HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH HỆ GENOME CHỦNG Bacillus thuringiensis LM1212 HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH HỆ GENOME CHỦNG Bacillus thuringiensis LM1212 Họ tên : Phạm Hương Giang Lớp : K63CNSHB Mã sinh viên : 637124 Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Nhiên HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp đại học: “Phân tích hệ genome chủng Bacillus thuringiensis LM1212” hoàn thành hướng dẫn giám sát TS Nguyễn Thị Nhiên kết đề tài khơng khớp với khóa luận khác Dữ liệu kết trình bày báo hoàn toàn trung thực khách quan, dựa quan điểm riêng đề tài Nếu có sai sót, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Trong trình nghiên cứu thực khóa luận, em thừa hưởng thành nhà khoa học với lịng kính trọng biết ơn Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2022 Sinh viên Phạm Hương Giang i LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Nhiên hỗ trợ tận tình cho em suốt thời gian thực khóa luận hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học Động vật tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy giáo, gia đình bạn bè ln động viên, giúp đỡ em có điều kiện tốt suốt q trình hồn thành luận văn Do thời gian kiến thức có hạn nên khóa luận chắn có hạn chế thiếu sót định Trân trọng ghi nhận nhận xét, đóng góp thầy, giáo bạn sinh viên Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2022 Sinh viên Phạm Hương Giang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Bacillus 1.1.1 Khái quát 1.1.2.Phân loại phát sinh loài 1.1.3.Cấu trúc bề mặt Bacillus 1.1.4.Thành tế bào 1.1.5 Di truyền 1.2 Khai thác gene Bacillus 1.2.1 Khai thác gene 1.2.2 Vai trò tin sinh học việc khám phá sản phẩm tự nhiên cách khai thác gene 10 1.3 Về ứng dụng tin sinh học 11 1.3.1 Một số ứng dụng tin sinh học 12 1.3.2 Hướng tương lai 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 2.1 Vật liệu 16 2.2 Thiết bị nghiên cứu 19 2.3 Nội dung nghiên cứu phương pháp nghiên cứu 20 iii 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 20 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.3 Phân tích cụm gene mã hóa cho đường sinh tổng hợp số hợp chất thứ cấp Bacillus thuringiensis LM1212 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Phát sinh loài Bacillus thuringiensis LM1212 29 3.2 Dự đốn trình tự gen có Bacillus thuringiensis LM1212 30 3.3 Chú thích gen, phân tích chức Bacillus thuringiensis LM1212 31 3.4 Các cụm gene sinh tổng hợp cho chất chuyển hóa thứ cấp Bacillus thuringiensis LM1212 45 3.5 Con đường sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp Bacillibactin Bacillus thuringiensis LM1212 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 51 Kết luận 51 Đề xuất 51 PHỤ LỤC 53 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT antiSMASH Antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell (Cơng cụ phân tích vùng gen sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng sinh) ARTS Antibiotic Resistant Target Seeker (cơng cụ tìm kiếm gen kháng kháng sinh) BGCs Biosynthetic gene clusters (vùng gen sinh tổng hợp chất/nhóm chất) BLAST Basic Local Alignment Search Tool (Cơng cụ tìm kiếm trình tự tương đồng) Local BLAST Sử dụng công cụ BLAST với sở liệu máy tính (khơng làm BLAST online) CAZyme Carbohydrate active enzyme (enzyme thuỷ phân carbohydrate) COGs Clusters of Orthologous Groups (nhóm vùng tương đồng) GBDP Genome BLAST Distance Phylogeny (cây phát sinh chủng loại dựa so sánh genome phần genome) GO Gene Ontology (Bản thể luận gen: hệ thống thống việc diễn tả thuộc tính gen sản phẩm gen tất lồi KEGG Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes (Bách khoa toàn thư Kyoto Genes Genomes) NRPSs Non-ribosomal peptide synthetases (Peptide sinh tổng hợp không phụ thuộc vào ribosome) PKSs Polyketide synthases (Enzyme sinh tổng hợp polyketides) TYGS The Type (Strain) Genome Server (Server hệ genome sinh vật tiền nhân) SMS single molecule sequencing (Kỹ thuật giải trình tự với phân tử DNA) v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Mối quan hệ chủng Bacillus thuringiensis LM1212 với 14 loài liên quan dựa so sánh trình tự hệ gen 30 Hình Đặc điểm gene Bacillus thuringiensis LM1212 cung cấp GeneMark 31 Hình 3 Tổng quan kết thích chức Blast2GO Bacillus thuringiensis LM1212 32 Hình Số trình tự có độ dài LM1212 33 Hình Phân bố độ tương tự trình tự 34 Hình Sự tương đồng trình tự chủng nghiên cứu chủng liên quan 35 Hình Biểu đồ phân bố lồi Top- Hit Bacillus thuringiensis LM1212 35 Hình Biểu đồ kết InterProScan 36 Hình Biểu đồ GO – Level Distribution cho Bacillus thuringiensis LM1212 37 Hình 10 Quá trình sinh học (Biological Process) Bacillus thuringiensis LM1212 41 Hình 11 Sơ đồ mối quan hệ protein thuộc nhóm chức phân tử chủng Bacillus thuringiensis LM1212 43 Hình 12 Sơ đồ mối quan hệ protein thuộc nhóm thành phần tế bào chủng Bacillus thuringiensis LM1212 44 Hình 13 Kết phân tích cụm gen giả định cho trình sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp AntiSMASH Bacillus thuringiensis LM1212 45 Hình 14 Cụm Antismash 48 Hình 15 Điều chỉnh trình thu nhận sắt trình phát triển màng sinh học 48 Hình 16 Vùng sinh tổng hợp vận chuyển bacillibactin chủng Bacillus subtilis subsp subtilis str 168 49 Hình 17 Kết chạy local blast 49 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1 Sự phân chia lại phân loại Bacillus (1986-2004) Bảng Đặc điểm gen Bacillus thuringiensis LM1212 cung cấp NCBI, EZBioCloud 17 Bảng 2 Danh sách 14 chủng Bacillus liên quan 23 Bảng 3.1 Danh mục 14 chủng Bacillus sử dụng phân tích 29 Bảng Mức phân bố GO cho Bacillus thuringiensis LM1212 39 Bảng 3 Danh mục thể luận gen sau phân tích BLAST2GO 40 vii TĨM TẮT Bacillus nhóm vi khuẩn có lợi diện đa số chế phẩm vi sinh sản xuất enzyme Trong nghiên cứu này, gene chủng Bacillus thuringiensis LM1212 sử dụng để kiểm tra khả sinh tổng hợp hợp chất tiềm Đối với gen này, so sánh với chủng Bacillus liên quan, cho thấy hệ gen giống gần 80-100% Kết phân tích cơng cụ antiSMASH 6.0.1 cho thấy chủng Bacillus thuringiensis LM1212 có BGC giả định cho trình sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp như: Peptide sinh tổng hợp không phụ thuộc vào ribosome (NPRS), RiPP-like, NRPS-like, betalactone, terpene,… Khoá luận phân tích cụm gene sinh tổng hợp bacillibtin liên kết với sắt ngoại bào vận chuyển qua màng tế bào Nghiên cứu cho thấy việc phân tích gene vô thiết thực quan trọng viii Chức phân tử Hình 11 Sơ đồ mối quan hệ protein thuộc nhóm chức phân tử chủng Bacillus thuringiensis LM1212 Hình 3.11 cho thấy thích chức phân tử Bacillus thuringiensis LM1212 Hai thuật ngữ tô màu đậm cấp GO thứ hai Bacillus thuringiensis LM1212 là: hoạt tính xúc tác (catalytic activity) có 2434 trình tự gen 1683 trình tự gắn (binding) Ở mức thấp hoạt tính thủy phân (hydrolase activity, GO: 0016787) có 822 trình tự (23,92%), hoạt động oxy hóa khử (oxidoreductase activity, GO: 0016491 có 405 trình tự (11,78%), enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị (transferase activity, GO: 0016740) có 879 trình 43 tự (25,57%), hoạt tính xúc tác liên kết ion (ion binding, GO: 0043167) có 1005 trình tự (29,24%)), phân tử nhỏ (small molecule, GO: 0036094) có 736 trình tự (21,41%)), hợp chất dị vịng (heterocylic compound, GO: 1901363) có 1348 trình tự (39,22%), hợp chất hữu mạch vòng (organic cyclic compound, GO: 0097159) có 1349 trình tự (39,25%), protein gắn với carbohydrate phái sinh (carbohydrate derivative binding, GO: 0097367) có 545 trình tự (15,86%) Thành phần tế bào Hình 12 Sơ đồ mối quan hệ protein thuộc nhóm thành phần tế bào chủng Bacillus thuringiensis LM1212 44 Cấu trúc giải phẫu nội bào (GO: 0005622; có 557 trình tự (24,4%)), tế bào ngoại vi (GO: 0071944; có 637 trình tự (27,9%)), màng (GO: 0016020; có 1696 trình tự (74,29%)), tế bào chất (GO: 0005737; có 517 trình tự (22,65%)), thành phần nội màng (GO: 0031224; có 1587 trình tự (69,51%)) 3.4 Các cụm gene sinh tổng hợp cho chất chuyển hóa thứ cấp Bacillus thuringiensis LM1212 Chúng sử dụng công cụ antiSMASH 6.1.1 để phân tích trình tự gene LM1212 Kết cho thấy có 09 BGC giả định cho trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (Hình 3.13) Các cụm gene sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp giả định tóm tắt bảng 3.3, Hệ thống sinh tổng hợp NRPS, RiPP-like,… Hình 13 Kết phân tích cụm gen giả định cho trình sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp AntiSMASH Bacillus thuringiensis LM1212 45 Bảng Bảng Danh sách Các vùng gen sinh tổng hợp (BGC) chủng Bacillus thuringiensis LM1212 dự đoán antiSMASH 6.1 Vùng gen mã hố Kích thước (bp) Vùng trình tự tương đồng biết NPRS 57,874 47,157 Bacillibactin (46%) 21,853 Molybdenum cofactor (17%) Terpene RIPP 23,506 9,863 10,306 Khác Betalactone 25,238 Fengycin 40% Siderophore 13,706 Petrobactin 100% Lassopeptide 23,911 Petrobactin 100% ➢ Terpene Terpene phần lớn tìm thấy thành phần tinh dầu Chúng chủ yếu hydrocacbon Thành phần cấu tạo isoprene five-carbon (CH – C (CH 3) - CH – CH 2) Các hydrocacbon terpene phân loại theo số lượng đơn vị isoprene: ● Monoterpen: đơn vị isopren, 10 nguyên tử cacbon ● Sesquiterpenes: đơn vị isopren, 15 nguyên tử cacbon ● Diterpenes: đơn vị isopren, 20 nguyên tử cacbon ● Triterpenes: đơn vị isoprene, 30 nguyên tử carbon ● Tetraterpenes: đơn vị isoprene, 40 nguyên tử carbon 46 ➢ RiPP Quá trình sinh tổng hợp RiPP bắt đầu với trình tổng hợp peptit tiền thân ribosom Thông thường, tiền chất RiPP bao gồm vùng đầu cuối N vùng lõi đầu cuối C Nhiều RiPP đặc trưng hóa cách sử dụng phương pháp in vivo in vitro để hiểu rõ khả chịu chất tính linh động chúng Những nghiên cứu cung cấp điểm khởi đầu cho việc sử dụng enzym sinh tổng hợp RiPP để tạo hợp chất nhằm giải gia tăng tình trạng kháng kháng sinh (Graham A Hudson and Douglas A Mitchell, 2018) ➢ NRPS Các peptide sinh tổng hợp không phụ thuộc vào ribosome (NRPS) đặc biệt megaenzyme phát triển vi khuẩn nấm để tập hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học, phức tạp cao gốc peptit Ngược lại với axit nucleic phụ thuộc tổng hợp peptit / protein ribosome dựa 20-22 axit amin tạo protein, NRPS xử lý số hàng trăm đơn phân, bao gồm axit D- β-amino, axit αketo- α-hydroxy dị vòng axit béo axit, số chất khác (Marahiel et al.,2015) 3.5 Con đường sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp Bacillibactin Bacillus thuringiensis LM1212 Phân tích AntiSMASH cho thấy cụm vi khuẩn Bacillus thuringiensis LM1212 có vị trí từ 3,170,671 – 3,228,545 với 57,874 kbp Cụm thuộc NRPS gần giống với cụm gene sinh tổng hợp bacillibactin từ Bacillus subtilis subsp subtilis str 168 ( 46%) 47 Hình 14 Cụm Antismash Bacillibactin liên kết với sắt ngoại bào vận chuyển qua màng tế bào Bacillibactin bao gồm ba tiểu đơn vị 2,3-dihydroxybenzoate-glycine-threonine Các gen tham gia vào trình sinh tổng hợp bacillibactin mã hóa operon dhbACEBF Hình 3.15 mô tả đường sinh tổng hợp bacillibactin với gen dhbA, dhbC, dhbE, dhbB, dhbF Hình 15 Con đường sinh tổng hợp bacillibactin 48 Từ cụm gen sinh tổng hợp bacillibactin có chủng Bacillus subtilis subsp subtilis str 168 tìm trình tự gen đường sinh tổng hợp bacillibactin hình bên Hình 16 Vùng sinh tổng hợp vận chuyển bacillibactin chủng Bacillus subtilis subsp subtilis str 168 Sau đó, sử dụng trình tự nucleotide gen sinh tổng hợp bacillibactin làm truy vấn, tải lên Blast2GO chạy Local blast với tồn bộ gen Bacillus thuringiensis LM1212 để tìm trình tự tương đồng đường sinh tổng hợp Bacillibactin Kết hiển thị hình: Hình 17 Kết chạy local blast 49 Kết Hình 3.17 cho thấy tất gene liên quan tới đường sinh tổng hợp bacillibactin chủng Bacillus thuringiensis LM1212 với tỷ lệ tương đồng dao động từ 48-54 % Điều cho phép giả thuyết chủng Bacillus thuringiensis LM1212 tổng hợp bacillibactin 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Từ trình tự hệ gen chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis LM1212 công bố NCBI, với hỗ trợ công cụ tin sinh học, đề tài tiến hành phân tích hệ gen rút số kết luận sau: Chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis LM1212 dự đốn có 5978 gen công cụ GeneMark Hầu hết gen hệ genome chủng có mức độ tương đồng cao so với chủng thuộc loài Bacillus thuringiensis Kết phân tích cơng cụ antiSMASH 6.0.1 cho thấy chủng Bacillus thuringiensis LM1212 có BGC giả định cho q trình sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp như: Peptide sinh tổng hợp không phụ thuộc vào ribosome (NPRS) , , RiPP-like, NRPS-like, betalactone, terpene,… Từ kết tìm kiếm gen đường sinh tổng hợp bacillibactin cho phép giả định chủng Bacillus thuringiensis LM1212 có khả sinh tổng hợp chất Đề xuất Tiếp tục nghiên cứu đường sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học khác chủng Bacillus thuringiensis LM1212 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bhat M.K., “Cellulase and related enzymes in biotechnology”, Biotechnol Adv., 18, pp: 355-383, 2000 [2] Bakkali M E., Chaoui I., Zouhdi M., Melloul M., Arakrak A., Elfahime E., El Mzibri M., Laglaoui A., “Comparison of the conventional technique and 16SrDNA gene sequencing method in clinical and identification of hospital environmental isolates in Morocco”, African Journal of Microbiology Research, (50), pp: 5637-5644, 2013 [3] Marcello P., Riggio, M P., Lennon, A.,Taylor, D J., Bennett, D., “Molecular identification of bacteria associated with canine periodontal disease”, Veterinary Microbiology, 150, pp: 394–400, 2011 [4] Weisburg W G., Barns S M., Pelletier D A., Lane D J., “16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study”,J Bacteriol.173(2): pp: 697–703, 1991 [5] Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nghiêm Ngọc Minh, “Nhân dịng phân tích trình tự gene 28S rRNA chủng nấm đảm sinh tổng hợp cellulase”,Tạp chí Khoa học Công nghệ -Đại học Thái Nguyên,96(8): tr 115-118, 2012 [6] Trịnh Đình Khá, “Nhân dịng phân tích trình tự nucleotide vùng mã ITSrDNA chủng nấm phân hủy sinh học cellulose” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ -Đại học Thái Nguyên, 161 (1): tr 95-100, 2017 [7] Sambrook J and Russell D.W., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.[11] Basic Local Alignment Search Tool, truy cập http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 6/2019 52 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Số lượng gen thuộc loại chức COG Bacillus thuringiensis LM1212 Mã số Giá trị Mô tả D 47 Phân chia tế bào M 267 Thành tế bào N 35 Nhu động tế bào O 116 Sau phiên mã T 197 Truyền tín hiệu U 46 Nội bào V 138 Cơ chế bảo vệ W Cấu trúc ngoại bào Y Cấu trúc nguyên tử Z Tế bào A Sửa đổi xử lý RNA B Cấu trúc NST động học J 192 Ribosom K 408 Phiên mã L 589 Dịch mã C 214 Năng lượng tạo E 377 Amino axit vận chuyển F 100 Nucleotic vận chuyển G 242 Cacbohydrat vận chuyển H 126 Coenzym vận chuyển I 107 Lipit vận chuyển P 258 Inorganic ion vận chuyển Q 79 Chuyển hóa thứ cấp R Chức chung S 1921 X Không trùng khớp 53 Phụ lục Biểu đồ phân loại chức COG (EZBioCloud) 54 Phụ lục Mã màu cho chức gene trình bày bàng 4.2 55 a Quá trình sinh học cấp độ b Chức phân tử cấp độ 56 c Thành phần tế bào cấp độ Phụ lục Danh mục biểu đồ tròn gen LM1212 từ Blast2GO (GO) A Quá trình sinh học, b Chức phân tử, c Thành phần tế bào 57