Đang tải... (xem toàn văn)
Đa hình di truyền gen thyroglobulin (TG5) ở quần thể bò vàng việt nam
ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN THYROGLOBULIN (TG5) Ở QUẦN THỂ BÒ VÀNG VIỆT NAM Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, Lê Anh Quỳnh, Nguyễn Văn Ba, Trần Thị Thu Thủy, Lê Quang Nam Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật Tóm tắt Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định tính đa hình di truyền gen thyroglobulin (TG5), một trong những ứng cử gen liên quan đến tính trạng mỡ giắt, bằng kỹ thuật PCR-RFLP trên quần thể bò vàng Việt Nam. Đoạn gen TG5 có kích thước 548 bp sau khi tiến hành nhân đặc hiệu bằng phản ứng PCR được phân tích đa hình bằng enzyme giới hạn PstYI. Kết quả phân tích trên 462 mẫu bò vàng địa phương (bò vàng Lạng Sơn, bò vàng Hà Giang, bò vàng Thanh Hóa, bò vàng Nghệ An, bò U Đầu Rìu, bò vàng Phú Yên, bò vàng Bà Rịa Vũng Tàu) và 66 mẫu từ giống bò ngoại Brahman) chỉ xác định được 2 kiểu gen CC và CT, không xác định được cá thể nào mang kiểu gen TT. Tần số kiểu gen CC và CT ở quần thể bò vàng Việt Nam tương ứng là 98,9% và 1,1%. Qua đó cho thấy, tần số alen T liên quan đến tính trạng mỡ giắt ở quần thể bò vàng Việt Nam là rất thấp. Ngoài ra, kết quả phân tích thống kê cho thấy không có sự sai khác về tần số các kiểu gen CC, CT và TT giữa các nhóm bò vàng. 1. Mở đầu Tính trạng mỡ giắt ở thịt bò là một yếu tố quan trọng nhất để xác định giá trị thịt sẻ của bò thịt. Tuy nhiên các chương trình chọn lọc di truyền nhằm thay đổi tính trạng dắt mỡ vẫn còn bị hạn chế do cần thời gian thực hiện lâu và chi phí cao. Ngày nay với sự phát triển mạnh của lĩnh vực di truyền phân tử, việc kiểm tra ở mức độ phân tử ADN nhằm xác định phẩm chất tốt đối với tính trạng mỡ giắt sẽ cung cấp một công cụ hữu hiệu để cải tiến di truyền tính trạng mỡ giắt một cách thuận lợi hơn. Một ứng cử gen được cho là ảnh hưởng đến tính trạng mỡ giắt có vai trò sản sinh ra thyroglobulin, là tiền thân của hormone tuyến giáp bao gồm triodothyronine và thyroxin. Đây là những tín hiệu đối với sự phát triển của các tế bào mỡ ( Ailhaud và cộng sự 1992). Gen tổng hợp Thyroglobulin (kí hiệu TG) nằm gần vùng tâm động nhiễm sắc thể số 14 của bò. Gen Thyroglobulin ở bò dài hơn 200.000 bp với hơn 42 exon trong đó 34 exon đã được xác định và được cho là gen lớn nhất trong hệ gen bò đã được nghiên cứu. Barendse và cộng sự (1997, 2001) đã xác định được thì sự đa hình tại vùng khởi động ở trình tự đầu 5’ của gen Thyroglobulin và sự đa hình này có mối liên quan tới sự tích tụ các mô mỡ trong cơ ở những con bò được vỗ béo. Cũng theo tác giả này, những cá thể mang alen đồng hợp TT hay dị hợp CT có vân mỡ giắt cao hơn những cá thể mang alen đồng hợp CC (đột biến thay đổi T thành C ở vùng khởi động gần exon 1 của gen). Nói cách khác, sự hiện diện của alen T làm tăng sự tăng trưởng và tích tụ vân mỡ giắt trong cơ. Chính vì vậy, sự đa hình ở trình tự đầu 5’ của gen Thyroglobulin đã được coi như một chỉ thị phân tử (ký hiệu TG5) trong chọn lọc bò thịt đối với tính trạng mỡ giắt (Casas và cộng sự 2005; Rincker và cộng sự 2006; Van Eenennaam và cộng sự 2007) Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định sự đa hình di truyền gen thyroglobuline ở quần thể bò vàng Việt Nam. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trên quần thể gồm 7 nhóm bò vàng địa phương: bò vàng Lạng Sơn, bò vàng Hà Giang, bò vàng Thanh Hóa, bò vàng Nghệ An, bò U Rìu, bò vàng Phú Yên, bò vàng Bà Rịa Vũng Tàu và giống bò ngoại nhập Brahman. Địa điểm và số mẫu của mỗi nhóm được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Địa điểm và số lượng mẫu phân tích ở các nhóm bò Nhóm bò Địa điểm thu mẫu Số mẫu Bò vàng Hà Giang Đồng Văn- Hà Giang 66 Bò vàng Lạng Sơn Bình Gia- Lạng Sơn 66 Bò vàng Thanh Hóa Như Xuân- Thanh Hóa 66 Bò vàng Nghệ An Yên Thành- Nghệ An 66 Bò vàng U Rìu Nam Đàn- Nghệ An 66 Bò vàng Phú Yên Sông Hinh- Phú Yên 66 Bò vàng Bà Rịa Châu Đức- Vũng Tàu 66 Bò Brahman Củ Chi- TP HCM 66 Tổng 528 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các mẫu mô tai của mỗi cá thể ở các nhóm bò nói trên được thu thập đảm bảo hạn chế về quan hệ huyết thống. Các mẫu này được bảo quản trong dung dịch cồn 98%, sau đó đưa về phòng thí nghiệm và bảo quản tiếp ở -20 0 C trước khi tiến hành tách chiết ADN. ADN hệ gen được tách chiết từ các mẫu mô theo quy trình của bộ kít Bioneer (Hàn Quốc). Phản ứng PCR nhân đặc hiệu đoạn gen TG5 được tiến hành với tổng thể tích 25 μl, bao gồm: 50 ng ADN hệ gen; 10pM mồi xuôi và ngược; 0,2mM dNTP; 1,5 mM MgCl2; 1UI Taq polymerase và đệm PCR 10x của hãng Fementas. Hai mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng theo Barendse (1997) có trình tự như sau: Mồi xuôi: 5’ GGGGATGACTACGAGTATGACTG 3’ Mồi ngược: 5’ GTGAAAATCTTGTGGAGGCTGTA 3’ Chu trình nhiệt của phản ứng được thực hiện theo các bước: Trước tiên ADN khuôn được biến tính ở 94 0 C trong 5 phút, tiếp theo đó với 35 chu kỳ lặp lại ở điều kiện: biến tính ở 94 0 C trong 35 giây, gắn mồi ở 63 0 C trong 45 giây, tổng hợp chuỗi ADN ở 72 0 C trong 35 giây, cuối cùng kết thúc phản ứng ở 72 0 C trong 10 phút. Để phân tích đa hình gen TG5, sản phẩm PCR được tiến hành cắt bởi enzyme giới hạn BstYI. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện trong thể tích 25 μl, bao gồm: 2,5 μl đệm cắt, 15 μl sản phẩm PCR, 0,2 μl (5U) enzyme cắt và 7,3 μl H 2 O. Phản ứng được ủ qua đêm ở 37 0 C. Sản phẩm cắt enzyme được kiểm tra trên gel agarosse 2%, nhuộm bằng Ethidium Bromide và phát hiện dưới ánh sáng UV. Phân tích số liệu thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng phần mềm Minitab 14. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Nhân ADN đặc hiệu đoạn gen TG5 và phân tích đa hình bằng enzyme BstYI Đoạn gen TG5 có kích thước 548 bp trong đó chứa điểm đa hình tại vị trí 1696 của trình tự gen TG5 (mã truy cập trên ngân hàng gen là M358823) đã được nhân đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR (Hình 1). Kết quả hình 1 cho thấy sản phẩm PCR cho một băng rõ nét và có kích thước 548 bp, phù hợp với kích thước theo nghiên cứu của Barendse và cộng sự (1997). Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen TG5 (M: Thang ADN chuẩn 100 bp; 1- 11: Sản phẩm PCR gen TG5 của 11 cá thể bò) Sản phẩm PCR đoạn gen TG5 chứa một điểm cắt thông thường và một điểm cắt đa hình của enzyme giới hạn BstYI. Có nghĩa là trên sản phẩm PCR luôn luôn tồn tại một điểm cắt của enzyme giới hạn BstYI, ngoài ra có một điểm khác (ở vị trí 1696 theo trình tự trên ngân hàng gen) thường xẩy ra sự đột biến thay thế giữa 2 nucleotide T và C (được gọi là điểm đa hình). Khi nucleotide T bị đột biến thay thế bởi nucleotide C sẽ dẫn đến sự nhận biết và bị cắt bởi enzyme BstYI. Vì vậy, khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme sẽ thu được 2 kiểu alen ký hiệu T và C, trong đó alen T sẽ cho các băng có kích thước 75 bp và 473 bp; alen C sẽ cho các băng có kích thước 75 bp, 178 bp và 295 bp. Dó đó, tổ hợp của 2 kiểu alen này sẽ có 3 kiểu gen khác nhau. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Kết quả được thể hiện ở bảng 2 và hình 2. Bảng 2. Các kiểu gen TG5 khác nhau và độ dài các đoạn cắt enzyme tương ứng Kiểu gen Độ dài đoạn cắt bởi enzyme PstYI (bp) CC 295, 178, 75 TT 473, 75 CT 473, 295, 178, 75 Hình 2. Hỉnh ảnh điện di kết quả cắt đoạn gen TG5 bằng enzyme BstYI (M: Thang ADN chuẩn 100 bp) 3.2. Đa hình di truyền gen TG5 ở quần thể bò vàngViệt Nam Kết quả phân tích trên 462 mẫu từ 7 nhóm bò vàng địa phương (bò vàng Lạng Sơn, bò vàng Hà Giang, bò vàng Thanh Hóa, bò vàng Nghệ An, bò U Rìu, bò vàng Phú Yên, bò vàng Bà Rịa Vũng Tàu) đã xác đinh được 457 cá thể mang kiểu gen CC (98,9%), 5 cá thể mang kiểu gen CT (1,1%) và không có cá thể nào mang kiểu gen TT (0%). Tần số alen C và alen T trong quần thể bò vàng tương ứng là 0,995 và 0,005. Trong số 66 mẫu của giống bò ngoại Brahman đã xác định được 63 cá thể mang kiểu gen CC (95,5%), 3 cá thể mang kiểu gen CT (4,5%) và cũng không có cá thể nào mang kiểu gen TT. Như vậy, số cá thể mang các kiểu gen khác nhau và tần số alen C, T phân bố trong mỗi nhóm bò vàng là tương đối giống nhau, kể cả ở giống bò Brahman ngoại nhập (Bảng 3). Trong đó, số cá thể mang kiểu gen đồng hợp CC chiếm chủ yếu trong các nhóm, đặc biệt ở các nhóm bò vàng Lạng Sơn, bò vàng Nghệ An và bò vàng Phú Yên kiểu gen CC chiếm 100%. Bảng 3. Số lượng cá thể mang các kiểu gen TG5 và tần số phân bố các alen ở mỗi nhóm bò M CT CC CC CT CC CC CC CC CC CC CC Kiểu gen Tần số alen % Nhóm bò CC CT TT Số mẫu C T Bò vàng Hà Giang 64 2 0 66 98,5 1,5 Bò vàng Lạng Sơn 66 0 0 66 100 0,0 Bò vàng Thanh Hóa 65 1 0 66 99,3 0,7 Bò vàng Nghệ An 66 0 0 66 100 0,0 Bò U đầu Rìu 65 1 0 66 99,3 0,7 Bò vàng Phú Yên 66 0 0 66 100 0,0 Bò vàng Bà Rịa 65 1 0 66 99,3 0,7 Bò Brahman 63 3 0 66 97,7 2,3 Tổng 520 8 0 Kết quả cho thấy, tần số alen T ở quần thể bò vàng Việt Nam là rất thấp. So sánh với kết quả nghiên cứu trên các giống bò khác nhau của một số tác giả trên thế giới thì sự phân bố về tần số các kiểu gen TG5 ở bò vàng Việt Nam có sự khác biệt đáng kể. Rincker và cộng sự (2006) nghiên cứu trên 175 cá thể bò Simmental cho thấy có 26,8% kiểu gen CC, 54,3% kiểu gen CT và 18,9% kiểu gen TT. Casas và cộng sự (2005) phân tích trên giống bò Brahman có nguồn gốc từ Florida cho thấy có 94,6% kiểu gen CC, 3,9% kiểu gen CT và 1,5% kiểu gen TT. Theo nghiên cứu của Casas và cộng sự (2007) phân tích trên một số giống bò được tạo ra từ các bò mẹ có nguồn gốc bố là các giống khác nhau cho thấy tần số của alen T cũng tương đối cao. Như đã nêu, mối liên quan giữa alen T với tính trạng giắt mỡ ở thịt bò đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho thấy rằng các cá thể mang kiểu gen TT có độ mỡ dắt cao nhất sau đó đến kiểu gen CT và thấp nhất là kiểu gen CC. Có thể do mối liên quan như vậy nên ở những quần thể bò tự nhiên (không áp dụng chương trình chọn lọc ) có khả năng đáp ứng với điều kiện khí hậu nhiệt đới thì tần số alen T thường xuất hiện với tần số rất nhỏ như là kết quả của sự chọn lọc tự nhiên. Kết quả nghiên cứu của Van Eenennaam và cộng sự (2007) trên các giống bò thuộc loài phụ Bos taurus và Bos indicus đã chỉ ra rằng tần số alen T ở các giống bò thuộc loài phụ Bos taurus cao hơn so các giống bò thuộc loài phụ Bos indicus. Nghiên cứu này đã giải thích cho kết quả nghiên cứu của chúng tôi vì sao tần số alen T xuất hiện thấp ở quần thể bò vàng Việt Nam. Vì bò vàng Việt Nam là sự lai tạp giữa hai loài phụ Bos taurus và Bos indicus (Lê Viết Ly và cộng sự 1999), chúng có khả năng đáp ứng tốt với điều kiện khí hậu nhiệt đới của từng vùng, đặc biệt là với điều kiện khắc nghiệt nắng nóng và khô hạn được nuôi nhằm mục đích cày kéo phục vụ canh tác nông nghiệp. Do đó, alen T do không có lợi nên đã không được giữ lại trong quá trình chọn lọc tự nhiên. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng không cho thấy sự khác biệt về tần số alen T giữa giống bò Brahman ngoại nhập nuôi tại Củ Chi và quần thể bò vàng Việt Nam (P>0,05). Điều này theo chúng tôi có thể do: (1) kết quả của chọn lọc tự nhiên vì giống bò Brahman cũng là một giống đáp ứng tốt với điều kiện khí hậu nhiệt đới; (2) giống bò này chưa được chọn lọc theo tính trạng mỡ giắt ở thịt; (3) mẫu phân tích bị cận huyết do được tạo ra từ số lượng đực giống ít. 4. Kết luận Trong số 462 mẫu bò vàng được tiến hành phân tích đa hình gen TG5, chỉ xác định được 2 kiểu gen CC và CT với tần số tương ứng là 98,9% và 1,1%, không phát hiện được cá thể nào mang kiểu gen TT. Qua đó cho thấy tần số alen T liên quan đến tính trạng mỡ giắt ở thịt bò trong quần thể bò vàng Việt Nam là rất thấp. Không có sự sai khác về tính đa hình di truyền gen thyroglobulin giữa các nhóm bò vàng địa phương (P>0,05). Tài liệu tham khảo 1. Lê Viết Ly., Hoàng Kim Giao., Mai Văn Sánh., Võ Văn Sự và Lê Minh Sắt, (1999). Bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam. Tập I: Phần gia súc. NXB. Nông nghiệp 2. Ailhaud G., Grimaldi P and Negrel R (1992). Cellular and molecular aspects of adipose tissue development. Annu Rev Nutr 12:207-233. 3. Barendse W (1997). Assessing lipid metabolism. Patent Aplication WO9923248 PCT/AU98/00882 4. Barendse W., Bunch R., Thomas M., Armitage S., Baud S and Donaldson N (2001). The TG5 DNA marker test for marbling capacity in Australian feedlot cattle. Marbling Symposium. 5. Casas E., White S.N., Riley D.G., Smith T.P.L., Brenneman R.A., Olson T.A, Johnson D.D., Coleman S.W., Bennett G.L and Chase C.C (2005). Assessing of single nucleotide polymorphisms in genes residing on chromosomes 14 and 29 for association with carcass composition traits in Bos indicus cattle. J. Anim. Sci. 83:13-19. 6. Casas E., White S.N., Shackelford., Wheeler T.L., Koohmaraie M., Bennett G.L and Smith T.P.L (2007). Assessing the association of single nucleotide polymorphisms at the thyroglobulin gene with carcass traits in beef cattle. J. Anim. Sci. 85:2807-2814. 7. Rincker C.B., Pyat N.A., Berger L.L., and Faulkner D.B (2006). Relationship among GeneSTAR marbling marker, intramuscular fat deposition and expected progeny differences in early weaned Simmental steer. J. Anim. Sci. 854: 686-693. 8. Van Eenennaam A.L., Li J., Thallaman R.M., Quaas R.L., Dikeman M.E., Gill C.A., Franke D.E and Thomas M.G (2007). Validation of commercial DNA test for quantitative beef quality traits. J. Anim. Sci. 85: 891-900. . di truyền gen TG5 ở quần thể bò vàngViệt Nam Kết quả phân tích trên 462 mẫu từ 7 nhóm bò vàng địa phương (bò vàng Lạng Sơn, bò vàng Hà Giang, bò vàng Thanh Hóa, bò vàng Nghệ An, bò U Rìu, bò. sự đa hình di truyền gen thyroglobuline ở quần thể bò vàng Việt Nam. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trên quần thể gồm 7 nhóm bò vàng. quan đến tính trạng mỡ giắt ở thịt bò trong quần thể bò vàng Việt Nam là rất thấp. Không có sự sai khác về tính đa hình di truyền gen thyroglobulin giữa các nhóm bò vàng địa phương (P>0,05).