HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI : PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN VÙNG RỄ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐỐM ĐEN TRÊN CÂY CÀ CHUA Họ tên : Nguyễn Thị Mai Huyền Lớp : K63CNSHD MSV : 637413 GVHD : ThS Trần Thị Hồng Hạnh HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nghiên cứu em kết trình bày khóa luận hồn toàn trung thực chƣa đƣợc sử dụng công bố Em cam đoan thơng tin trích dẫn khóa luận đƣợc rõ nguồn gốc giúp đỡ cho việc thực khoá luận đƣợc cảm ơn Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Mai Huyền i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình nghiên cứu đề tài, tơi nhận đƣợc hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình thầy động viên gia đình bạn bè Vì cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến ThS Trần Thị Hồng Hạnh tận tình hƣớng dẫn dành nhiều công sức dẫn giúp đỡ thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn giảng viên toàn cán bộ, nhân viên Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân, bạn bè giúp đỡ, động viên khuyến khích tơi mặt để tơi hồn thành luận văn cách thuận lợi Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Mai Huyền ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình sản xuất tiêu thụ cà chua 2.1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ cà chua giới 2.1.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ cà chua Việt Nam 2.2 Cây cà chua 2.2.1 Giới thiệu chung cà chua 2.2.2 Bệnh hại cà chua 2.3 Bệnh đốm đen vi khuẩn 11 2.4 Giới thiệu vi khuẩn Xanthomonas vesicateria 13 2.4.1 Vi khuẩn Xanthomonas vesicateria 13 2.4.2 Cơ chế lây nhiễm bệnh đốm đen vi khuẩn cà chua 14 2.5 Phƣơng pháp quản lí dịch hại 16 2.6 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nƣớc nƣớc 17 2.6.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 17 2.6.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 20 iii CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu nghiên cứu 22 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 22 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất sử dụng 22 3.2 Môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 22 3.3 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu 23 3.3.2 Phƣơng pháp phân lập 23 3.3.3 Phƣơng pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo 24 3.3.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh đốm chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cà chua 25 3.3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu số đặc điểm hình thái sinh học chủng vi khuẩn gây bệnh chủng đối kháng 26 3.3.6 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng đến khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn đối kháng 31 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh 32 4.2 Tái lây nhiễm chủng vi khuẩn chọn lọc từ mẫu bệnh 34 4.3 Phân lập vi khuẩn vùng rễ đối kháng với vi khuẩn gây bệnh cà chua 35 4.4 Khả đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cà chua với vi khuẩn gây bệnh 36 4.5 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn 38 4.5.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn đối kháng 38 4.5.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn gây bệnh chủng vi khuẩn đối kháng 39 iv 4.6 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn đối kháng 40 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 53 v DANH MỤC BẢNG Bảng Số liệu thống kê diện tích sản lƣợng suất cà chua số tỉnh thành Việt Nam năm 2017 Bảng Đặc điểm hình thái 05 chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh 34 Bảng Đặc điểm hình thái 03 chủng vi khuẩn đối kháng HD05, HD23, HD24 với chủng vi khuẩn gây bệnh GL02 38 Bảng Kết đánh giá đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn gây bệnh chủng vi khuẩn đối kháng 39 vi DANH MỤC HÌNH Hình Bệnh héo vi khuẩn cà chua Hình 2 Bệnh cháy cà chua Hình Bệnh mốc sƣơng mai cà chua Hình Bệnh đốm Septoria hại cà chua Hình Bệnh thán thƣ cà chua 10 Hình 6: Bệnh cà chua xoăn vàng 10 Hình Triệu chứng bệnh đốm đen vi khuẩn 12 Hình Mơ hình minh họa chu kì lây bệnh vi khuẩn Xanthomonas vesicateria cà chua 15 Hình Hình thái khuẩn lạc số chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh 33 Hình Kết tái lây nhiễm bệnh chủng GL02 35 Hình Hình ảnh số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cà chua 36 Hình 4 Kết sàng lọc chủng vi khuẩn vùng rễ có khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh 37 Hình Sự phát triển chủng vi khuẩn đối kháng HD23 nhiệt độ 30 °C, 37 °C 45 °C 42 vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Biểu đồ thể ảnh hƣởng nồng độ pH đến mật độ vi khuẩn sau 24 nuôi cấy 40 Biểu đồ Biểu đồ thể ảnh hƣởng nồng độ muối đến mật độ vi khuẩn sau 24 nuôi cấy 41 Biểu đồ Biểu đồ thể ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến mật độ vi khuẩn sau 24 nuôi cấy 42 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT LB : Luria Bertani FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations l : microlit g/l : gam/lít CFU : Colony Forming Unit PGPR : Plant growth - promoting rhizobacteria YDC : Yeast – dextrose - calcium carbonate PCA : Potato - carrot – agar VP : Voges-Proskauer MR : Methyl Red BLS : Bacteria leaf spot ix Microbiology, 13(1), 1–12 Retrieved from: https://doi.org/10.1186/1471-218013-114/FIGURES/7 47 Paret, M L., Vallad, G E., Averett, D R., Jones, J B., & Olson, S M (2013) Photocatalysis: Effect of Light-Activated Nanoscale Formulations of TiO2 on Xanthomonas perforans and Control of Bacterial Spot of Tomato Retrieved from: https://doi.org/10.1094/PHYTO-08-12-0183-R 48 Petra Wakefield (2018) How I Isolate Bacteria From Soil? Sciencing Retrieved from: https://sciencing.com/do-isolate-bacteria-soil-6918955.html 49 Petrocelli, S., Tondo, M L., Daurelio, L D., & Orellano, E G (2012) Modifications of Xanthomonas axonopodis pv citri Lipopolysaccharide Affect the Basal Response and the Virulence Process during Citrus Canker PLOS ONE, 7(7), e40051 Retrieved from: https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PONE.0040051 50 Pohronezny, Volin, & R.B (1984) The effect of bacterial spot on yield and quality of fresh market tomatoes [Xanthomonas campestris] National Agricultural Library Retrieved from: https://agris.fao.org/agris- search/search.do?recordID=US8265163 51 Poplawsky, A R (1993) A Xanthomonadin-Encoding Gene Cluster for the Identification of Pathovars of Xanthomonas campestris Molecular PlantMicrobe Interactions, 6(5), 545 Retrieved from: https://doi.org/10.1094/MPMI6-545 52 Potnis, N., Timilsina, S., Strayer, A., Shantharaj, D., Barak, J D., Paret, M L., Vallad, G E., & Jones, J B (2015) Bacterial spot of tomato and pepper: diverse Xanthomonas species with a wide variety of virulence factors posing a worldwide challenge Molecular Plant Pathology, 16(9), 907 Retrieved from: https://doi.org/10.1111/MPP.12244 53 Promnuan, Y., Promsai, S., Pathom-Aree, W., & Meelai, S (2021) Apis andreniformis associated Actinomycetes show antimicrobial activity against 50 black rot pathogen (Xanthomonas campestris pv campestris) PeerJ, Retrieved from: https://doi.org/10.7717/PEERJ.12097 54 Rashid, T S., Sijam, K., Awla, H K., Saud, H M., & Kadir, J (2016) Pathogenicity Assay and Molecular Identification of Fungi and Bacteria Associated with Diseases of Tomato in Malaysia In American Journal of Plant Sciences (Vol 07, Issue 06, pp 949–957) https://doi.org/10.4236/ajps.2016.76090 55 Ritchie, D (2000) Bacterial spot of pepper and tomato Plant Health Instructor 56 Romer, P , (2009) Recognition of AvrBs3‐like proteins is mediated by specific binding to promoters of matching pepper Bs3 alleles Plant Physiol, 150, 1967-1972 57 Romero, A M (2001) Resistance to bacterial spot in bell pepper induced by acibenzolar-S-methyl Plant Disease, 85, 189-194 58 Sahin, F., & Miller, S A (1997) A New Pathotype of Xanthomonas campestris pv armoraciae That Causes Bacterial Leaf Spot of Radish Plant Disease, 81(11), 1334 Retrieved from: https://doi.org/10.1094/PDIS.1997.81.11.1334C 59 Sahin, F., & Miller, S A (1998) Resistance in Capsicum pubescens to Xanthomonas campestris pv vesicatoria Pepper Race Plant Disease, 82(7), 794–799 Retrieved from: https://doi.org/10.1094/PDIS.1998.82.7.794 60 Shivananda Jambenal, M Ravikumar, & N Hiremani (2011) Basic studies on Xanthomonas campestris pv viticola causing bacterial leaf spot of grape and evaluated in-vitro efficacy of different chemicals and bioagents against its growth | Semantic Scholar Semantis Scholar 61 Sorensen, K a (1983) insects and related pest of Vegetables the north carolina agricultural extension service, 173 62 Weerapol, Y., Nimraksa, H., Paradornuwat, A., & Sriamornsak, P (2019) 51 Development of ready-to-use products derived from Bacillus subtilis strain CMs026 for plant disease control BioControl 2019 64:2, 64(2), 173–183 Retrieved from: https://doi.org/10.1007/S10526-019-09929-1 63 Williams, A G (1983) Staining reactions for the detection of hemicellulose-degrading bacteria FEMS Microbiology Letters, 20(2), 253–258 Retrieved from: https://doi.org/10.1111/J.1574-6968.1983.TB00127 64 Z J Ren, A C (2017) First Report of Alternaria alternata Causing Black Spot on Tomato (Solanum lycopersicum) in Tongzhou, China APS Publications, 101, 1680 52 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Kết phân lập - Phân lập mẫu bệnh Nồng độ 10-2 Nồng độ 10-3 - Phân lập mẫu đất Nồng độ 10-2 Nồng độ 10-3 PHỤ LỤC 2: Kết tái lây nhiễm Ghi : A : Kết tái lây nhiễm mặt trước chủng GL02 B : Kết tái lây nhiễm mặt sau chủng GL02 53 Nồng độ 10-4 Kết tái lây nhiễm sau ngày mặt trƣớc mặt sau cà chua Kết tái lây nhiễm nhủng GL01 GL03 sau ngày Kết tái lây nhiễm chủng vi khuẩn GL04 GL05 sau ngày 54 PHỤ LỤC 3: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn gây bệnh Khả di động Thử nghiệm Citrate Khả catalase Thử nghiệm MR Thử nghiệm VP Khả sinh Indole Khả sinh Nitrate Phân giải CMC 55 sinh Phân giải casein Phân giải tinh bột PHỤ LỤC 4: Đặc điểm sinh lý sinh hóa ba chủng vi khuẩn đối kháng Khả di động Thử nghiệm Citrate Thử nghiệm Catalase Thử nghiệm MR Thử nghiệm VP Thử nghiệm Nitrate 56 Thử khả sinh indole Phân giải CMC Phân giải tinh bột Phân giải casein 57 PHỤ LỤC 5: Điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến phát triển mật độ khuẩn lạc  Ảnh hƣởng nhiệt độ - Nhiệt độ 30 °C - Nhiệt độ 35 °C 58 - Nhiệt độ 45 °C  Ảnh hƣởng nồng độ pH - Chủng vi khuẩn đối kháng HD05 - Chủng vi khuẩn đối kháng HD23 59 - Chủng vi khuẩn đối kháng HD24  Ảnh hƣởng nồng độ muối - Nồng độ muối 5% - Nồng độ muối 10% 60 - Nồng độ muối 15% - Nồng độ muối 20%  Ảnh hƣởng môi trƣờng môi cấy - Môi trường King’s B 61 - Mơi trường SPA PHỤ LỤC 6: Hoạt tính đối kháng 24 chủng vi khuẩn 62 PHỤ LỤC 7: Hình ảnh chủng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ cà chua 63 64