HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ PHÊ Hà Nội, 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ PHÊ Họ tên sinh viên : Nguyễn Lan Nhi Mã sinh viên : 637161 Lớp : K63CNSHB Giảng viên hƣớng dẫn : PGS TS Nguyễn Văn Giang Hà Nội, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khoá luận trung thực chƣa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khoá luận đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Lan Nhi i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Thầy PGS.TS Nguyễn Văn Giang quan tâm, bạo, dạy dỗ giúp đỡ suốt trình làm đề tài tốt nghiệp Cảm ơn bạn, anh chị học tập làm việc Bộ môn Công nghệ vi sinh đồng hành giúp đỡ nhiều công việc Cuối cùng, xin cảm ơn bố mẹ gia đình, bạn bè ln bên tơi, động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập Học viện Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Lan Nhi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT x I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan xạ khuẩn 2.1.1 Giới thiệu xạ khuẩn 2.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc 2.1.3 Đặc điểm sinh hóa lý 2.1.4 Ứng dụng xạ khuẩn 2.2 Tổng quan nấm gây bệnh cà phê 12 2.2.1 Tổng quan cà phê 12 2.2.2 Tổng quan tình hình sản xuất cà phê giới Việt Nam 13 2.2.3 Các bệnh thƣờng gặp cà phê 15 2.2.4 Tổng quan chủng nấm Fusarium oxysporum 18 III NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Nội dung nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.3 Vật liệu nghiên cứu 22 3.3.1 Các chủng vi sinh vật 22 3.3.2 Hóa chất thiết bị 22 iii 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 3.4.1 Khảo sát khả kháng nấm chủng xạ khuẩn 24 3.4.2 Bảo quản giống 25 3.4.3 Đặc điểm sinh học 25 3.4.4 Đánh giá đặc điểm sinh hóa xạ khuẩn 26 3.4.5 Khả sinh enzyme ngoại bào 28 3.4.6 Định danh chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn 29 IV KẾT QUẢ 31 4.1 Sàng lọc khả đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh chủng xạ khuẩn 31 4.2 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 32 4.2.1 Đặc điểm nuôi cấy chủng XK16 XK88H môi trƣờng Gause ISP 32 4.2.2 Đặc điểm hệ sợi cuống sinh bào tử 34 4.3 Đặc điểm hóa sinh 35 4.3.1 Khả sinh sắc tố Melanin 35 4.3.2 Ảnh hƣởng pH 36 4.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ 39 4.5 Khả đồng hóa nguồn Carbon 40 4.6 Khả đồng hóa nguồn Nitơ 42 4.7 Ảnh hƣởng nồng độ muối 42 4.8 Khả phân giải Citrate 44 4.9 Khả sinh Enzyme ngoại bào 45 Định danh chủng xạ khuẩn XK16 47 5.1 Tách chiết DNA 47 5.2 Khuếch đại trình tự 16S rRNA phản ứng PCR 47 5.3 Định danh phân tích phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 48 iv V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 62 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Hoạt tính đối kháng chủng xạ khuẩn với số nấm gây bệnh(%) 31 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái chủng XK16 chủng XK88H môi trƣờng khác 33 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng pH tới khả sinh trƣởng phát triển hai chủng xạ khuẩn XK16 XK88H 37 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh trƣởng phát triển hai chủng xạ khuẩn XK16 XK88H 40 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nguồn carbon tới khả sinh trƣởng phát triển hai chủng xạ khuẩn XK16 XK88H 41 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nguồn nitơ tới khả sinh trƣởng phát triển hai chủng xạ khuẩn XK16 XK88H 42 Bảng 4.7 Nồng độ muối thích hợp chủng xạ khuẩn XK16 XK88H 43 Bảng 4.8 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn XK16 XK88H 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh xạ khuẩn Hình 1.2 Sự hình thành hai loại khuẩn ty sau bào tử xạ khuẩn nẩy mầm Hình 1.3 Một số dạng cuống sinh bào tử xạ khuẩn Hình 2.1 Cây cà phê 13 Hình 2.2 Cây cà phê bị lở cổ rễ (https://www.syngenta.com.vn/ca-phe) 15 Hình 2.3 Cây cà phê bị thối cổ rễ (https://www.syngenta.com.vn/ca-phe) 16 Hình 2.4 Cây cà phê bị thối nứt thân 17 Hình 2.5 Cây cà phê bị thối rễ tơ (https://www.syngenta.com.vn/ca-phe) 17 Hình 2.6 Bào tử nấm Fusarium oxysporum 20 Hình 4.1 Khả ức chế nấm Fusarium oxysporum chủng XK16 sau 10 ngày nuôi cấy 32 Hình 4.2 Khả ức chế nấm Fusarium oxysporum chủng XK88H sau 14 ngày nuôi cấy 32 Hình 4.3 Đặc điểm hình thái chủng XK16 mơi trƣờng khác sau 21 ngày nuôi cấy 34 Hình 4.4 Khuẩn ty khí sinh (A), cuống sinh bào tử (B) xạ khuẩn XK88H 35 Hình 4.5 Đặc điểm khuẩn ty khí sinh (A) cuống sinh bào tử (B) xạ khuẩn XK16 35 Hình 4.6 Xạ khuẩn XK88H(A) XK16(B) môi trƣờng ISP6 sau ngày nuôi cấy 36 Hình 4.7 Ảnh hƣởng pH đến khả kháng nấm sau ngày nuôi cấy chủng XK88H 38 Hình 4.8 Ảnh hƣởng pH đến khả kháng nấm sau ngày nuôi cấy chủng XK16 38 vii Hình 4.9 Khả sinh trƣởng chủng xạ khuẩn XK16(A) XK88H(B) tƣơng ứng với nồng độ muối 0,5 % 43 Hình 4.10 Khả phân giải Citrate hai chủng XK16 XK88H 44 Hình 4.11 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn XK16 46 Hình 4.12 Kết điện di tổng số chủng XK16 47 Hình 4.13 Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại với đoạn mồi thuộc vùng 16S rRNA chủng xạ khuẩn XK16 48 Hình 4.14 Xác định loài chủng XK16 nhờ so sánh trình tự nucleotide GenBank 48 Hình 4.15 Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA chủng XK16 49 viii Phụ lục 3.1 Khả sinh trƣởng chủng XK16 điều kiện pH khác pH4 pH7 pH10 pH5 pH6 pH8 pH9 pH11 pH12 64 Phụ lục 3.2 Khả sinh trƣởng chủng XK88H điều kiện pH khác pH4 pH7 pH10 pH5 pH6 pH8 pH9 pH11 pH12 65 Phụ lục 3.3 Khả sinh trƣởng chủng XK16 điều kiện nhiệt độ khác 30oC 35 oC 45 oC 40 oC 50 oC Phụ lục 3.4 Khả sinh trƣởng chủng XK88H điều kiện nhiệt độ khác 30oC 35 oC 45 oC 40 oC 50 oC 66 Phụ lục 3.5 Khả sinh trƣởng chủng XK16 nguồn Carbon khác Maltose Dextrin Sucrose Lactose Xylose ĐC (-) D-Glucose 67 Phụ lục 3.6 Khả sinh trƣởng chủng XK88H nguồn Carbon khác Maltose Dextrin Sucrose Xylose D-Glucose 68 Lactose Đối chứng (-) Phụ lục 3.6 Khả sinh trƣởng chủng XK16 nguồn Nitơ khác Peptone KNO3 NaNO3 Cao thịt Đối chứng (-) 69 (NH4)2SO4 Urea Phụ lục 3.6 Khả sinh trƣởng chủng XK88H nguồn Nitơ khác Peptone NaNO3 KNO3 Cao thịt Đối chứng (-) 70 (NH4)2SO4 Urea Phụ lục 3.7 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả sinh trƣởng phát triển chủng xạ khuẩn 16 NaCl 0% NaCl 3% NaCl 0,5% NaCl 1% NaCl 5% NaCl 7% NaCl 9% NaCl 11% 71 Phụ lục 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả sinh trƣởng phát triển chủng xạ khuẩn 88H NaCl 0% NaCl 3% NaCl 0,5% NaCl 1% NaCl 5% NaCl 7% NaCl 9% NaCl 11% 72 Phụ lục 3.9 Hình ảnh sàng lọc đối kháng nấm số chủng xạ khuẩn XK16 - Fusarium oxysporum XK88H - Fusarium oxysporum XK16 - Diaporthe sp X88H - Diaporthe s XKC9 - Fusarium oxysporum XK 61 - Fusarium oxysporum XKC10 - Fusarium oxysporum XK4 - Fusarium oxysporum 73 XK16 - Trichoderma XK61- Fusarium oxysporum XK16 - Fusarium oxysporum 74 Phụ lục 3.10 Ảnh hƣởng pH đến khả kháng nấm Fusarium oxysporum chủng XK88H pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10 pH11 75 Phụ lục 3.11 Ảnh hƣởng pH đến khả kháng nấm Fusarium oxysporum chủng XK16 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH pH10 pH11 76 Phụ lục 3.12 Ảnh hƣởng pH đến khả kháng nấm Fusarium oxysporum chủng XK16 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10 pH11 77 Phụ lục 3.13 Kết giải trình tự 16s RNA chủng XK16 ACCAAGTTCAACAGGCTCCCTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCG GCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGT ACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCG ATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCC AATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCACG GTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGC CCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTT CCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCCGTGAGTCCCCAGCACC ACAAGGGCCTGCTGGCAACACGGGACAAGGGTTGCGCTCGTTG CGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCC ATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGGCACTATCTCTA ATGCTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTT GCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCC GTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGC GGGGCACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACAACGTGGAATG TTGCCCACACCTAGTGCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAG GGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGT CAGTATCGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCT GATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCC CTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGACTGCAGACCCGGGGT TAAGCCCCGGGCTTTCACAACCGACGTGACAAGCCGCCTACGA GCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGT ATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGC AGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGTTTACAA CCCGAAGGCCGTCATCCCTCANCCGGGGTCCCTGCATCAGGCT TTCGCCCATTGGGCAANTTCCCCACTGGTCGCTCCCCNAGGGAT CTGGGCCG 78