HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG Arthrospira platensis TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Hà Nội, tháng 09 năm 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG Arthrospira platensis TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Sinh viên thực : Nguyễn Trung Dũng Mã sinh viên : 637020 Giảng viên hƣớng dẫn : TS Nguyễn Thị Nhiên TS Phí Thị Cẩm Miện Địa điểm thực : Viện nghiên cứu Vi tảo Dƣợc mỹ phẩm Hà Nội, tháng 09 năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trƣớc Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Trung Dũng i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, nỗ lực cố gắng thân, tơi nhận đƣợc giúp đỡ, động viên tích cực từ cá nhân, tập thể Trong thời gian thực tập Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhận đƣợc quan tâm, bảo tận tình Thầy, cán phịng thí nghiệm Cùng với cố gắng, nỗ lực thân học kinh nghiệm tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học tồn thể Thầy, Cơ truyền đạt cho kiến thức chuyên ngành, kỹ làm việc phịng thí nghiệm học quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Nhiên tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, quan tâm tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn anh, chị, bạn bè làm việc môn sinh học tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến bổ ích tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Mặc dù cố gắng hồn thiện luận văn nhiệt tình, lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đƣợc đóng góp quý thầy bạn để tơi hồn thành khóa luận đƣợc tốt Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Trung Dũng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi TÓM TẮT vii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung tảo 2.1.1 Đặc điểm hình thái tảo xoắn A.platensis 2.1.2 Vị trí phân loại 2.1.3 Đặc điểm sinh trƣởng sinh sản 2.1.4 Giá trị dinh dƣỡng tảo xoắn thành phần hóa học 2.2 Nhân giống hình thức ni tảo xoắn A.platensis 13 2.2.1 Khái niệm nhân giống 13 2.2.2 Các mơ hình nhân giống 13 2.2.3 Các hình thức ni tảo 19 2.3 Các phƣơng pháp phân lập tảo 21 2.3.1 Phƣơng pháp vi thao tác 21 2.3.2 Phƣơng pháp cấy trải đĩa thạch 22 2.4 Nghiên cứu tảo xoắn Arthrospira platensis Việt Nam giới 22 2.4.1 Lịch sử nghiên cứu tảo xoắn A.platensis Việt Nam 22 2.4.2 Lịch sử nghiên cứu nuôi A.platensis giới 24 iii PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 3.1 Vật liệu nghiên cứu 28 3.1.1.Chủng giống 28 3.1.2 Máy móc, thiết bị nghiên cứu 28 3.1.3 Hóa chất 28 3.2 Địa điểm nghiên cứu thời gian thực 29 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 29 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 29 3.3 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 30 3.3.2 Xử lí số liệu 35 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết thu thập mẫu 36 4.2 Kết ly tâm loại bỏ sinh vật lẫn tạp mẫu tảo xoắn A platensis thu thập Hà Nội, Lạng Sơn Ninh Bình 37 4.3 Kết làm phƣơng pháp pha loãng 37 4.4 Quan sát đƣợc đặc điểm hình thái 38 4.5 Đánh giá khả sinh trƣởng chủng tảo xoắn phân lập 39 4.6 Đánh giá hoạt chất tiêu dinh dƣỡng có mẫu tảo phân lập 44 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần hóa học tảo A.platensis 10 Bảng 2.2: Thành phần vitamin tảo A.platensis 10 Bảng 2.3: Thành phần khoáng chất tảo A.platensis 11 Bảng 2.4: Thành phần acid amin tảo A.platensis 12 Bảng 2.5: Các sắc tố tảo A.platensis 12 Bảng 4.1 Tảo xoắn A platensis thu thập độ phóng đại 100 X 36 Bảng 4.2: Đánh giá ngƣỡng sinh trƣởng ba chủng tảo xoắn thu thập (Sp2, Sp6, sp9) 40 Bảng 4.3 Khả sinh trƣởng chủng A.platensis dải nhiệt độ từ 10-40C 41 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Hình thái chủng Arthrospira phân lập hồ Kailala (Cộng hòa Chad) Hình 2.2: Các hình thái khác Arthrospira phân lập hồ Kailala (Cộng hòa Chad) Error! Bookmark not defined Hình 2.3: Cấu trúc thẳng lỏng lẻo Arthrospira maxima phân lập từ Hồ Texoco (Mexico) Thang đo: A = 40 mm, B = 20 mm (ảnh C Sili) Hình 2.4: Hai dạng xoắn tảo A.platensis Hình 2.5: Các dạng hình thái tảo A.platensis Hình 2.6: Các pha sinh trƣởng vi tảo Hình 2.7: Vịng đời tảo A.platensis Hình 2.8 Hệ thống nhân giống túi nylon 14 Hình 2.9 Hệ thống photobioreactor dạng cột (bubble column) 17 Hình 2.10: Các bƣớc chuẩn bị pipet paster để phân lập 22 Hình 3.1: Sơ đồ tách dịng chọn lọc dòng 31 Hình 4.1: Ba mẫu tảo xoắn sau làm cấy đĩa petri sau tuần nuôi cấy 38 Hình 4.2: Ba chủng tảo xoắn thu thập độ phóng đại 100X (A) Chủng tảo xoắn A platensis thu thập Hà Nội; (B) Chủng tảo xoắn A.platensis thu thập Lạng Sơn; (C) Chủng tảo xoắn A.platensis thu thập Ninh Bình 38 Hình 4.3: Hình thái tảo xoắn A.plantsis kính hiển vi 39 Hình 4.4: Mối tƣơng quan khối lƣợng khô độ hấp thụ quang học tảo A.platensis (số liệu hiển thị cho điểm OD750/khối lƣợng khơ) 43 Hình 4.5 Biến động pH tƣơng ứng với tốc độ tăng trƣởng tảo theo thời gian nuôi 45 vi TÓM TẮT Tên đề tài: Đề tài nghiên cứu “Phân lập xác định số đặc điểm sinh học chủng Arthrospira platensis miền Bắc Việt Nam” Giảng viên hƣớng dẫn: TS Nguyễn Thị Nhiên, TS Phí Thị Cẩm Miện Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Dũng Lớp: K63CNSHA Khóa: 63 Khoa: Cơng nghệ sinh học Tóm tắt báo cáo Mục đích đề tài: Thu thập mẫu phân lập, làm mẫu tảo thu đƣợc từ xác định đƣợc hình thái chủng tảo xoắn đánh giá đƣợc khả sinh trƣởng tảo, đánh giá đƣợc hoạt chất, tiêu dinh dƣỡng có mẫu tảo Phƣơng pháp nghiên cứu: Thu thập mẫu hồ miền Bắc, sau bảo quản điều kiện 20ºC đem phịng thí nghiệm Sau thu thập tảo đem phịng thí nghiệm, tiến hành phân lập, làm mẫu tảo chọn lọc dịng từ đánh giá khả sinh trƣởng mẫu tảo Đánh giá khả thu sinh khối sau pha Log Kết quả: Kết thu thập mẫu cho thấy tảo nhiễm nhiều tạp chất, loài tảo khác nhau, vi sinh vật và mẫu thu thập đƣợc quần thể đơn bào đa bào Ly tâm loại bỏ vi sinh vật lẫn tạp mẫu tảo sau tuần cho thấy môi trƣờng Zarrok phù hợp Kết sau 3-4 lần pha loãng cấy chải, tảo đƣợc làm hoàn toàn, quan sát đƣợc đặc điểm hình thái trạng thái sinh lí, đồng tảo, mức độ tạp nhiễm, mật độ cao Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh trƣởng ba chủng tảo, khả chịu nhiệt Tƣơng quan mật độ quang khối lƣợng tảo khô Đánh giá đƣợc hoạt chất tiêu dinh dƣỡng có mẫu tảo phân lập vii Kết luận: Kết phân lập chủng tảo xoắn A.platensis miền Bắc Việt Nam thu thập đƣợc chủng vi tảo Sp2, Sp6 Sp9 Các chủng đƣợc phân lập làm thuần, lƣu trữ đĩa thạch Sp2 dạng hình thoi, tảo có số vịng xoắn chiều dài sợi (trichome) dao động từ – 10 vịng Chủng Sp6 có số vòng xoắn dao động từ 10 – 12 vòng, xoắn nhẹ, Chủng Sp9 dạng sợi xoắn ốc đều, từ 16 – 20 vòng xoắn, sợi dài, phù hợp với phƣơng thức nuôi nhƣ thu hoạch điều kiện miền Bắc nƣớc ta Việc xác định khối lƣợng khô khơng có ý nghĩa mặt tính tốn trạng thái sinh lý, suất thực tế mà sở để điều chỉnh thành phần môi trƣờng sau tái sử dụng để bổ sung dinh dƣỡng đảm bảo cho tảo sinh trƣởng tốt qua lần thu hoạch viii Thời gian theo ngày t Xt sinh khối (g/L) thời điểm t0 Tốc độ sinh trƣởng riêng hay đặc trƣng (µ) đƣợc xác định μ = ln (Xt /X0 )/ (t – t0 ) tảo sinh trƣởng pha logarit 3.3.2 Xử lí số liệu Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại lần để phân tích giá trị trung bình độ lệch chuẩn (SD) Chƣơng trình Microsolf Excel (2016) đƣợc sử dụng để vẽ đồ thị 35 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thu thập mẫu Qua khảo sát điều tra, thu thập đƣợc 10 chủng tảo xoắn A.platensis địa bàn Hà Nội, Lạng Sơn Ninh Bình Kết nghiên cứu cho thấy, mẫu tảo xoắn thu thập bị lẫn tạp nhiều loài tảo khác nhƣ tảo lục, vi sinh vật mẫu đƣợc thu thập đƣợc quần thể tảo đơn bào đa bào Qua quan sát phân tích sơ mặt hình thái, kết nhóm nghiên cứu tìm thấy chủng tảo xoắn 10 mẫu nƣớc thu thập Bảng 4.1 Tảo xoắn A platensis thu thập độ phóng đại 100 X TT Nguồn gốc Hồ Thuyền Kí hiệu Sp2 Đặc điểm hình thái Xoắn dài, số Quang lƣợng (Hà Nội) xoắn khoảng 15- vòng 16 vịng Hồ cơng Sp6 Tồn dạng viên Hoàng thẳng xoắn, Văn xoắn Thụ (Lạng Sơn) khoảng nhẹ 6-10 vòng xoắn Hồ Tràng An (Ninh Sp9 Dạng sợi xoắn cột trịn tạo búi Bình) 36 Kiểu hình đặc trƣng 4.2 Kết ly tâm loại bỏ sinh vật lẫn tạp mẫu tảo xoắn A platensis thu thập Hà Nội, Lạng Sơn Ninh Bình Kết phân tích quan sát dƣới kính hiển vi cho thấy, mẫu nƣớc thu đƣợc chứa nhiều vi khuẩn lƣợng lớn vi sinh vật đa dạng Nhằm loại bỏ vi sinh vật phù du sinh vật đơn bào, mẫu tảo thu thập đƣợc ly tâm tốc độ thấp (500 - 1000 vòng/phút) lặp lặp lại, loại bỏ tới 90% số lƣợng sinh vật phù du vi sinh vật đơn bào Kết quả, tảo xoắn A.platenis đƣợc tìm thấy pha khối Các mẫu tảo sau ly tâm đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy khác (Zarrouk, môi trƣờng nƣớc biển) Kết sau tuần cho thấy, môi trƣờng nuôi phù hợp Zarrouk, điều kiện pH kiềm (9,5) Sau tuần, tảo xoắn sinh trƣởng với vài lồi tảo khác mơi trƣờng Zarrouk Để rút ngắn thời gian làm giống tảo xoắn A.platenis thu thập phƣơng pháp làm giảm mật độ tảo trình chọn lọc kỹ thuật phù hợp để tách tảo xoắn khỏi loài tảo nhiễm tạp khác 4.3 Kết làm phƣơng pháp pha loãng Ba mẫu tảo sau ly tâm, xử lý hoá học đƣợc nhân lên pha loãng nối tiếp để chọn lọc dịng Kết pha lỗng dựa sở đánh giá mật độ quan sát đồng thời dƣới kính hiển vi Ba mẫu tảo đƣợc pha lỗng liên tục theo cấp số nhân mơi trƣờng Zarrouk mật độ tảo đủ loãng để tế bào tách riêng rẽ, cấy trải đĩa petri chứa môi trƣờng Zarrouk thạch rắn, nuôi 25°C với cƣờng độ ánh sáng 2000 lux để tảo phát triển, nhân lên hình thành khuẩn lạc Khi xuất khuẩn lạc, khuẩn lạc đƣợc quan sát hình thái dƣới kính hiển vi để phân tích đặc điểm chủng tảo Sau đến lần pha loãng cấy trải, tảo đƣợc làm hoàn toàn khỏi loài tảo khác nhƣ vi sinh vật đƣợc kiểm tra độ giống thu thập 37 Hình 4.1: Ba mẫu tảo xoắn sau làm cấy đĩa petri sau tuần ni cấy B A C Hình 4.2: Ba chủng tảo xoắn thu thập độ phóng đại 100X (A) Chủng tảo xoắn A platensis thu thập Hà Nội; (B) Chủng tảo xoắn A platensis thu thập Lạng Sơn; (C) Chủng tảo xoắn A.platensis thu thập Ninh Bình 4.4 Quan sát đƣợc đặc điểm hình thái Chất lƣợng tảo giống cấp đƣợc định yếu tố sau: - Trạng thái sinh lý tảo: Quan sát dƣới kính hiển vi, tảo có màu xanh lam đậm, màu sắc đồng tất tế bào sợi Tảo phải giai đoạn phát triển logarit, quan sát dƣới kính hiển vi khơng thấy xác tảo chết 38 - Độ đồng tảo: Chiều dài sợi, số vòng xoắn phải đồng toàn mẫu, điều đảm bảo tảo đồng pha đồng tuổi giống - Mức độ tạp nhiễm: Sự có mặt tảo tạp, nguyên sinh động vật hay loại ăn tảo - Mật độ tảo: Mật độ tảo giống thƣờng phải đủ lớn (OD750 từ 0,4 đến 0,7 cao nhƣng khơng q 0,9) Hình 4.3: Hình thái tảo xoắn A.plantsis kính hiển vi 4.5 Đánh giá khả sinh trƣởng chủng tảo xoắn phân lập Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh trƣởng ba chủng tảo xoắn thu thập Các chủng tảo khiết đƣợc ni điều kiện thí nghiệm khoảng nhiệt độ từ 12°C đến 40°C để đánh giá ngƣỡng nhiệt sinh trƣởng, khả chịu lạnh, mức độ xoắn tốc độ sinh trƣởng khoảng nhiệt độ khác Ba chủng tảo thu thập có ngƣỡng nhiệt sinh trƣởng rộng, chủng Sp6 có khả thích ứng điều kiện lạnh hơn, có khả sống sinh trƣởng chậm điều kiện lạnh (12°C), chủng lại chịu lạnh nhƣng khả thích ứng điều kiện nóng tốt hơn, sinh trƣởng đƣợc điều kiện nóng đến 40°C điều kiện khí hậu miền Bắc nƣớc ta Về đặc điểm hình thái, chủng Sp2 dạng hình thoi (fusiform), tảo có cao độ xoắn chiều dài sợi (trichome) khác Chủng Sp6 có xoắn ốc thơng thƣờng nhƣng chiều dài sợi khác nhau, đƣờng kính xoắn cao độ xoắn thấp Chủng Sp9 dạng sợi xoắn ốc mảnh, sợi dài, phù 39 hợp với điều kiện khí hậu phƣơng thức nuôi nhƣ thu hoạch điều kiện miền Bắc nƣớc ta Bảng 4.2: Đánh giá ngưỡng sinh trưởng ba chủng tảo xoắn thu thập (Sp2, Sp6, sp9) Tên Ngƣỡng Nhiệt Nhiệt độ dòng nhiệt độ độ tối thấp đánh sinh trƣởng ƣu sinh trƣởng giá (°C) (°C) (°C) Sp2 15 - 40 37 ± Sp6 12 - 38 Sp9 17 - 40 STT Mức Chiều dài độ sợi tối đa xoắn (µm) 15 +++ 145 36 ± 12 ++ 156 37 ± 15 +++ 200 Chú thích: ++: 50 - 75%; +++: 75 - 100% Khả chịu nhiệt chủng Các dòng sau làm đƣợc đƣa vào nuôi trồng để đánh giá mức độ khiết Khả sinh trƣởng dòng phụ thuộc vào điều kiện nuôi trồng nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, môi trƣờng tiềm sinh trƣởng khả thích ứng chúng Tốc độ sinh trƣởng nhanh, khả thích ứng rộng phù hợp với sản xuất quy mô công nghiệp, giảm tạp nhiễm q trình ni Trong thí nghiệm này, giải nhiệt độ từ 37-40°C đƣợc thử nghiệm để đánh giá khả sinh trƣởng chủng điều kiện nuôi cấy khiết Với mật độ ban đầu 0,1 g/l tính theo khối lƣợng khơ, thực bình thủy tinh 500 ml, thể tích ni 300 ml, CO2 đƣợc cung cấp thơng qua máy nén khí, khí đầu vào đƣợc lọc vơ trùng, cƣờng độ chiếu sáng 10.000 lux Quan sát hình thái kính hiển vi, kết hợp với đo mật độ tế bào để đánh giá khả sinh trƣởng thích ứng vi tảo giải nhiệt độ khác Các thông số đƣợc đo lần/ngày sau bắt đầu tiếp giống Khả sinh trƣởng chủng A.platensis dải nhiệt độ từ 37-40°C đƣợc thể 40 Bảng 4.3 Khả sinh trưởng chủng A.platensis dải nhiệt độ từ 10-40C Nhiệt độ nuôi (°C) Mật độ (g khô/l) Tốc độ sinh trƣởng riêng cao (thế hệ/ngày) Mức độ xoắn Chủng Sp2 10 - - + 15 0,61 0,014  0,002 ++ 20 1,10 0,037  0,018 +++ 25 1,60 0,068 0,021 +++ 30 1,72 0,094  0,012 +++ 37 1,81 0,093 0,014 +++ 40 1,66 0,071 0,013 ++ Chủng Sp6 10 0,28 - + 15 0,41 0,017  0,009 + 20 0,80 0,041 0,013 + 25 1,10 0,064 0,012 + 30 1,52 0,097  0,014 + 37 1,68 0,089  0,015 + 40 1,36 0,021  0,007 + Chủng Sp9 10 - - ++ 15 0,52 0,019  0,009 ++++ 20 0,84 0,051 0,013 ++++ 25 1,10 0,067 0,014 ++++ 30 1,72 0,113  0,012 ++++ 37 1,81 0,112  0,015 ++++ 40 1,26 0,031  0,011 +++ 41 Lưu ý: Mật độ xác định thời điểm ngày thứ 14 sau cấy giống Khi nhiệt độ > 40C tảo ngừng sinh trƣởng bắt đầu có dấu hiệu chết Giai đoạn trình sục khí loại bỏ O2 cần liên tục (tốc khuấy trộn tăng) đồng thời giảm cƣờng độ chiếu sáng cách che lƣới đen Tốc độ sinh trƣởng cao chủng Sp2: Nhiệt độ nuôi (⁰C): 37⁰C Mật độ (g khô/l): 1,81 Tốc độ sinh trƣởng riêng cao (thế hệ/ngày): 0,093±0,014 Mức độ xoắn: +++ Sp6: Nhiệt độ nuôi (°C): 30°C Mật độ (g khô/l): 1,68 Tốc độ sinh trƣởng riêng cao (thế hệ/ngày): 0,097±0,014 Mức độ xoắn: + Sp9: Nhiệt độ nuôi (°C): 37°C Mật độ (g khô/l): 1,81 Tốc độ sinh trƣởng riêng cao (thế hệ/ngày): 0,113±0,012 Mức độ xoắn: ++++ Sau ngày tiếp giống, tảo bắt đầu tăng sinh khối, quần thể tảo sinh trƣởng mạnh từ ngày thứ liên tục tăng trƣởng ngày thứ 15 màu sắc bình ni chuyển sang màu xanh sẫm thời điểm cuối pha sinh trƣởng logarit Nhƣ vào giai đoạn ngày thứ 13-14 thời điểm thu hoạch cho suất sinh khối cao Ở ngƣỡng nhiệt độ cao, nhìn chung tảo có xu hƣớng giảm đáng kể trạng thái xoắn, tỉ lệ tảo chuyển sang trạng thái thẳng tăng Ở trạng thái thẳng sợi tảo mỏng có kích thƣớc ngắn so với trạng thái xoắn Điều làm việc thu sinh khối trở nên khó hơn, có sợi mỏng thẳng dễ qua màng lọc so với sợi xoắn Tƣơng quan mật độ quang khối lƣợng tảo khô 42 Tốc độ tăng trƣởng đƣợc xác định giá trị mật độ quang đo đƣợc bƣớc sóng 750 nm Huyền phù tảo xoắn cuối giai đoạn sinh trƣởng logarit gần chuyển sang giai đoạn cân đƣợc sử dụng để xác định khối lƣợng khô đồng thời đo độ hấp thụ quang bƣớc sóng 750 nm (OD750) Mật độ tảo (OD750) đo đƣợc đạt sau 10 ngày nuôi trồng; khối lƣợng khô đạt 1,2 g/lít dịch tảo Kết nghiên cứu cho thấy, giá trị OD750 = 1,32 thu đƣợc cao điều kiện ni thí nghiệm sản xuất quy mơ pilot Đồng thời, ngƣỡng hấp thụ quang cao đảm bảo tn theo phƣơng trình tuyến tính Ở ngƣỡng OD750 > 1,35 mối tƣơng quan rõ, thực tế cần phải pha loãng để đảm bảo mối tƣơng quan nằm vùng tuyến tính Nhiều nghiên cứu thử nghiệm bƣớc sóng ánh sáng khác để đánh giá trình tăng suất xác định tốc độ sinh trƣởng tảo A platensis điều kiện nuôi khác (Melinda et al , 2011) Mặc dù có sai khác không đáng kể kết phân tích mối tƣơng quan mật độ tảo khối lƣợng khô số nghiên cứu (Tôn Thất Pháp & cs., 2009), nhiên việc lựa chọn bƣớc sóng ánh sáng để hạn chế ảnh hƣởng sắc tố có mặt tảo chẳng hạn nhƣ Chla, nhóm carotenoid phycocyanin Hình 4.4: Mối tương quan khối lượng khô độ hấp thụ quang học tảo A platensis (số liệu hiển thị cho điểm OD750/khối lượng khô) 43 Việc nghiên cứu mối tƣơng quan có ý nghĩa thực tiễn sản xuất triển khai nuôi tảo quy mô công nghiệp Việc xác định khối lƣợng khơ khơng có ý nghĩa mặt tính tốn trạng thái sinh lý, suất thực tế mà sở để điều chỉnh thành phần môi trƣờng sau tái sử dụng để bổ sung dinh dƣỡng đảm bảo cho tảo sinh trƣởng tốt qua lần thu hoạch Do tảo xoắn A platensis có cấu trúc sợi gồm nhiều tế bào liên kết với nên việc xác định số lƣợng tế bào khơng phù hợp Do đó, việc đo mối tƣơng quan OD với khối lƣợng tảo khô đƣợc xây dựng sở đo giá trị OD dịch tảo pha loãng liên tục 2, 4, 8, 16 32 lần từ dịch huyền phù tảo ban đầu môi trƣờng Zarrouk Đồ thị tƣơng quan độ hấp thụ quang học mật độ tảo khác (OD750) với khối lƣợng khô đƣợc xây dựng theo phƣơng trình tuyến tính dạng y = ax + b với hệ số tƣơng quan R 4.6 Đánh giá hoạt chất tiêu dinh dƣỡng có mẫu tảo phân lập Tối ƣu pH q trình ni Giống tảo đƣợc ni mơi mơi trƣờng Zarrouk pH 9,5 Trong q trình ni, sinh trƣởng tảo kèm với tăng dần pH Trong khoảng 14 ngày, pH tăng từ 9,5 đến 10 điều kiện không bổ sung thêm CO2 hay NaHCO3 Trong ngƣỡng pH này, tảo sinh trƣởng phát triển tốt Khi hàm lƣợng NaHCO3 môi trƣờng dần tảo hấp thu trình sinh trƣởng dƣới dạng bay hơi, pH mơi trƣờng tăng dần, lên tới 11 Ở giá trị pH này, tảo sinh trƣởng chậm ngừng sinh trƣởng pH vƣợt 11 Do đó, trình ni, việc trì pH CO2 NaHCO3 giúp tảo sinh trƣởng tốt không bị nhiễm tảo khác cạnh tranh mật độ 44 Hình 4.5 Biến động pH tương ứng với tốc độ tăng trưởng tảo theo thời gian nuôi Khi nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến tốc độ sinh trƣởng, ngƣỡng pH khác đƣợc thử nghiệm từ 8,5 đến 11 chủng Sp6 Kết thu đƣợc trình bày bảng sau Các thơng số Tốc độ sinh trƣởng pH môi trƣờng nuôi ban đầu 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 1,12 1,27 1,32 1,35 1,25 0,26 0,98 1,13 1,21 1,21 1,17 0,65 13 ± 12 ± 10 ± riêng (µ) Mật độ tối đa (OD750) Thời điểm thu hoạch (ngày) (*) Mật độ thấp thu hoạch 45 10 ± 11 ± (*) PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Kết phân lập chủng tảo xoắn A.platensis miền Bắc Việt Nam thu thập đƣợc chủng vi tảo Sp2, Sp6 Sp9 Các chủng đƣợc phân lập làm thuần, lƣu trữ đĩa thạch Về đặc điểm hình thái, chủng Sp2 dạng hình thoi (fusiform), tảo có số vịng xoắn chiều dài sợi (trichome) dao động từ – 10 vịng Chủng Sp6 có số vịng xoắn dao động từ 10 – 12 vòng, xoắn nhẹ, nhiên chiều dài sợi khác Chủng Sp9 dạng sợi xoắn ốc đều, từ 16 – 20 vòng xoắn, sợi dài, phù hợp với điều kiện khí hậu phƣơng thức ni nhƣ thu hoạch điều kiện miền Bắc nƣớc ta Chủng Sp6 có khả thích ứng điều kiện lạnh hơn, có khả sống sinh trƣởng chậm điều kiện lạnh (12°C), chủng lại chịu lạnh nhƣng khả thích ứng điều kiện nóng tốt hơn, sinh trƣởng đƣợc điều kiện nóng đến 40°C điều kiện khí hậu miền Bắc nƣớc ta Về đặc điểm hình thái, chủng Sp2 dạng hình thoi (fusiform), tảo có cao độ xoắn chiều dài sợi (trichome) khác Chủng Sp6 có xoắn ốc thông thƣờng nhƣng chiều dài sợi khác nhau, đƣờng kính xoắn cao độ xoắn thấp Chủng Sp9 dạng sợi xoắn ốc mảnh, sợi dài, phù hợp với điều kiện khí hậu phƣơng thức ni nhƣ thu hoạch điều kiện miền Bắc nƣớc ta Việc xác định khối lƣợng khơ khơng có ý nghĩa mặt tính tốn trạng thái sinh lý, suất thực tế mà sở để điều chỉnh thành phần môi trƣờng sau tái sử dụng để bổ sung dinh dƣỡng đảm bảo cho tảo sinh trƣởng tốt qua lần thu hoạch 5.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn nên số phƣơng pháp đánh giá khả kháng khuẩn đánh giá kích thích tái tạo tế bào chƣa thực đƣợc Bên cạnh đó, nghiên cứu dừng mức quy mơ phịng thí nghiệm đề xuất thêm nghiên cứu phƣơng pháp chiết dung môi tách chiết khác, cải thiện hiệu suất tách chiết 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt Ngô Thùy Trâm (2009) Phát triển nuôi sinh khối tảo phịng thí nghiệm Trƣờng Đại học Cần Thơ Nguyen H.T., Nguyen T.C., Dang D.K & Dang H.P.H (1980) The first results of investigations and cultivation of Spirulina platensis in Vietman Rev Hydrobiol Bulg Acad Sci., Nguyen, D.B, T.T., Dang 2013 Microalgae biotechnology: promises and challenges Journal of Vietnam science and tevochnology Nguyen, D.B, T.T., Dang 2013 Microalgae biotechnology: promises and challenges Journal of Vietnam science and tevochnology, 8:11-14 Nguyen, H.T., Nguyen, T.C., Dang, D.K & Dang, H.P.H 1980 The first results of investigations and cultivation of Spirulina platensis in Vietman Rev Hydrobiol Bulg Acad Sci., 9.Okamura, H & Aoyama, I 1994 Interactive toxic effect and distribution of heavy metals inphytoplankton Toxicol & Water Quality, 9: 7–15 Tài liệu tham khảo tiếng anh Abdulqader G., Barsanti L and Tredici M.R (2000) Harvest of Arthrospira platensis from Lake Kossorom (Chad) and its household usage among the Kanembu Journal of Applied Phycology, 12: 493-498 Becker E.W (1994) Microalgae In Nutrition pp 196–249 Cambridge, Cambridge University Press Becker, E.W 1984 Nutritional properties of microalgal potentials and constraints In: Richmond A, Ed Handbook of microalgal mass culture CRC Press, Inc, Boca Ratón; pp 339- 408 Beeker W (2003) Microalgae in human and animal In Richmond A (ed) Handbook of microalgae culture, biotechnology and applied phycology Blackwell, Oxford, pp.312-352 47 C Cruz-Martínez, C K C Jesus Arthrospira (2015) Growth and composition of (Spirulina) platensis in a tubular photobioreactor using ammonium nitrate as the nitrogen source in a fed-batch process Braz J Chem Eng 32 (2) Choong-Jae Kim, Yun-Ho Jung, Gang-guk Choi, Yong-Ha Park, ChiYong Ahn and Hee-Mock Oh (2006) Optimization of Outdoor Cultivation of Spirulina platensis and Control of Contaminant Organisms Algae 21 (1): 133-139 Congming Lu; Avigad Vonshak (1999) Photoinhibition in outdoor Spirulina platensis cultures assessed by polyphasic chlorophyll fluorescence transients , 11 (4), 355–359 Danni Yuan, XuelingZhan, Mengyun Wang, Xianhui Wang, Weisong Feng, Yingchun Gong, QiangHu (2018) Biodiversity and distribution of microzooplankton in Spirulina (Arthrospira) platensis mass cultures throughout China Algal Research Volume 30, March 2018, Pages 38-49 Delrue Florian, Alaux Emilie, Moudjaoui, Lagia Gaignard, Clément Fleury, Gatien Perilhou, Amaury Richaud, Pierre Petitjean, Martin Sassi, Jean-Francois (2017) Optimization of Arthrospira platensis (Spirulina) Growth: From Laboratory Scale to Pilot Scale Fermentation 59 10.3390/fermentation3040059 10 Droop, M.R (1969) [Methods in Microbiology] Volume || Chapter XI Algae , (), 269–313 doi:10.1016/S0580-9517 (08)70510-5 11 Dangeard P (1940) Sur une algue bleue alimentaire pour l'homme: Arthrospira platensis (Nordstedt) Gomont Actes Soc Linn Boreaux Extr Procés-verbaux, 91: 39–41 12 Henrichkson, R (2009), Earth Food Spirulina, Ronore Enterprises, Inc., Hana, Maui, Hawaii: 80 – 121 13 Henrikson R Earth Food Spirulina California: Ronore Enterprises Inc; 1989 48 14 Huang, Hua-jun; Yuan, Xing-zhong; Zhu, Hui-na; Li, Hui; Liu, Yan; Wang, Xue-li; Zeng, Guang-ming (2013) Comparative studies of thermochemical liquefaction characteristics of microalgae, lignocellulosic biomass and sewage sludge Energy, 56 (), 52–60 doi:10.1016/j.energy.2013.04.065 15 John G.Day, Yingchun Gong, QiangHu (2017) Microzooplanktonic grazers – A potentially devastating threat to the commercial success of microalgal mass culture Algal Research Volume 27, November 2017, Pages 356-365 16 Mehboob Ahmed, Tanja C.W Moerdijk-Poortvliet, Anita Wijnholds, Lucas J Stal & Shahida Hasnain (2014) Isolation, characterization and localization of extracellular polymeric substances from the cyanobacterium Arthrospira platensis strain MMG-9, European Journal of Phycology, 49:2, 143-150 17 Nowicka-Krawczyk, P., Mühlsteinová, R & Hauer, T Detailed characterization commercially of grown the taxa Arthrospira into the type species separating new genus Limnospira (Cyanobacteria) Sci Rep 9, 694 (2019) 18 Sili, C., Torzillo, G., Vonshak, A (2012) Arthrospira (Spirulina) In: Whitton, B (eds) Ecology of Cyanobacteria II Springer, Dordrecht 19 Vonshak A (1997) Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell Biology and Biotechnologym Journal of Applied Phycology Volume 9, Issue 3, pp 295–296 20 Vonshak A (1997) Spirulina platensis (Arthrospira) In Physiology, Cell Biology and Biotechnology Basingstoke, Hants, London, UK, Taylor and Francis 21 Vonshak, A & Richmond, A 1988 Mass production of the blue-green alga Spirulina: an overview Biomass, 15: 233–247 49