN dNTP Tên tiếng Anh Microlitre Base pair Deoxyribonucleic acid Ribonucleic acid Deoxynucleoside Triphosphate HAAT Hyperthermie Avortements dé Truies kb MSD ORF PCR Kilo base Mystery swine disease Open reading frame Polymerase Chain Reaction Porcine Reproductive and lợn Kilơ bazơ Bệnh bí hiểm lợn Khung đọc mở Phản ứng chuỗi trùng hợp Hội chứng rối loạn sinh sản hô Respiratory Syndrome Porcine Reproductive and hấp lợn Virus gây Hội chứng rối loạn sinh Respiratory Syndrome Virus Reverse transcription polymerase sản hơ hấp lợn Phản ứng chuỗi đồng phân hóa chain reaction Swine infertility ADN Respiratory chép ngược Hội chứng hô hấp sẩy thai Syndrome Tris – Ethylen Diamin Tetra Acetic lợn PRRS PRRSV RT – PCR SIRS TE Tên tiếng Việt Mi – crơ – lít Cặp bazơ Axít Đeoxyribonucleic Axít Ribonucleic Đeoxynucleosit triphotphat Bệnh sốt cao, biếng ăn, sảy thai TÓM TẮT Đề tài: “Phân tích trình tự nucleotit gen mã hóa protein kháng nguyên ORF5 virus gây Hội chứng hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) từ số mẫu thu thập Việt Nam” thực nhằm mục đích giải trình tự vùng gen cấu trúc mã hóa protein kháng nguyên ORF5 đánh giá, so sánh với chủng lưu hành khu vực giới Đoạn gen ORF5 dài 603 bp 23 mẫu thu tỉnh Đồng Nai, Hậu Giang, thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ, Bình Dương mẫu vắc xin JXA1 – R phân lập giải trình tự hồn chỉnh Kết phân tích cho thấy 23 mẫu phân lập có tương đồng với từ 87,5% đến 100,0% trình tự nucleotit từ 86,5% đến 100,0% trình tự axít amin Trong 23 mẫu so sánh có tương đồng 87,5% đến 100,0% trình tự nucleotit, 87,0% đến 100,0% trình tự axít amin so sánh với chủng ngun thủy dịng Bắc Mỹ VR2332 có 61,0% đến 62,1% tương đồng nucleotit 55,5% đến 57,0% tương đồng axít amin so với chủng nguyên thủy dòng châu Âu Lelystad Điều chúng tỏ 23 mẫu phân lập nghiên cứu thuộc virus dòng Bắc Mỹ Mặt khác, 23 mẫu phân lập có tương đồng 89,2% đến 98,6% trình tự nucleotit, 87,5 % đến 98% trình tự axít amin so với chủng vắc xin JXA1 – R; 87,2% đến 99,6% trình tự nucleotit, 85,0% đến 98,5% trình tự axít amin so với chủng vắc xin BSL – PS100; so với chủng vắc xin MLV 86,8% đến 99,3% trình tự nucleotit, 85,5% đến 99,0% trình tự axít amin Dựa theo phả hệ, 23 mẫu phân lập tạo thành 10 haplotype chia thành hai nhóm Trong đó, nhóm thứ bao gồm mẫu HG2012.RV1 nhóm với chủng nguyên thủy VR2332, chủng vắc xin MLV, chủng vắc xin BSL – PS100 thuộc dòng phụ 5.1 – dòng phụ tiêu biểu cho chủng có độc lực thấp; nhóm thứ gồm 22 mẫu lại thuộc dòng phụ 8.7 – dịng phụ tiêu biểu cho chủng có độc lực cao bùng nổ Trung Quốc năm 2006 Điều đặc biệt 22 mẫu có tương đồng lên đến 89,0% – 99,0% trình tự nucleotit 88,5% – 100,0% trình tự axít amin so với chủng độc lực cao HUB1 Trung Quốc PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hội chứng hô hấp rối loạn sinh sản (PRRS: Porcine reproductive and respiratory syndrome) gọi bệnh “tai xanh” (Blue Ear) bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy lợn, PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), thuộc họ Arteriviridae, Nidovirales gây Bệnh xảy lần Mỹ vào khoảng năm 1987, sau tìm thấy châu Âu, xuất châu Á vào đầu năm 1990 Vào thời điểm đó, chưa xác định nguyên bệnh nên gọi “bệnh bí hiểm lợn” (MSD), số người theo triệu chứng gọi “bệnh tai xanh lợn” Sau đó, bệnh lây lan rộng toàn giới gọi nhiều tên Năm 1992, Hội nghị quốc tế bệnh tổ chức St Paul, Minnesota trí dùng tên PRRS (hội chứng hô hấp sinh sản lợn) Tổ chức Thú y Thế giới công nhận Hiện nay, PRRS trở thành dịch nhiều nước giới, gây tổn thất nặng nề cho kinh tế Ở Việt Nam, bệnh phát vào năm 1997 đàn lợn nhập từ Mỹ Đại dịch hội chứng hô hấp sinh sản lợn liên tục xảy từ năm 2007 – 2010 ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn nói riêng kinh tế nói chung Ngay khơng có dịch bệnh xuất nghiên cứu bệnh trại lợn giống tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết dương tính với bệnh khác nhau, từ 1,3% 68,29%, thế, việc quản lý kịp thời diễn biến bệnh vô cần thiết Vật chất di truyền PRRSV ARN mạch đơn có kích thước phân tử khoảng 15 kb mã hóa cho protein cấu trúc protein khơng cấu trúc PRRSV có gồm khung đọc mở gối lên nhau, mã hóa cho protein virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M N Trong đó, GP5 protein vỏ virus, nằm bề mặt màng virus, vị trí tiếp xúc PRRSV nhiễm vào vật chủ GP5 đích đến chủ yếu kháng thể trung hoà, tham gia vào chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch thể vật chủ PRRSV Ngồi ra, GP5 cịn tham gia tượng “chết theo chương trình” (apoptosis) tế bào thể bị nhiễm